إجراءات التكيف مختبر تطور الكائنات الدقيقة باستخدام ناظم كيميائي
Summary
هنا، نقدم بروتوكول للحصول تطور مختبر التكيف من الكائنات الحية الدقيقة في ظل ظروف استخدام الثقافة ناظم كيميائي. أيضا، وتناقش التحليل الجيني لسلالة تطورت.
Abstract
Natural evolution involves genetic diversity such as environmental change and a selection between small populations. Adaptive laboratory evolution (ALE) refers to the experimental situation in which evolution is observed using living organisms under controlled conditions and stressors; organisms are thereby artificially forced to make evolutionary changes. Microorganisms are subject to a variety of stressors in the environment and are capable of regulating certain stress-inducible proteins to increase their chances of survival. Naturally occurring spontaneous mutations bring about changes in a microorganism’s genome that affect its chances of survival. Long-term exposure to chemostat culture provokes an accumulation of spontaneous mutations and renders the most adaptable strain dominant. Compared to the colony transfer and serial transfer methods, chemostat culture entails the highest number of cell divisions and, therefore, the highest number of diverse populations. Although chemostat culture for ALE requires more complicated culture devices, it is less labor intensive once the operation begins. Comparative genomic and transcriptome analyses of the adapted strain provide evolutionary clues as to how the stressors contribute to mutations that overcome the stress. The goal of the current paper is to bring about accelerated evolution of microorganisms under controlled laboratory conditions.
Introduction
يمكن أن الكائنات الحية الدقيقة على البقاء والتكيف مع بيئات متنوعة. تحت ضغط شديد، يمكن أن يحدث التكيف عن طريق الاستحواذ على الظواهر المفيدة التي كتبها الطفرات الجينومية عشوائية واختيار إيجابية لاحقة 1-3. لذلك، يمكن أن الخلايا الميكروبية التكيف عن طريق تغيير التمثيل الغذائي أو الشبكات التنظيمية للنمو الأمثل، وهو ما يطلق عليه "تطور التكيف". الأخيرة النزعات الميكروبية الهامة، مثل انتشار الجراثيم وحدوث سلالات ميكروبية قوية، ترتبط ارتباطا وثيقا جدا لالتكييفية تطور تحت ظروف ضاغطة. تحت ظروف المختبر محددة، ونحن قادرون على دراسة آليات التطور الجزيئي وحتى التحكم في اتجاه تطور ميكروبات لمختلف التطبيقات. على عكس الكائنات متعددة الخلايا والكائنات وحيدة الخلية هي مناسبة تماما لتطور مختبر التكيف (الرابطة) وذلك للأسباب التالية: أنها تجديد بسرعة، والحفاظ على عدد كبير من السكان، وأنه من السهل لخلق والحفاظ هومبيئات ogeneous. جنبا إلى جنب مع التطورات الحديثة في تقنيات تسلسل الحمض النووي وتقنيات عالية الإنتاجية، الرابطة يسمح لمراقبة مباشرة من التغيرات الجينية التي تؤدي إلى تغييرات تنظيمية النظامية. ديناميات طفرية ومجموعة متنوعة من السكان هي أيضا ملاحظتها. استراتيجيات الهندسة الوراثية يمكن تحديد من تحليل سلالات الرابطة 4،5.
ثقافة ناظم كيميائي هي الطريقة المستخدمة للحصول على خلايا ثابتة للدولة وزيادة الإنتاجية في عمليات التخمير 6. يضاف متوسطة جديدة ويتم حصاد ثقافة مرق أثناء عملية (ويشمل هذا الأخير المتوسطة والكتلة الحيوية). ثقافة ناظم كيميائي على المدى الطويل، ومع ذلك، يتغير الإنتاجية ثابتة للدولة للثقافة ويجلب تراكم الطفرات العفوية والاختيار خلال ثقافة (الشكل 1A). تحت ضغوط الانتقاء مختلفة (الضغوطات)، ومما يعزز تراكم الطفرات. وهناك زيادة تدريجية من التوتر في المدى الطويل يوفر ناظم كيميائي لمجموعة مستمرة من الطفرات التي تعمل ضد الضغوطات معينة، مثل درجة الحرارة ودرجة الحموضة، والضغط الاسموزي والتجويع المغذيات، والأكسدة، والمنتجات النهائية السامة، وما إلى ذلك نقل مستعمرة من وسط صلب ونقل المسلسل من الوسط السائل (المتكررة ثقافة دفعة) تسمح للباحثين للحصول على الكائنات الحية الدقيقة تطورت (الشكل 1B و1C). على الرغم من أن الثقافة ناظم كيميائي يتطلب أساليب معقدة، وتجمع التنوع (عدد مكررات وحجم السكان) أعلى من تلك التي يحصل عليها عن طريق التحويل مستعمرة وتقنيات نقل التسلسلية. تعرض الضغط مستقر إلى الخلايا الفردية وانخفض التباين في دولة الخلوية خلال ثقافة ناظم كيميائي (الحالة المستقرة) هي فوائد أخرى من الرابطة بالمقارنة مع التقنيات المعتمدة ثقافة دفعة واحدة. هو عرض ALE التوتر الناجم عن الإشريكية القولونية يتعرضون لظروف السكسينات عالية في هذه المقالة.
