F9를 RARE-LacZ를 셀 기반 리포터 분석을 사용하여 E8.5 배아 및 Neurosphere 문화에서 상대 레티노 산 수준의 정량적 측정

모든 동물의 작업은 승인 럿 거스 – RWJMS IACUC 방법에 따라 수행 하였다. 1. 솔루션 및 미디어 준비 . 표 1에 따라 주식 및 버퍼 솔루션을 준비 표 2에 따라 작업 솔루션을 준비합니다. 2. 문화 F9 RARE-LacZ를 세포의 유지 보수 해동 냉동 세포 표 2에 자세히 F9 RARE-LacZ를 세포 배양 배지를 준비한다. 코트 10cm 배양 접시 0.2 % 젤라틴 10 mL로 (처리 된 세포 배양 물)을 RT에서 30 분 동안 (표 2 참조). 증류수 10 ml의 두 린스와 초과 젤라틴을 씻으십시오. 즉시 건조되는 젤라틴을 방지 플라스크 F9 RARE-LacZ를 세포 배양 배지 9 ml에 추가한다. 3 분 – 2 37 ° C의 물을 욕조에 F9 RARE-LacZ를 셀 (14)의 병을 해동. 코팅 접시 C 플레이트에 세포 (1 × 106 주위 세포 / ml)배지 9 ml에 ontaining. 37 ° C에서 문화, 5 % CO 2. 다음날 매체를 변경합니다. F9 RARE-LacZ를 세포의 유지 보수 1:10 비율 3 일 – 매 2 일반 통로를 유지한다. 참고 : 세포가이 분화가 발생합니다 같이 포화 상태로 성장하게하지 마십시오. 80-90%의 포화 상태에서 문화를 분할합니다. 용지를 제거하고 1 배 인산 완충 식염수 10 ㎖ (PBS)와 세포를 씻는다. 5 분 동안 품어의 PBS를 제거하고 트립신의 1ml를 추가합니다. 배지, 피펫 9 ml의 상하 분할 세포 1시 10분 통과를 위해 추가. F9 RARE-LacZ를 세포를 냉동 단계 2.2.2에 설명 된대로 90 % 합류 – 80 F9 RARE-LacZ를 세포를 포함하는 10cm 접시를 Trypsinize. 5 분 동안 200 XG에 15 ML의 원심 분리기 튜브와 스핀에 해리 세포를 전송합니다. F9 RARE-LacZ를 F 10ml에 뜨는 및에 resuspend 세포 펠렛을 제거매체 reezing (표 2 참조). 나누어 냉동 컨테이너에 표시 크리오 바이알 (cryovial) 및 전송 바이알에 1 ml의. 다음날 액체 질소 탱크에 -80 ° C의 냉동고 O / N 및 전송 유리 병 용기를 동결 놓습니다. E8.5 배아 3. 해부 짝짓기 케이지 설치 및 플러그 확인 설정 한 결합 쌍을 포함하는 결합 케이지. 다음 날의 아침, 질 플러그의 존재를 확인하고 플러그를 하루 0.5 (23)로 발견되는 일을 지정합니다. 일 E8.5, 수확 배아에서. 태아의 해부 경추 탈구를 통해 댐 희생과 70 % 에탄올로 복부 스프레이 (표 2 참조). 수술 가위를 사용하여 복부 위의 피부에 잘라 가로을 확인하고 복부를 노출 간격 (전방 및 후방) 두 개의 플랩을 잡아 당깁니다. 비슷한 상처를 확인복막의 복부를 노출합니다. 자궁를 찾아 난관에서 자궁을 해제하고 가위 (23)의 쌍을 사용 mesometrium. PBS는 여분의 지방과 혈액을 씻어 1X 10 ml를 가진 6cm 요리 (처리되지 않은 세포 배양)에서 자궁을 놓습니다. PBS 1X 신선한 10 ml에 포함 된 다른 6cm 접시에 전송합니다. 수술 가위를 사용하여 절단하여 하나의 배아를 포함하는 하나 자궁 별도. 자궁과 탈락을 제거하고 더 두 쌍을 사용하여 배아를 포함하는 난황을 놓습니다. 5 집게 23. 배아에서 난황을 분리하고, 유전자형에 사용되는 게놈 DNA 추출을 위해 1.5 ML의 microcentrifuge 관에 난황을 전송합니다. 