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生物工程

Aplicaciones de la<em> En Vivo</em> Pruebas funcionales de la rata tibial anterior para la evaluación de la ingeniería tisular de reparación del músculo esquelético

Published: October 07, 2016
doi:
10.3791/54487
, , ,
1Department of Pathology,University of Virginia, 2Department of Biomedical Engineering,University of Virginia, 3Department of Orthopaedic Surgery,University of Virginia

Summary

We describe an in vivo protocol to measure dorsiflexion of the foot following stimulation of the peroneal nerve and contraction of the anterior crural compartment of the rat hindlimb. Such measurements are an indispensable translational tool for evaluating skeletal muscle pathology and tissue engineering approaches to muscle repair and regeneration.

Abstract

A pesar de la capacidad de regeneración de los músculos esqueléticos, los déficits funcionales y / o cosméticos permanentes (por ejemplo, pérdida de masa muscular volumétrica (VML) como resultado de una lesión traumática, enfermedad y varias enfermedades congénitas, genéticas y adquiridas son bastante comunes. La ingeniería de tejidos y tecnologías de medicina regenerativa tienen un enorme potencial para proporcionar una solución terapéutica. Sin embargo, la utilización de modelos animales biológicamente relevantes en combinación con las evaluaciones longitudinales de las medidas funcionales pertinentes son críticos para el desarrollo de mejores terapias regenerativas para el tratamiento de lesiones VML-similares. a este respecto, un sistema de palanca músculo comercial puede ser utilizado para medir la longitud, la tensión, la fuerza y parámetros de velocidad en el músculo esquelético. se utilizó este sistema, en combinación con una alta potencia, estimulador bi-fase, para medir la producción de fuerza in vivo en respuesta a la activación del compartimiento crural anterior de la extremidad posterior de la rata. Hemos Previormente utilizado este equipo para evaluar el impacto funcional de la lesión VML en el músculo tibial anterior (TA), así como el grado de recuperación funcional después del tratamiento del músculo TA lesionado con nuestra tecnología de reparación del músculo (TEMR) de ingeniería tisular. Para tales estudios, el pie izquierdo de una rata anestesiada se ancla firmemente a una placa para el pie unido a un servomotor, y el nervio peroneo común es estimulada por dos electrodos de aguja percutánea para provocar la contracción muscular y la flexión dorsal del pie. El nervio contracción muscular inducida por estimulación peroneal se mide en un rango de frecuencias de estimulación (1-200 Hz), para asegurar una meseta eventual en la producción de fuerza que permite una determinación precisa de la fuerza tetánica máxima. Además de la evaluación de la extensión de la lesión VML, así como el grado de recuperación funcional después del tratamiento, esta metodología se puede aplicar fácilmente para estudiar diversos aspectos de la fisiología del músculo y la fisiopatología. Tal enfoque shoULD ayudar en el desarrollo más racional de mejores terapias para la reparación y regeneración muscular.

Introduction

El músculo esquelético tiene una capacidad intrínseca notable para la reparación en respuesta a una lesión o enfermedad 1,2. Experimentalmente, la solidez de esta respuesta regenerativa ha sido bien documentado en modelos animales mediante el estudio de, por ejemplo, el curso temporal de daño del músculo esquelético, la reparación y la regeneración después de la aplicación de miotoxinas (por ejemplo, cardiotoxina) 3-7. Más específicamente, después de una amplia daño muscular inducida por cardiotoxina (38 a 67% de las fibras musculares 8), la regeneración es mediada por células satélite, las células madre residentes que maduran para convertirse en última instancia, fibras musculares funcionales 4,9-13. El resultado final es un aumento posterior a la regeneración funcional de daños sana, el tejido muscular productoras de fuerza 14-16. Aunque los detalles son mucho más allá del alcance de este informe, la base mecánica de la regeneración muscular refleja los acontecimientos cuidadosamente orquestados de numerosos tipos de células de varios linajes que utilizan canoniCal vías de señalización crítica tanto para el desarrollo de tejidos y morfogénesis 5,17-21. Es importante destacar que, la regeneración miotoxina inducida está activado por el hecho de que la matriz extracelular, la inervación neuronal y la perfusión de los vasos sanguíneos permanecen estructuralmente intactos después del daño del músculo cardiotoxina inducida 3,8,22. En marcado contraste, estas estructuras de tejido y componentes clave son, por definición, totalmente ausente en el contexto de lesión VML; donde la pérdida de Frank de tejido, debido a una variedad de causas, resulta en déficits funcionales y cosméticos permanentes 23-25.

