Procedimiento para Adaptive Laboratory Evolución de microorganismos utilizando un quimiostato
Summary
A continuación, se presenta un protocolo para obtener la evolución adaptativa de laboratorio de microorganismos bajo condiciones de cultivo utilizando quimiostato. Además, se discute el análisis genómico de la cepa evolucionado.
Abstract
Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.
Introduction
Los microorganismos pueden sobrevivir y adaptarse a diversos ambientes. En situaciones de estrés severo, la adaptación puede ocurrir a través de la adquisición de fenotipos beneficiosos por mutaciones genómicas al azar y la selección positiva posterior 1-3. Por lo tanto, las células microbianas se pueden adaptar cambiando metabólica o las redes de regulación para un crecimiento óptimo, que se denomina "evolución adaptativa". microbianas tendencias recientes importantes, tales como brotes de superbacterias y la aparición de cepas microbianas resistentes, están muy estrechamente relacionados con la evolución adaptativa en condiciones de estrés. En condiciones de laboratorio definidos, somos capaces de estudiar los mecanismos de la evolución molecular e incluso controlar la dirección de la evolución microbiana para diversas aplicaciones. A diferencia de los organismos multicelulares, los organismos unicelulares son muy adecuadas para la evolución adaptativa de laboratorio (ALE) por las siguientes razones: se regeneran rápidamente, mantienen grandes poblaciones, y es fácil de crear y mantener homogeneous entornos. En combinación con los recientes avances en las técnicas de secuenciación de ADN y las tecnologías de alto rendimiento, ALE permite la observación directa de los cambios genómicos que conducen a cambios en la regulación sistémicos. dinámica mutacional y una diversidad de la población también son observables. Estrategias de ingeniería genética se pueden determinar a partir del análisis de las cepas ALE 4,5.
Cultura quimiostato es un método utilizado para obtener células en estado de equilibrio y aumentar la productividad en los procesos de fermentación de 6. se añade medio fresco y el caldo de cultivo se recoge durante el proceso (el último incluye medio y biomasa). Cultura quimiostato a largo plazo, sin embargo, cambia la productividad de estado estacionario de la cultura y provoca la acumulación de mutaciones espontáneas y la selección durante el cultivo (Figura 1a). Bajo diferentes presiones de selección (estrés), la acumulación de mutaciones es mayor. Un aumento gradual de la tensión en un largo plazo chemostat prevé una selección continua de las mutaciones que trabajan contra los factores de estrés dadas, tales como temperatura, pH, presión osmótica, el hambre de nutrientes, la oxidación, los productos finales tóxicos, etc. transferencia de colonias a partir de un medio sólido y la transferencia en serie de un medio líquido (repetido cultivo por lotes) también permiten a los investigadores obtener microorganismos evolucionados (Figura 1B y 1C). Aunque la cultura chemostat requiere métodos complicados, la piscina de la diversidad (número de repeticiones y tamaño de la población) es mayor que la obtenida por transferencia de colonias y las técnicas de transferencia en serie. La exposición al estrés estable a las células individuales y la disminución de la variación en el estado celular durante el cultivo en quimiostato (estado estacionario) son otros beneficios de ALE comparación con las técnicas basadas en el cultivo por lotes. ALE inducida por estrés de Escherichia coli sometidos a altas condiciones de succinato se introduce en este artículo.
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Figura 1: Métodos de laboratorio de la evolución adaptativa (A) Chemostat;. (B) la transferencia en serie; (C) la transferencia de la colonia. Las máximas figuras ilustran el concepto de los métodos para ALE, y las cifras de abajo ilustran el número de células que crecieron durante la ALE. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los microorganismos son capaces de adaptarse a casi todos los entornos debido a su rápida tasa de crecimiento y la diversidad genética. la evolución adaptativa de laboratorio permite a los microorganismos a evolucionar en condiciones diseñadas, lo que proporciona una manera de seleccionar los organismos individuales que albergan mutaciones espontáneas que son beneficiosos en las condiciones dadas.
La técnica quimiostato es más robusta para lograr la evolución impulsada artificialment…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).
Materials
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | – | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | – | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
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