트립신 10 μl를 포함하는 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 전체 배아를 전송, 넓은 구멍 팁으로 P20 피펫을 사용합니다. 얼음에 튜브를 놓습니다. 모든 배아가 해부 될 때까지 3.2.4 – 반복 3.2.3 단계를 반복합니다. 배아 해리 5 분 효소 분해를 촉진하기 위해 37 ℃에서 트립신 배아를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브 부화. 씹다 부드럽게 배아의 기계적 분리를위한 P20에 피펫을 이용하여 96- 웰 플레이트에서 F9 RARE-LacZ를 세포 중 하나 이상 잘 한 해리 된 배아를 포함하는 전체 10 ㎕의 부피 플레이트 (F9 RARE-LacZ를 세포 도금위한 단계 5.1 참조 96- 웰 플레이트). 문화 O / N 37 ° C에서 5 % CO 2. 4. 후궁 절제술, 해부 성인의 요추 척수 및 Neurosphere 문화 후궁 절제술 자궁 경부 전위를 통해 성인 (P60) 마우스를 희생. 70 % 에탄올로 등의 측면 스프레이 및 수술 가위를 사용하여 가로 컷을합니다. 허리와 척추를 노출 떨어져 모두 플랩 (전방 및 후방)를 당깁니다. 수술 가위를 사용하여 척추를 덮고있는 근육을 잘라.리브 이하, 척추의 요추 영역을 찾아. 가위를 사용하여 절단 깊이가 척수를 노출 이때 척추를 절단 할 수 있습니다. 더와 척추의 요추 영역을 위로 당겨 없습니다. 5 집게는 척수의 노출 횡단면은 실험을 향하도록. 미세 위의 팁을 사용하여, 노출 된 단부의 3시 방향 9시 위치에서 척추 근육을 자르지. 집게로 잘라 척추의 등 플랩을 잡고. 요추 척수의 길이가 노출 될 때까지 꼬리 쪽이 상처를 계속합니다. 더 사용하여 척추에서 척수를 놓습니다. 5뿐만 아니라 무딘 종단 집게. DMEM / F12 배지 3 ㎖을 함유하는 15 ㎖의 튜브 척수 전송. 모든 요추 척수가 분리 될 때까지 얼음에 보관하십시오. 척수의 해부 6 접시 형상으로 척수와 배양액을 붓고 (비 세포 배양 처리). 실체 현미경 아래에서, 아니 두 쌍을 사용하여 신경과 혈관을 잡고 척수 세그먼트 주위의 지느러미 루트 신경과 혈관을 제거합니다. 5 집게는 부드럽게 척수에서 그들을 멀리 당겨. 아니오 매체와 6cm 접시 척수 세그먼트를 전송하고 미세 메스 블레이드를 사용하여 조직을 말하다. neurosphere 해리 배지 1 ㎖를 함유하는 15 ㎖의 튜브에 전송 다진 조직 (표 2 참조). 모든 척수가 처리 될 때까지 4.2.2 – 4.2.1 단계를 얼음과 반복에 튜브를 넣어. 10 분 동안 37 ℃에서 해리 배지에서 다진 조직을 포함하는 튜브를 혼합하는 부화 측의 튜브를 가볍게하고 또 다른 10 분 동안 37 ℃에서 배양한다. 기계적 분리에 대한 직경을 감소 화재 연마 피펫과 효소 소화, 씹다 후. 참고 : 실험을 수행하기 전에 직경을 감소 화재 광택 피펫을 준비합니다. 유리 파스퇴르을피펫과 깨끗한면에 넓은 끝을 연결합니다. 알코올 램프를 사용, 화재 폴란드어 화염에 피펫의 끝이 서로 다른 직경을 만들려면 : "일반", "좋은"및 "극세". "일반"연마 피펫의 경우, 직경 (~ 1mm)를 감소시키지 않고 가장자리 둘레에 화염 피펫의 끝을 돌리기. "좋은"(~> 1mm과> 5mm 직경)와 "극세"(~ 0.5 mm) 광택 피펫을 만들기 위해 약간 더 긴 기간 동안 불꽃 피펫의 끝을 돌립니다. 0.5 mm보다 작은 직경 피펫을 사용하지 마십시오. Neurosphere 문화 스핀 다운 함유 관을 10 분 동안 200 XG에서 척수 조직을 분해. neurosphere 배양 배지 1 ㎖에 재현 탁 상등액과 세포 펠렛을 제거 (표 2 참조). 