Independientemente de los retos adicionales asociados con la reparación y regeneración muscular después de una lesión VML en comparación con el daño muscular miotoxina inducida, una mejor comprensión de la base mecánica de la regeneración del músculo esquelético y la reparación, en una variedad de contextos, sería bien servido por la utilización de biológicamente modelos animales relevantes en combinación con un longitudinalssessments de medidas funcionales pertinentes. Como se discute aquí, los estudios de la extremidad posterior de la rata proporcionan un excelente sistema modelo para este fin. Más específicamente, los músculos del compartimiento anterior crural (tibial anterior, extensor digital largo (EDL) y longus hallicus (HL)), que son responsables de la flexión dorsal del pie, se identifican y se manipulan fácilmente. Por otra parte, ellos son servidos por los principales vasos sanguíneos (ilíacas y ramas), y están inervados por los nervios (ciático y ramas, incluyendo peroneo) que recorre la longitud de la pierna 26-28. Como tal, se puede utilizar el modelo de extremidad posterior de la rata para evaluar directamente la función del músculo esquelético / patología en vivo, o para evaluar el impacto más indirecto de alteraciones relacionadas con la patología de los vasos sanguíneos o los nervios en función del músculo esquelético correspondiente. En cualquiera de los casos, la gravedad de la enfermedad, así como la eficacia del tratamiento se puede determinar como una función de la producción de fuerza muscular (par) y el pie correspondiente movement 29-34.

Idealmente, las medidas de fuerza se acompañan de los estudios histológicos y análisis de la expresión génica para evaluar más rigurosamente el estado estructural y molecular del músculo esquelético. histología e inmunohistoquímica básica, por ejemplo, son capaces de responder a preguntas sobre el tamaño muscular, la alineación de la fibra muscular, composición de la matriz extracelular, la ubicación de los núcleos, el número de células, y la localización de la proteína. La expresión de genes, a su vez, es necesaria para la identificación de los mecanismos moleculares que pueden influir / modular la madurez de las fibras musculares, estados de la enfermedad, y la actividad metabólica. Si bien estos métodos proporcionan información crucial, por lo general representan los extremos terminales, y lo más importante, que no abordan directamente la capacidad funcional del músculo esquelético, y por lo tanto, son correlativas en lugar de causal. Sin embargo, cuando se evalúan los estudios histológicos y análisis de expresión de genes en conjunto con measur funcionales, pues, los mecanismos de producción de fuerza y ​​la regeneración funcional se pueden identificar con mayor precisión.

A este respecto, la fuerza de la producción de las habilidades de un músculo se puede medir in vitro, in situ, o in vivo. Los tres enfoques tienen ventajas y limitaciones. En un experimento in vitro, por ejemplo, el músculo está completamente aislado y se retira del cuerpo del animal. Al eliminar las influencias de los vasos sanguíneos y nervios que suministran al músculo, la capacidad contráctil del tejido se puede determinar en un entorno exterior muy controlado 35. En la prueba muscular situ permite que el músculo a ser aislado, ya que con las preparaciones in vitro, sin embargo , la inervación y el suministro de sangre se mantienen intactos. El beneficio de la modelo experimental in situ es que permite que un músculo individual a estudiar, mientras que la inervación y suministro de sangre es mínimamente perturbados 36. En ambosin vitro y experimentos in situ, los tratamientos farmacológicos pueden aplicarse de forma más directa, sin tener que dar cuenta de los efectos de todo el tejido o el impacto del sistema circulatorio en las respuestas contráctiles medidos 37. Sin embargo, las pruebas de función in vivo, como se describe aquí, es la técnica menos invasiva para la evaluación de la función muscular en su entorno nativo 38, y se puede realizar repetidamente en el tiempo (es decir, longitudinalmente). Como tal, será el punto focal de la discusión a continuación.

En este sentido, los electrodos percutáneos insertados cerca del músculo de interés, o el nervio motor que lo sirve, proporcionan una señal eléctrica al músculo. Un transductor luego mide los cambios en la longitud o fuerza resultante en el músculo se activa según las indicaciones de un protocolo de software predeterminado, modificado para requisitos particulares. A partir de estos datos, las propiedades físicas del músculo se pueden determinar. Estos incluyen, porce-frecuencia, el tétanos máxima, fuerza-velocidad, la rigidez, la tensión de longitud, y la fatiga. la longitud del músculo o fuerza también puedan ser consideradas constante para que el músculo se contrae isométricamente o isotónica. Es importante destacar que estos protocolos experimentales se pueden realizar rápidamente, fácilmente repiten, y customized- todo mientras el animal se anestesió y con un período de recuperación de horas a días. Un solo animal puede sufrir en vigor vivo probar varias veces, lo que permite que los estudios longitudinales de modelos o evaluación de plataformas / tecnologías terapéuticas de la enfermedad.

