的快速方法新颖的RNA结合蛋白隔离

RNA结合蛋白（限制性商业惯例）表示S的约10％ 酵母蛋白^1,2和哺乳动物蛋白质^3-5的约15％。它们被牵连在许多细胞过程如mRNA转录后加工和调节，翻译，核糖体合成，tRNA的氨酰化和修饰，染色质重塑，以及更多。限制性商业做法的一个重要子群mRNA的结合蛋白^{（mRNPs）6,7。} mRNA中的成熟的过程中，不同的限制性商业惯例结合转录并介导其核加工，出口出来的细胞核，细胞定位，翻译和降解^6-8。因此，不同的组在任何时间点绑定到特定的成绩单的限制性商业惯例决定了它的加工和最终的命运。

与基因相关的限制性商业惯例的识别可以显著提高我们的基本的转录后调控过程的了解。不同遗传，微观，生化和生物信息学方法已经用于鉴定参与mRNA调节（在^9-11中综述）蛋白。然而，只有少数的这些方法能够与特定的靶mRNA相关的蛋白质的鉴定。值得注意的是，酵母三杂交系统（Y3H），它利用的利益为诱饵mRNA的筛选在酵母细胞中的表达文库。阳性克隆通常是通过培养来选择或记者表达^12-14观察。该方法的主要优点是大量可在细胞环境和测量RNA的蛋白质相互作用的强度的能力被扫描的蛋白质。缺点包括相对大量的由于非特异性结合假阳性结果，而对于由于假阴性结果，部分地融合蛋白猎物或诱饵的RNA的错折叠的高电位。

遗传方式的替代方法是亲和力洁净工作台其相关的蛋白的RNA的阳离子。聚A含的mRNA可以通过使用寡聚dT柱进行分离，并且它们的相关的蛋白质通过质谱法进行检测。的RNA-蛋白质相互作用是通过交联的细胞环境，这使得短程共价键是保守的。使用寡聚dT柱产生了与任何含有聚A-mRNA的^3,5,15相关的整个蛋白质组的全局视图。但是，这并不能提供与特定的mRNA相关蛋白质的列表。很少方法可用来实现这种识别。该对方法需要核酸与互补性与靶mRNA ^16,17的转染。核酸也附连到的肽，其允许交联到限制性商业惯例中紧挨着的相互作用位点。交联后，RBP肽 – 核酸可以分离并进行蛋白质组分析。最近，基于适体的方法是成功地应用到从哺乳动物细胞系¹⁸中提取。用链霉改善的亲和力的RNA适体的开发和融合于（在这种情况下，富含AU的元件（ARE））感兴趣的序列。适体 – ARE的RNA附着在链霉抗珠粒并用细胞裂解物混合。与该ARE序列相关联的蛋白质纯化，并通过质谱（MS）来识别。虽然这种方法检测的蜂窝设置（ 即 ， 在体外 ）外面发生关联，则很可能在将来被修改，以便引入适体到基因组中，从而使蛋白质与表达相关的隔离，而在细胞环境（ 即 体内 ）。在酵母中，其中的遗传操作已经非常成熟，快速的方法（以教授杰夫·Gerst的实验室开发）提供了在体内协会¹⁹的观点。快速融合了专用性强的MS2外壳蛋白的结合（MS2-CP）的MS2 RNA序列，和的链霉抗结合结构域（SBP）到链霉偶联珠。这使MS2标记mRNA的高效净化通过链霉珠。此外，的MS2环12份表达式允许多达六个MS2-CP的同时结合到RNA和提高其隔离的效率。因此该协议建议，使新颖的mRNA相关蛋白的鉴定一次洗脱的样品通过质谱法进行蛋白组学分析。

我们最近利用快速识别与酵母PMP1 mRNA的²⁰相关联的新的蛋白质。PMP1 mRNA的先前显示与ER膜相关联，并且其3'非翻译区（UTR）被认为是在此关联²¹的主要决定因素。因此，结合PMP1 3'非编码区限制性商业惯例有可能在其定位可发挥重要的作用。快速接着液相色谱的y质谱/质谱（LC-MS / MS）导致与PMP1 ²⁰相互作用的许多新的蛋白质的鉴定。在此，我们提供的快速方法的详细的协议，做需要的重要的控制，这可能提高产量和特异性的技术技巧。