נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש Chemostat
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשיג אבולוצית מעבדה אדפטיבית של מיקרואורגניזמים בתנאים באמצעות תרבות chemostat. כמו כן, ניתוח גנטי של הזן התפתח נדון.
Abstract
Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.
Introduction
מיקרואורגניזמים יכול לשרוד ולהסתגל סביבות מגוונות. תחת לחץ חמור, הסתגלות יכולה להתרחש באמצעות רכישת פנוטיפים מועילים ידי מוטציות גנומי אקראיות סלקציה חיובית לאחר 1-3. לכן, תאים מיקרוביאליים יכול להתאים על ידי שינוי מטבולי או רשתות רגולטוריות לצמיחה אופטימלית, אשר נקרא "התפתחות מסתגלת". נטיות חיידקים חשובות אחרונות, כגון התפרצויות של חיידקים לבין ההתרחשות של זנים של חיידקים חזקים, הם קרובים מאוד אדפטיבית אבולוציה בתנאים מלחיצים. בתנאי מעבדה מוגדרים, אנו מסוגלים ללמוד את המכניזם של אבולוציה מולקולרית ואף לשלוט על הכיוון של אבולוצית חיידקים עבור יישומים שונים. בניגוד יצורים רב-תאיים, חד תאיים אורגניזמים מתאימים גם לאבולוציה מעבדה אדפטיבית (ALE) מהסיבות הבאות: הם להתחדש במהירות, הם שומרים על אוכלוסיות גדולות, וזה קל ליצור ולתחזק Homסביבות ogeneous. בשילוב עם התקדמות טכניקות רצפי DNA וטכנולוגיות תפוקה גבוהה, ALE מאפשר תצפית הישירה של שינויים גנומית להוביל שינויים רגולטוריים מערכתיים. דינמיקה מוטציוני ומגוון מהאוכלוסייה הם גם נצפה. אסטרטגיות הנדסה גנטית ניתן לקבוע מניתוח זני ALE 4,5.
תרבות Chemostat היא שיטה המשמשת כדי להשיג תאים יציבים ולהגדיל את הפרודוקטיביות תהליכי תסיסה 6. מדיום חדש מתווסף מרק התרבות שנקטף במהלך התהליך (האחרון כולל בינוניות ביומסה). לתרבות לטווח ארוך chemostat, לעומת זאת, משנה את הפרודוקטיביות היציב של התרבות ומביא על הצטברות של מוטציות ספונטניות ובחירת במהלך התרבות (איור 1 א). תחת לחץ ברירה שונה (לחצים), ההצטברות של מוטציות היא משופרת. עלייה הדרגתית של הלחץ לטווח ארוך chemostat מספק מבחר רציף של מוטציות שפועלות נגד גורמי הלחץ הנתונים, כגון טמפרטורה, pH, לחץ האוסמוטי, הרעבה מזינה, חמצון, מוצרי קצה רעילים, וכו 'העברת קולוני מתוך בינוני מוצק והעברה סידורית של מדיום נוזלי (חזר תרבות אצווה) גם לאפשר לחוקרים לקבל מיקרואורגניזמים התפתחו (איור 1b ו 1c). למרות שתרבות chemostat דורשת שיטות מסובכות, הברכה של גיוון (מספר חזרות וגודל אוכלוסייה) הוא גבוהה יותר מזה שהושג באמצעות עברת מושבה וטכניקות העברת סדרתי. חשיפת המתח היציבה תאים בודדים וירידת וריאציה במדינת הסלולר במהלך תרבות chemostat (מצב יציב) יתרונות אחרים של ALE לעומת טכניקות התרבות מבוססת יצווה. ALE-induced מתח של Escherichia coli נתון בתנאי succinate גבוהים הוא הציג במאמר זה.
Iles / ftp_upload / 54,446 / 54446fig1.jpg "/>
איור 1: שיטות של האבולוציה מעבדה אדפטיבית (א) Chemostat;. (ב) העברת סדרתי; (ג) העברת המושבה. הדמויות העליונות להמחיש את הרעיון של שיטות ALE, ואת הדמויות התחתונות להמחיש את מספר התאים גדלו במהלך ALE. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרואורגניזמים הם יהיו מסוגלים להתאים כמעט לכל סביבות בגלל קצב הצמיחה המהיר שלהם המגוון הגנטי. אבולוצית מעבדה מסתגלת מאפשרת מיקרואורגניזמים להתפתח בתנאים תוכנן, אשר מספק דרך בחירת אורגניזמים בודדים מחסה מוטציות ספונטניות שאינן מועילים בתנאים הנתונים.
<p class="jove_c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).
Materials
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | – | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | – | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
- Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
- Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
- Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
- Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
- Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