Como se describe aquí, un sistema de palanca músculo comercial en conjunción con una alta potencia, estimulador bi-fase se utiliza para realizar las pruebas de la función muscular vivo para evaluar la contribución del músculo tibial anterior de la extremidad posterior de la rata para la dorsiflexión del pie a través de la estimulación de la el nervio peroneo. Hemos desarrollado un protocolo que está diseñado específicamente para evaluar la medicina regenerativa / tiN ú mero tecnologías de ingeniería para la reparación muscular después de una lesión traumática de la rata VML TA muscular. Se debería notar; la EDL y HL necesitan ser diseccionado fuera del compartimiento crural anterior con el fin de evaluar específicamente el músculo TA (que representan aproximadamente el 15-20% del par total tibial anterior medido después de la estimulación del nervio peroneo (Corona et al., 2013) ). Debido a que este enfoque proporciona un análisis longitudinal completa de músculo fisiología / función, se puede arrojar visión mecanicista importante en numerosos otros tipos de investigaciones fisiológicas, así como una variedad de enfermedades o áreas terapéuticas 39. Por ejemplo, la función del músculo in vivo es aplicable a los estudios de la fisiología del ejercicio, la isquemia / reperfusión investigación, miopatía, daño a los nervios / neuropatía y vasculopatía, sarcopenia, y distrofias musculares 40.