분해를 촉진하기 P200 피펫에 이어 P1,000 피펫 씹다. 참고 : 도입 거품을 피하고,이는 세포 생존율을 감소시킨다. 혈구로 전송 해리 세포의 10 μl를하고 세포 수를 얻을 수 있습니다. neurosphere 배양 배지 10 ㎖와 T25 플라스크에 1 × 10분의 5 ml의 밀도로 접시 셀. neurosphere를 24 나타날 때까지 7 일간 CO 2, 37 ℃에서 인큐베이션하고, 5 %. Neurosphere 해리 neurosphere 문화를 수집하고 15 ML의 튜브로 전송할 수 있습니다. 10 분 동안 200 XG 스핀. 뒤에 1 ml에 떠나는 뜨는의 대부분을 제거합니다. 세포 펠렛을 재현 탁하고 단일 세포로 neurosphere를을 해리하기 위해 P1,000 피펫으로 씹다. 혈구로 전송 해리 세포의 10 μl를하고 세포 수를 얻을. 플레이트 1 × 5는 96 웰 플레이트 (96 웰 플레이트에서 F9 RARE-LacZ를 도금을위한 5.1 절 참조) F9 RARE-LacZ를 잘 하나 이상 neurosphere 세포를 분해. 플레이트 복제로 3 우물. 문화 O / N 37 ° C에서 5 % CO 2. E8.5 배아 및 척수 neurosphere를 5. RA 분석 96 웰 플레이트에 도금 F9 RARE-LacZ를 하루 수확 E8.5 배아 또는 neurosphere를 해리하기에 앞서, 외투 RT에서 30 분 동안 웰 당 0.2 % 젤라틴 100 ㎕와 함께 96 웰 플레이트. 기음과 젤라틴에서 증류수 200 μL로 두 번 씻어. 단계 2.2.2에 설명 된대로를 Trypsinize F9 RARE-LacZ를 세포는 10cm 요리로 유지. 플레이트를 1 × 105 세포 / 웰의 F9 RARE-LacZ를 셀하지만 G418없이 배양 배지를 이용하여 이번에. , neurosphere를 (3 우물 / 유전자형)뿐만 아니라 대한 세중의 표준 곡선 (27 웰) – 배아의 공동 문화 (쓰레기 크기에 따라 20 ~ 12)에 대한 충분한 우물을 준비합니다. F9 RARE-LacZ를하고 E8.5 배아 또는 척수 neurosphere를 공동 문화 F9 위에 섹션 3.2 판에 설명 된대로 수확 배아5.1 절에서 96 웰 플레이트에서 RARE-LacZ를. 유사한 방식으로, 단계 4.4에서와 같이 상세한 96- 웰 플레이트에서 F9 RARE-LacZ를 위에 neurosphere를 접시를 해리. 문화 O / N 37 ° C에서 5 % CO 2. 표준 곡선을 생성 100 nm의, 10 nM의 1 nM의의 AT- 용액을 희석 100 오후 10 오후 1 오후 100 FM : 표준 곡선을 작성하려면 다음 농도 솔루션 (AT-RA) 모든 트랜스 RA를 준비 F9 RARE-LacZ를 배지와 RA 스톡 (표 1 참조). 5.1 절에서 F9 RARE-LacZ를 세포에 농도-RA의에서 서로 다른 100 μl를 추가합니다. 치료 F9 RARE-LacZ를 세포에게 부정적인 컨트롤을 포함 우물을 할당합니다. 각 RA 농도와 음성 대조군 웰의 삼중를 준비합니다. 문화 O / N 37 ° C에서 5 % CO 2. 주 : F9 RARE-LacZ를 세포는 올 – 트랜스 RA의​​ 다양한 농도로 용량 의존적 선형 방식으로 반응한다. RA의 분석 표준 곡선과 공동 배양 물을 함유하는 96 웰 플레이트의 O / N 배양 후, 상기 미디어를 제거하고 2.5 % 글루 타르 알데히드 100 ㎕를 첨가하여 배양을 해결 15 분, RT 경우 (표 2 참조). 정착액을 제거하고 PBS 1 배 200 μL, 세척 당 10 분으로 두 번 씻는다. PBS를 제거하고 LacZ를 세척 용액을 200㎕로 3 회 세척 세척 당 10 분 (표 2 참조). 