ديزيل / ftp_upload / 54446 / 54446fig1.jpg "/>
الشكل 1: طرق تطور مختبر التكيف (A) ناظم كيميائي؛ (ب) نقل المسلسل؛ (ج) نقل مستعمرة. الأرقام أعلى توضح مفهوم طرق الرابطة، والأرقام السفلية توضح عدد الخلايا التي نمت خلال الرابطة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
الكائنات الدقيقة قادرة على التكيف مع جميع البيئات تقريبا بسبب معدل نموها السريع والتنوع الجيني. تطور مختبر التكيف تمكن الكائنات الدقيقة تتطور في ظل ظروف مصممة، الذي يوفر وسيلة لاختيار الكائنات الفردية إيواء الطفرات العفوية التي تعود بالفائدة تحت ظروف معينة.
<p class…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was financially supported by the Korean Ministry of Science, ICT and Future Planning (Intelligent Synthetic Biology Center program 2012M3A6A8054887). P. Kim was supported by a fellowship from the Catholic University of Korea (2015).
Materials
| Mini-chemostat fermentor | Biotron Inc. | – | manufactured by special order |
| silicon tubing | Cole-Parmer | Masterflex L/S 13 | tubing size can be varied depending on the dilution rate and the size of fermentor jar. |
| reservoir jar | Bellco | Media storage bottle | 20 L |
| chemicals | Sigma-Aldrich | – | reagent grade |
| glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | ACS reagent |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 | for molecular biology, suitable for cell culture, ≥99.5% |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | ACS reagent, ≥99% |
| Na2HPO4·2H2O | Sigma-Aldrich | 4272 | 98.5-101% |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 795488 | ACS reagent, ≥99% |
| MgSO4·7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | ACS reagent, ≥98% |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 793639 | ACS reagent, ≥96% |
| thiamine·HCl | Sigma-Aldrich | T4625 | reagent grade, ≥99% |
| Na2·succinate·6H2O | Sigma-Aldrich | S2378 | ReagentPlus, ≥99% |
References
- Rando, O. J., Verstrepen, K. J. Timescales of genetic and epigenetic inheritance. Cell. 128, 655-668 (2007).
- Kim, H. J., et al. Short-term differential adaptation to anaerobic stress via genomic mutations by Escherichia coli strains K-12 and B lacking alcohol dehydrogenase. Front Microbiol. 5, 476 (2014).
- Mendizabal, I., Keller, T. E., Zeng, J., Yi, S. V. Epigenetics and evolution. Integr Comp Biol. 54, 31-42 (2014).
- Lee, J. Y., Seo, J., Kim, E. S., Lee, H. S., Kim, P. Adaptive evolution of Corynebacterium glutamicum resistant to oxidative stress and its global gene expression profiling. Biotechnol Lett. 35, 709-717 (2013).
- Lee, J. Y., et al. Artificial oxidative stress-tolerant Corynebacterium glutamicum. AMB Express. 4, 15 (2014).
- Narang, A. The steady states of microbial growth on mixtures of substitutable substrates in a chemostat. J Theor Biol. 190, 241-261 (1998).
- Kwon, Y. D., Kim, S., Lee, S. Y., Kim, P. Long-term continuous adaptation of Escherichia coli to high succinate stress and transcriptome analysis of the tolerant strain. J Biosci Bioeng. 111, 26-30 (2011).
- Barrick, J. E., Lenski, R. E. Genome dynamics during experimental evolution. Nat Rev Genet. 14, 827-839 (2013).
- Li, H., et al. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).
- McKenna, A., et al. The Genome Analysis Toolkit: a MapReduce framework for analyzing next-generation DNA sequencing data. Genome Res. 20, 1297-1303 (2010).
- Deatherage, D. E., Barrick, J. E. Identification of mutations in laboratory-evolved microbes from next-generation sequencing data using breseq. Methods Mol Biol. 1151, 165-188 (2014).