Protocol

Todos los animales fueron tratados con humanidad y todos los protocolos fueron aprobados por la Universidad de Virginia IACUC. 1. Preparación del equipo Asegúrese de que todos los equipos están conectados correctamente. Encienda el equipo, seguido por el estimulador bifásica de alta potencia y sistema de palanca de modo dual. En este momento, colocar al animal en la cámara de anestesia suministrada con isoflurano al 2%, y encienda el elemento de calentamiento para que la plataforma se calienta a 37 ° C. Coloque los electrodos en etanol al 70% para que la punta de politetrafluoroetileno (PTFE), recubierta se sumergen y serán desinfectados al instalar el dispositivo y el software. Busque y abra el software de control del sistema de palanca en el escritorio. NOTA: Este será el software necesario para realizar las pruebas funcionales. 2. Configuración de Software Una vez que el programa se abre (Figura 1A), cambiar el parámetros para Stim instantánea en el menú de configuración a los valores deseados. NOTA: En este protocolo, todos los parámetros se mantienen en los niveles preestablecidos con la excepción de "tiempo de pasada (s)", que se cambia a 180 seg (Figura 1B). Crear una carpeta de guardado automático en el menú de configuración. Localizar una ventana de tipo capaz etiqueta "Base de guardado automático". Introducir el nombre de la muestra, por ejemplo "Rat1-date-punto de tiempo". Directamente a la izquierda de la ventana de tipo capaz de "Copia de seguridad automática de la base", haga clic en la casilla "Activar guardado automático." En la parte superior de la pantalla de control, seleccione "secuenciador". Una nueva ventana se abrirá. En la parte inferior de la nueva ventana, seleccione "Secuencia abierta". Una nueva ventana se abrirá. Seleccione la secuencia de prefabricados y haga clic en OK. Una lista de protocolos con parámetros de la secuencia, con la frecuencia, la duración de los estímulos, y el tiempo de descanso se desarrollará en la ventana de llamada: Editor de secuencia (Figura 1C). Haga clic en "Cargar secuencia" ->:34; cerrar ventana ". Para ver la corriente en tiempo real y la estimulación, seleccione "Archivo" -> "Live Data Monitor". Una nueva ventana se abrirá. En la nueva ventana de datos en vivo, pantalla de formato para la prueba mediante el uso de la función de autoescala, o introducir manualmente los valores máximo y mínimo de los valores de y aparece en la pantalla. 3. animal set-up NOTA: Todas las medidas de fuerza son las de un niño de 11 semanas de edad ratas Lewis. Existe una correlación lineal entre la masa muscular y la producción de fuerza (en Newtons). Por lo tanto, como la edad de los aumentos de rata, los valores de las fuerzas producidas por la pierna deben aumentar también. Asegúrese de que el animal se encuentra en el plano correcto de la anestesia antes de retirarlo de la cámara de la anestesia. eliminar por completo todo el pelo en la cara lateral entre el tobillo y la pelvis de la pierna experimental utilizando una cortadora de cabello eléctrica. NOTA: Se logra el plano de la anestesia adecuada cuando el i animaless no responde a una pizca dedo del pie. Es necesario seguir los lineamientos que al respecto por el Comité de Cuidado de Animales y el empleo de cada institución. Colocar el animal en posición supina, lo que garantiza la nariz del animal es segura en el cono de la nariz anestesia por lo que permanece en la profundidad de la anestesia suficiente. Regular la posición del aparato de pedal por tres mandos independientes (Figura 2). Mediante los mandos (A y B) para ajustar el pedal de pie, coloque el aparato de pedal en su posición más a la izquierda y más baja, respectivamente. Esto permitirá que el posicionamiento correcto del pie del animal, mientras que deja espacio para las manipulaciones posteriores. En esta posición, utilice el mando a la izquierda de la pista para mover el aparato ya sea hacia o lejos de la experimentador manera que la pata de los animales se encuentra en un plano recto. Limpiar la pierna con tres cambios de yodo y alcohol. El yodo debe permanecer en la pierna durante 30 segundos. Ajuste del animal o de la plataforma(Figura 2A, D) de modo que la pierna extendida asegura el contacto completo entre la suela del pie y el pedal. El uso de cinta médica, asegurar el pie del animal contra la placa de pie (Figura 2D). Es crucial que el talón está a ras contra la parte inferior del pedal y todo el pie es plano y no desalojar de la placa durante la prueba. Busque el mecanismo de sujeción para estabilizar la pierna. Empuje la clavija de estabilización en la medida suficiente para reducir el movimiento de la pierna y fijarla en su lugar girando la llave Allen. En esta posición, utilice el mando C para mover el aparato, ya sea hacia o lejos de el experimentador para que el tobillo, la tibia y fémur mentira en una línea recta (Figura 2C). Asegúrese de que la pierna es paralelo con el pedal de pie. Hacer los ajustes en el curso y perillas finas se encuentran en la parte posterior del aparato, para mover lentamente el tobillo para que el pie y la tibia están en una posición de 90 °. continue para mover la pierna por lo que el fémur y la tibia se encuentran en un ángulo perpendicular de 90 grados (Figura 2B). En este punto, el animal está listo para los electrodos. 