세 번째 세척 동안 호일로 싸서 15 ㎖의 튜브의 X-GAL 염색 용액을 제조 하였다 (표 2 참조). 필요한 얼마나 많은 염색 액 계산하고 해당 금액 (200 μL / 웰)을 준비합니다. 참고 : X-여자 염색 솔루션은 민감한 빛입니다. 준비 후 15 분 이내에 염색 액을 사용합니다. 96 웰 플레이트를 저장하기에 충분히 큰 플라스틱 용기에 증류수를 적신 종이 타월을 배치하여 가습 챔버를 준비합니다. 는 X 200 μl를 추가β-gal을 염색 96 웰 플레이트의 웰 당 솔루션은 가습 챔버에서 접시를 놓습니다. 청색 침전물을 개발하도록 37 ° C에서 96 웰 플레이트를 포함하는 습한 챔버 부화. (- 16 시간 12) E8.5 배아의 경우, 플레이트 O / N을 품어. 8 시간 – neurosphere 문화를 들어, 4 접시를 품어. OD (610) 및 이미지에서 흡광도를 읽기 발색 반응 후에는 LacZ 염색 용액을 제거하고 PBS 1X 200 μL로 대체. RA에 대한 리포터 반응을 정량화하는 표준 ELISA 플레이트 리더를 사용하여 610 nm에서 흡광도를 측정한다. 카메라가 장착 된 표준을 사용하여 입체 영상의 개별 웰. F9 RARE-LacZ를 세포의 6. 서브 클로닝 RA에 F9 RARE-LacZ를 rResponse 확인 모든 실험을 시작하기 전에, RA에 F9 RARE-LacZ를 세포의 응답을 테스트한다. 플레이트 F9 RARE-LacZ를 C를96 웰 플레이트에 ELL 학생은 (5.1 절 참조), 1 nM의 모든 트랜스 레티노 산 (단계 5.3 참조)에 추가합니다. 37 CO / N에서 가습 실에 품어. 현미경을 사용하여 푸른 색의 침전물의 개발을 시각화합니다. 발색 웰의 세포에 걸쳐 균일하지 않은 경우, 아래에 설명 된 서브 클로닝을 수행 (좌도 1b를 참조). F9 RARE-LacZ를 세포의 서브 클로닝 단계 2.2.2에 설명 된대로 10cm 접시에서 배양 F9 RARE-LacZ를 셀을 분할합니다. 대신 1:10 비의 각 콜로니는 단일 F9 RARE-LacZ를 셀에서 발생되도록 절연 콜로니의 성장을 허용하기 위해 10cm 접시에 1 × 105 세포 / 10 ㎖의 낮은 시딩 밀도 접시. 이일 후, 코트 30 분 동안 잘 당 0.2 % 젤라틴의 500 μL와 24 웰 플레이트. 젤라틴 용액을 제거하고 증류수 500 μL로 두 번 우물을 씻어. F9 RARE-LacZ를 세포 배양 배지 500 μl의 물을 교체합니다. 잘 하나에 멸균 P10 피펫 팁 및 전송을 사용하여 식민지를 선택; 24 개별 콜로니를 수득하기 위해 24 회 수행. 4 일 – 37 ° C, 3, 5 % CO 2에서 문화. 이 24 웰 플레이트에 개별 식민지를 분할합니다. 문화 2 일 후, 한 24 웰 플레이트와 문화 O / N의 각 웰에 RA의 1nM이를 추가합니다. 높은 조치를 테스트하는 섹션 5.4에 설명 된대로 LacZ를 염색을 수행합니다. 강하고 균일 조치를 결정하도록 잘 현미경 하에서 각각의 발색 반응을 가시화. 강한 서브 클론 응답자가 결정되면, 다른 24- 웰 플레이트로부터 해당 배양을 확장. 또한, 10cm 접시에 그 식민지를 확장 2.3 절에 설명 된대로 여러 가지 병을 동결하고, 다른 모든 식민지를 폐기합니다. 참고 : 원래 식민지의 1/4이 높은 대응을 초래할 만에 대해. 일반적으로 서브 클로닝의 첫 번째 라운드는 균일 한 LacZ를 염색 발생하지 않습니다 및 서브 클로닝의 후속 라운드에 수행해야균일 한 강력한 대응을 얻을 수 있습니다.