4. La colocación de los electrodos Activar "Stim inmediata" haciendo clic en el botón naranja marcado con "inmediata Stim". Coloque ambos electrodos superficialmente en el extremo proximal del músculo tibial anterior y mover las puntas de los electrodos alrededor hasta que los picos se observan en el monitor en vivo. Idealmente, los picos debe estar alrededor de 0,4 N. NOTA: Los electrodos deben ser colocados adyacentes y ortogonal al plano de nervio peroneo, que a su vez, se extiende lateralmente desde la rodilla y perpendicular a la tibia. Inserte una aguja lo suficientemente lejos de la dermis Pierce, y apenas en la capa muscular. Mueva el otro electrodo alrededor hasta que los picos se ven en el monitor en vivo alrededor de 0,6 N. agujas de inserción y la abrazadera en su lugar con una abrazadera de pasatiempo o cinta médica. UNJUSTE ajustes gruesos y finos para encontrar la producción de fuerza máxima. En el estimulador bifásica de alta potencia, habrá dos botones en el centro. Uno tiene la etiqueta "RANGO" y el otro "Ajustar". Gire el botón de "RANGE" para el amperaje máximo deseado. NOTA: Los picos aumentarán lentamente en magnitud y la intensidad de corriente máxima se determina como el nivel en el que tres estimulaciones consecutivos resultan en respuestas contráctiles idénticos. Resistirse a girar el amperaje mayor de lo necesario; el amperaje máximo estimulará todo el músculo se contraiga, pero cualquier corriente más alta resultará en el reclutamiento de los músculos vecinos y potencialmente antagonistas también. Gire el botón de "AJUSTE" para establecer el porcentaje de la "RANGO" que será utilizado para estimular el músculo. En este punto, la fuerza debe leer alrededor de 1,0 N. Esto puede requerir un aumento o una disminución de la corriente. Vuelva a comprobar los electrodos para asegurarse de que están seguros. DetenerStim instantánea. En la ventana "Datos en vivo", haga clic en "Iniciar secuencia." Continuará monitoreando las curvas volviendo a la pantalla de control, y haciendo clic en el botón "Análisis" situado encima del botón naranja "inmediata Stim". La curva tetánica debe comenzar a tomar forma alrededor de la estimulación de 60 Hz. 5. Acabado Estimulación y limpieza Una vez finalizada la secuencia, retire y limpie los electrodos con alcohol al 70%. Colocar los electrodos en las cubiertas. Afloje la abrazadera de rodilla y desactivar la anestesia. Retire el animal del gas de anestesia y colocar al animal en decúbito prono, todavía sobre el cojín eléctrico. Mantener la rata en el 100% de O2 durante unos minutos después de que el gas isoflurano se ha apagado para mantener la rata oxigenada. El animal puede mover al principio, pero no devuelven los animales de vuelta a la jaula hasta que el animal recupera la consciencia. Si se nota el dolor musculardespués de su recuperación, una dosis de AINE se debe dar según lo especificado por el comité de cuidado de los animales. Apague todos los equipos mencionados en el paso 1.2, cierre el software, y continuar con el análisis de datos. Limpie la plataforma y el pie del pedal. Análisis 6. Datos NOTA: Los análisis de los datos se lleva a cabo para adaptarse a una secuencia diseñada por este laboratorio y de acuerdo con los protocolos de laboratorio. valores de análisis, puntos de datos de importancia, y otros aspectos del procedimiento cambiará dependiendo de la intención del usuario. Abra el software de análisis de datos. Haga clic en el menú de alto rendimiento para permitir el análisis de varios archivos de datos (muestras) a la vez. Seleccione "Fuerza Frecuencia" Análisis. Haga clic en el botón "Pick archivos" y abrir tantos archivos de datos guardados como se desee. Seleccione "Manual" en el cuadro Método de Colocación del cursor. NOTA: Esto permitirá al usuario analizar la totalidad de la DATun plazo de una marca de tiempo deseado, al contrario que el programa seleccionará automáticamente la ubicación de análisis. Cambie el valor de marca de hora de finalización del cursor a 2. Haga clic en el botón "Analizar" (Figura 1D). Para guardar la tabla y analizar los datos mediante una hoja de cálculo, haga clic en "Guardar tabla botón para ACSII. Esto guardará el archivo y se puede abrir con una hoja de cálculo en un momento posterior. Abra el archivo de datos guardado en la hoja de cálculo. Crear una columna adicional denominada "máximo absoluto", y determinar la diferencia entre los valores máximos para cada muestra de referencia y. Esto proporcionará la fuerza máxima total producida en cada frecuencia. La determinación del par, se multiplica cada valor de la fuerza por parte de la longitud del brazo de palanca. Nota: en este caso, que estaría representada por la longitud del pie del animal. Este protocolo utiliza el valor medio determinado experimentalmente de 30 mm. El usuario ha determinado ahora los valores para la matorque ximo producido en cada frecuencia. Representa gráficamente estos valores como una curva de frecuencia de par, o, el par máximo producido por el animal a través de todas las frecuencias de estimulación. NOTA: Este puede ser identificado y utilizado como un único punto de comparación entre muestras.

Representative Results

La curva tetánica se puede utilizar para distinguir resultados óptimos de los resultados sub-óptimos. Esta curva por lo general comienza a formar a una frecuencia de 60 Hz. El factor clave para obtener buenos resultados es la capacidad de estimular el músculo de manera que produce su fuerza máxima y mantiene que la fuerza durante el tétanos. La curva ideal debe tener una fase de expansión ininterrumpida, agudo, vertical en el momento de la estimulación, seguida de una fase de meseta plana con oscilaciones mínimas, y un, agudo período de disminución verticales ininterrumpida en la terminación de la estimulación (Figura 4). Las desviaciones de la curva ideal indicios de que se fatiga el músculo (Figura 5D) o que el músculo no está siendo estimulado adecuadamente para producir la fuerza máxima (Figura 5B – C). Este último resulta generalmente de colocación de los electrodos incorrecta conduce a la insuficiencia de contratación máxima de las fibras musculares durante STIMULAción. Una característica distintiva que le permite al investigador determinar si una curva no ideal es el resultado de la colocación de los electrodos incorrecta o cambios patológicos en el músculo es si o no la curva tetánica es completa (fusionada) o incompleta (no fundido). An, curva tetánica incompleta no fusionado indica que los electrodos están fuera de lugar, lo que resulta en el músculo no experimentar una contracción máxima. Un ejemplo de un cambio patológico en el músculo se puede observar como una disminución de contracción máxima en comparación con el control, o una respuesta contráctil que fatigas más rápidamente. Los tres tipos diferentes de los picos obtenidos en el transcurso de este procedimiento representan diferentes posiciones de los electrodos y de la pierna y se puede ver en la Figura 3. Los primeros picos será de alrededor de 0,4 N y se producen cuando la colocación de los electrodos correcto se determina superficialmente en la piel (Figura 3A). El segundo conjunto de picos tiene hamplitud igher, generalmente alrededor de 0.5-0.6N (Figura 3B) y se producen cuando los electrodos penetran a través de la dermis. Después de estos se obtienen, la pierna y el pie se ajustan para maximizar la producción de fuerza, que se consigue cuando la amplitud de pico aumenta a aproximadamente 1 N o superior (Figura 3C). En este punto, instantáneo Stim se puede apagar y la secuencia puede comenzar. Estas directrices garantizan resultados exactos y reproducibles y puestos de control son claves a lo largo del protocolo. Los resultados finales pueden ser representados de diferentes maneras dependiendo de la información que el usuario extrae de la prueba de la fuerza y ​​el diseño experimental. En este protocolo, la fuerza máxima se mide a través de todas las frecuencias de estimulación, sin embargo otros puntos de datos pueden ser importantes para un investigador o aplicación particular. Un ejemplo es la frecuencia de estimulación en el que la curva tetánica comienza a tomar forma. Tos datos se pueden comparar con otros resultados obtenidos de un experimento anterior o posterior en el mismo animal, o para las comparaciones entre los diferentes grupos de tratamiento. la producción de fuerza se normalice de masa corporal para calcular la fuerza isométrica y proporcionar una evaluación más objetiva de los efectos de la edad sobre la contracción máxima observada. Aunque los animales de diferente peso corporal y la edad producirán diferentes fuerzas máximas, la forma de la curva tetánica debe ser consistente entre todos los grupos cuando el procedimiento se realiza correctamente. Figura 1: Descripción general del control del sistema de palanca y software de análisis de datos para el análisis (A) Descripción general del software de control al abrir el programa.. (B) los parámetros "Stim instantánea." (C) Ejemplo de secuencia para la estimulación fuerza-frecuencia. (D </strong>) Los datos representativos de un análisis de frecuencia de fuerza de alto rendimiento en el software de análisis. Cabe señalar que el procedimiento de análisis de secuencia de ejemplo y datos son específicos de este protocolo y no representa toda la gama de secuencias y salidas que son proporcionadas por este software. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Aspectos críticos para el posicionamiento de la rata y la colocación del pie en el aparato (A) La rata está en una posición supina con el pie izquierdo firmemente unido a la placa del pie.. Los ángulos rectos realizados por el pie, pierna, muslo y están rodeados. (B) El ángulo derecho creado por el tobillo está resaltado. (C) La pierna debe estar alineados en un plano recto del pie a la carrocería. (D) La colocación de los electrodos es paralela y perpendicular al plano del nervio peroneo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Picos representativos que demuestra la importancia de la correcta colocación de electrodos para la máxima producción de fuerza (A) de línea de base de pico respuestas tetánicas observados con electrodos colocados demasiado superficial.. (B) los picos más grandes con electrodos insertados en el lugar correcto. (C) La transición de grandes picos de señalización correcta colocación de los electrodos a la amplitud de pico de pre-secuencia óptima como las posiciones de las piernas y de los pies se ajustan de manera óptima./ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4:. La curva tetánica óptima a 100 Hz esta curva de aumentos y disminuciones fuertemente y tiene una fase de meseta plana. Este ejemplo indica la colocación correcta de los electrodos y la estimulación de fuerza máxima. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5:. Ejemplos representativos de curvas tetánicas sub-óptimo obtenido a 100 Hz (A) A raíz de la relajación, esta curva cae por debajo de la línea de base. Esto es indicativo de la estimulaciónde los antagonistas. (B – D) Estos gráficos son el resultado de la inadecuada colocación de los electrodos y el reclutamiento desigual de las fibras musculares. Las fases de meseta demuestran grandes oscilaciones (B), una pendiente hacia arriba (C), o una pendiente hacia abajo (D). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Este protocolo se muestra un método relativamente sencillo para realizar la prueba de la función muscular en vivo en el compartimiento crural anterior de la extremidad posterior de la rata. Otras formas de la función del músculo, incluyendo ex vivo e in situ protocolos, también pueden proporcionar información importante acerca de la fisiología del músculo. Sin embargo, la importancia de las pruebas de función in vivo reside en su naturaleza no invasiva, y el hecho de que recapitula con mayor precisión los mecanismos endógenos de la estimulación muscular. Por tanto ex vivo y ensayos in situ, el tendón y / o músculo están expuestos, y por lo tanto, debe mantenerse húmedo o sumergidas 41,42. Ensayo in vivo elimina variables de confusión del trauma y la inflamación que pueden ser causados por los procedimientos quirúrgicos necesarios en la función del músculo situ; esto es especialmente importante si el objetivo del experimento es investigar los procesos inflamatorios y celulares <shasta> 43. Por otra parte, las pruebas in vivo requiere poca habilidad quirúrgica como el músculo no está aislada de su entorno y no requiere nudos precisas para reducir el deslizamiento del músculo / tendón (como es el caso de in situ o ensayo ex vivo) 41. Además, con suficiente práctica, la velocidad de la colocación correcta de los electrodos y la capacidad de hacer ajustes rápidamente para lograr la producción de fuerza máxima del músculo se asegurará de que la finalización del protocolo es rápida y reproducible- tanto en los animales y en los distintos usuarios del mismo equipo 39 . Es beneficioso para comenzar con una evaluación de todo el componente crural anterior como se ilustra, antes de la escisión de los músculos sinérgicos menos accesibles (EDL y HL) para una investigación más directa del músculo TA. Con este enfoque, se puede alcanzar bastante rápidamente dominio de la técnica. Si bien el procedimiento descrito en este documento demuestra y pone de relieve la utilidad de una fuerza FRecuencia protocolo para inducir el tétanos y determinar la fuerza máxima producida por un músculo, los usuarios deben determinar el tipo (s) de la prueba funcional que mejor informar a su experimento (s) específico y objetivos de investigación.

Hay varios pasos críticos que deben realizarse con cuidado a fin de garantizar óptimas y reproducibles los resultados experimentales, es decir, la producción consistente fuerza máxima por el músculo a una variedad de parámetros de estimulación. Varias de las características clave se resumen en la Figura 2. Sin embargo, la colocación y la estabilidad del electrodo de estimulación adecuada es un prerrequisito absoluto para la estimulación máxima reproducible del nervio peroneo. A este respecto, los electrodos deben ser colocados superficialmente. Es decir, si la colocación de los electrodos es demasiado profunda, se corre el riesgo de estimulación eléctrica directa de los músculos antagonistas, disminuyendo así la magnitud de la respuesta contráctil observado del compartimiento anterior crural. Además, eldos electrodos deben ser colocados en tan cerca proximidad entre sí como sea posible para reducir la resistencia eléctrica de la piel circundante y el tejido conectivo. En general, el posicionamiento del electrodo cerca de la rodilla y medial de la pierna del rastreo directamente el borde de la tibial anterior a donde se encuentra con el gastrocnemio a menudo produce la producción de fuerza adecuada. Esto también asegura que los electrodos se colocan adyacentes y ortogonal al plano del nervio peroneo, que a su vez, se extiende perpendicular a la tibia y lateralmente por la pierna de la rodilla. Sin embargo, la variabilidad natural en la anatomía entre los animales requiere una vigilancia constante para garantizar que la colocación de electrodos está optimizado sobre la base de caso por caso. Como tal, hay un cierto nivel de ensayo y error asociado con la colocación de electrodos que está significativamente disminuido por la experiencia del usuario. El número de veces que los electrodos perforan la piel debe reducirse al mínimo para reducir la hinchazón y la inflamación, lo que me disminuyela producción de fuerza asured. Esto depende de donde las agujas se colocan inicialmente, pero se recomienda para mover las agujas de dos veces o menos en particular en la zona alrededor de la rótula. Por último, una vez que los electrodos se colocan en la pierna del animal, ajustes menores se pueden hacer para el posicionamiento de la pierna y la corriente suministrada a través de los electrodos. Esto se debe hacer mientras se monitoriza simultáneamente la fuerza producida a partir de un único tic. Además de colocación de los electrodos, los ajustes pueden hacerse también a la tensión suministrada a través de los electrodos. Sin embargo, en la configuración que se describe aquí, es importante tener cuidado al aumento de la tensión como una manera de aumentar la producción de fuerza debido a que el aumento de la tensión va a estimular los nervios que inervan los músculos antagonistas.

Hay tres problemas técnicos clave que deben ser monitoreados para asegurar que la colocación de los electrodos sigue siendo óptima. En primer lugar, el pie del animal anestesiado debe ser seguraanclado en el aparato de pedal de pie, que mide la producción de fuerza muscular (Figura 2). Si el pie no está anclado de forma segura, la verdadera fuerza producida por el músculo puede ser traducido de forma incompleta al transductor de fuerza. Fijación del pie inestable también introduce el riesgo de perder la colocación óptima de los electrodos como el movimiento más allá de la contracción del músculo normal (es decir, el pie se mueve lejos de la placa para el pie) puede causar el desplazamiento de los electrodos, desde su posición superficial o desalojar completamente. Cualquiera de los casos disminuirá la fuerza medida. En segundo lugar, el cuerpo del animal debe estar completamente en posición supina y alineadas en un plano recto (Figura 2). La colocación correcta del cuerpo animales impide ligeros movimientos de la pierna debido a la respiración, y también minimiza la torsión de la pierna y de la pelvis, lo que permite una mejor colocación y el contacto continuo de los electrodos de estimulación. En tercer lugar, el posicionamiento correcto y de anclaje de la rodilla es critical para asegurar que la pierna se mantiene estable, y por lo tanto, ayuda a estabilizar la colocación óptima de los electrodos de estimulación para permitir la activación constante del nervio peroneo.

Hay algunos puntos adicionales que merecen ser destacadas. En primer lugar, el sistema de palanca músculo comercial está diseñado para realizar las pruebas en la pierna izquierda, sin embargo, la configuración se puede modificar para realizar pruebas en la pierna derecha así. En segundo lugar, los sistemas de palanca musculares pueden ser elegidos en función del tamaño del animal, por lo que los usuarios deben asegurarse de que la plataforma utilizada es adecuada para medir y apoyar a la fuerza producida por el modelo animal de elección. músculos comprobables para la plataforma de equipo se limitan a los que inducen la extensión plantar o dorsiflexión del pie. En tercer lugar, de nuevo hay que destacar que la colocación de electrodos puede ser difícil y requiere paciencia y práctica para dominar la técnica. Los electrodos también se embotan rápidamente con el uso regular, por lo que es útil tener varias piezas de sets por una vez, se hace difícil para pinchar la piel superficialmente. En tercer lugar, el protocolo descrito en este informe utiliza secuencias de estimulación específicos y procedimientos de análisis de datos. El software de análisis de palanca muscular software de control del sistema y de los datos y los datos que presta puede responder a muchas otras preguntas experimentales y, por lo tanto, su utilidad se extiende más allá de lo que se describe en este documento. Como tal, se anima a los usuarios a explorar más allá de los límites del protocolo (s) de software presentado en este documento. A pesar de estas limitaciones de poca importancia, pruebas de la función muscular en vivo es un enfoque poderoso para determinar la capacidad de la salud y contráctil del músculo esquelético, ya que es mínimamente invasiva y se puede realizar en múltiples ocasiones, durante un período de tiempo prolongado, en el mismo animal. En pocas palabras, este tipo de utilidad pueda reparar el sistema hace particularmente hábil para probar los efectos de nuevas terapias para lesiones músculo esquelético o enfermedad en la extremidad posterior de la rata.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to thank Dr. Hannah Baker for her extensive work in optimizing this procedure.

Materials

Isothesia Henry Schein Animal Health 05260-04-04
Isoflurane Vaporizer-Funnel Fill Vet Equip 911103
Inlet Adaptor for Vaporizer Vet Equip 911124
Outlet Adaptor for Vaporizer Vet Equip 911125
Tabletop Anaesthesia Machine Vet Equip 901801
Compressed oxygen gas Praxair N/A
VaporGuard Activated Charcoal Filter Vet Equip 931401
T/Pump Professional water heater Stryker N/A set on Continuous Therapy Time at 38/100 for temperature
Transpore Surgical Tape 3M 1527S-1 rip in half to make thinner strips
A5 Golden animal clippers Oster 078005-050-002
Povidone-Iodine Solution Aplicare 82-227K
Alcohol Swabs
200 proof Ethanol Decon labs diluted to 70% with deionized water
cotton tipped applicators Puritan 836-WC
Teflon coated electrodes-Monopolar needle electrode Chalgren Enterprises 111-725-24TP
servomotor Cambridge Technology Model 6650LR
Dual Mode Lever System Aurora Scientific Inc Model 305C-LR-FP contact manufacturer to order
Signal Interface Aurora Scientific Inc Model 604A
High-Power, Bi-Phase Stimulator Aurora Scientific Inc Model 701C
Data analysis software Aurora Scientific Inc DMAv5.110 software
Muscle lever system control software Aurora Scientific Inc DMCv5.400 software
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References

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In Vivo Functional TestingRat Tibialis AnteriorMuscle Function TestingMuscle Damage And RecoveryMuscle RegenerationMuscle Mass And ForceAnesthesiaRat PositioningElectrode PlacementFoot PedalLeg Stabilization

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Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair. J. Vis. Exp. (116), e54487, doi:10.3791/54487 (2016).
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