Dokunmatik uyarılmış Yanıt ve Hareket Deneyleri kullanarak Zebra balığı kas Performans ve fonksiyonunu değerlendirmek için
Summary
Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Abstract
Zebra balığı kas gelişimi son derece onlara kas fonksiyonu ve hastalık incelemek için mükemmel bir model yapma memeli sistemlerle muhafaza edilir. iskelet kas fonksiyonunu etkileyen birçok miyopatiler hızlı ve kolay bir embriyogenez ilk birkaç gün içinde zebrafish değerlendirilebilir. 24 saat sonrası fertilizasyon (hpf) tarafından, wild tip zebrabalıkları kendiliğinden kuyruk kasları sözleşme ve 48 hpf, Zebra balığı sergi kontrollü yüzme davranışlarıyla. sıklığında azalma, ya da diğer değişiklikler, bu hareketler bir iskelet kas disfonksiyonu gösterebilir. yüzme davranışlarını analiz ve erken Zebra balığı gelişiminde kas performansını değerlendirmek için, biz de dokunmatik uyarılmış kaçış tepkisi ve hareket analizleri kullanmaktadır.
Dokunmatik uyarılmış kaçış tepki deneyleri hızlı kasılan kas liflerinin kasılmasıyla ortaya çıkan kısa patlama hareketleri sırasında kas performansını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu durumda, bir dokunun bir dış etmenin etkisi, yanıt olarak,Baş, sonrası fertilizasyon (dpf) 2 gün wild tip Zebra balığı genellikle keskin dönüşler eşliğinde güçlü bir patlama yüzmek, sergilerler. Bizim yöntemi ivme kas kasılması tarafından üretilen kuvvet ile doğru orantılı olarak, bir patlama yüzme hareketi sırasında maksimum ivmeyi ölçerek iskelet kası fonksiyonunu rakamlarla.
Buna karşılık, erken zebra balığı larva gelişimi sırasında hareket yeteneği deneyler, kas aktivitesinin devam dönemlerde kas performansının değerlendirilmesi için kullanılır. yüzme davranışlarını izlemek için bir izleme sistemi kullanarak, biz onların iskelet kas fonksiyonlarının yansıtıcı 6 gün eski Zebra balığı faaliyet ve mesafe sıklığı otomatik hesaplama, edinin. yüzme performansı ölçümleri hastalık modelleri ve iskelet kas fonksiyonunu etkileyen mutasyonlar veya kimyasal tedavilerin yüksek verimli tarama fenotipik değerlendirme için değerlidir.
Introduction
Geçtiğimiz on yıl zebrabalıkları üzerinde giderek kas hücre biyolojisi ve hastalık incelemek için kullanılır olmuştur. optik netlik ile birleştiğinde zebrafish embriyo, hızlı dış gelişme, kas oluşumu, büyüme ve fonksiyon doğrudan görselleştirme izin verir. Kas geliştirme süreci son derece zebrabalıkları muhafaza edilir ve bu müsküler distrofi ve konjenital miyopatiler 1-8 da dahil olmak üzere kas hastalıklarının bir dizi başarılı modelleme izin verdi. Zebra balığı modellerin detaylı olarak incelenmesi ancak bu koşulların patobiyolojisi yeni bakış açıları sağlanan değil, aynı zamanda uygun tedavilerin 6,9-13 test için bir platform sağlamadı.
kas hastalıklarının zebrabalıkları modellerinin analizi kas performansını ölçmek için güvenilir ve tekrarlanabilir deneyleri dayanır. Önceki çalışmalar başarıyla tarafından DPF 3 ila 7 arasında balık Zebra balığı gövde kas kuvveti üreten yeteneği ölçülür varelektriksel bir güç iletim sistemi 14 bağlı bir hareketsizleştirilmiş balık kasılmasını stimüle eder. Bu kuvvet detaylı ölçümler sağlayabilir ancak ideal yüksek verim deneyleri için uygun değildir ve yüzme sırasında kas performansını ölçmek için avantajları vardır. Zebra balığı kas dpf 2'de tamamen işlevseldir ve balık uyaranlara yanıt olarak patlama yüzme hareketleri ortaya çıkarabilir. dokunmatik uyandırmak çıkış yanıt deney kasılma gücünün bir ölçüsü olarak kullanılabilir bir darbe yüzme hareketi sırasında ivme ölçümü için kullanılır.
Miyopati hastalarda kas fonksiyonlarının en çok kullanılan önlemlerden biri toplam mesafe sert ve düz bir yüzeye 15,16 yürüdü kaydeden 6 dk yürüme testidir. Biz toplam mesafe yapılırsa yapılsın izlemek ve böylece, zebra balığı larvası dpf 6 kas fonksiyonu ölçmek için kıyaslanabilir bir test uygulanmış ve 10 dakikalık bir süre boyunca, her bir larvaya yapılan hareketlerin sayısı var. Bu gerçekleştirilirkas performansı, güvenilir ve yüksek verimli ölçümleri sağlayan otomatik bir izleme sistemi kullanılarak. Her iki kas testleri yüksek oranda tekrarlanabilir ve Zebra balığı miyopati modellerde 8 kas performansında farklılıklar ölçmek için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
fareler, köpekler, Zebra balığı, sinek ve solucanlar gibi birçok farklı hayvan modelleri kas hastalıklarının genetik ve moleküler temeli anlayışımız yolunda katkıda ve bunlarla mücadele etmek terapötik yaklaşımların geliştirilmesinde yardımcı olması. Zebra balığı kas hastalığı çalışmaları için çeşitli avantajlar sunuyor. Zebra balığı, in vitro kültür sistemlerinde mümkün değildir, uygun bir fizyolojik bir ortamda, karmaşık kas modelli değerlendirmek için genetik olarak manipüle edilebilir bir sistem sağlar. Diğer omurgalı hayvan modellerinde farklı olarak, hep birlikte optik berraklık üretilen balık sayıda, in vivo kimyasal ve genetik tarama hızlı, yüksek hacimli kolaylaştırır.
Burada zebrabalıkları embriyogenez sırasında kas performansını değerlendirmek için yüksek verimlilik ve otomatik bir yöntem sağlamak için Zebra balığı hareket deneyleri gelişimini açıklar. Her iki tahliller için de kabul edilmesi gerektiğini sirkadiyen ritimler vedış çevresel uyaranlara anlamlı zebrabalıkları yüzme davranışı 17,18 etkileyecektir. Aynı zebrabalıkları Tekrarlanan test de 23 uyaran dokunsal yanıt olarak bir azalmaya neden alışkanlık yol açacaktır. Bu nedenle, deneyler arasında tekrarlanabilir sonuçlar her zebrabalıkları embriyo elde etmek için sadece bir gün ve aydınlatma koşulları zaman standardize edilmelidir kez test edilmiş ve su sıcaklığı sıkı regüle edilmesi gerekmektedir edilmelidir.
doğrudan kas kuvveti ile orantılı bir patlama yüzme eylemi, maksimum ivme ölçebilir dpf'e dokunma kullanarak 2'de analiz uyarılmış. Zebra balığı Önceki teknikler ölçülür bir elektrik alanı ve kas 14 kuvvet üreten yeteneğini kullanarak uyarılan kas kasılması deneysel ekipman aşağıdakilere embriyoların her iki ucunu bağlayarak kas kuvveti inceledik. Bu yöntem, t üretim kapasitesi kuvvetini ölçer ikenO larva kas, bu yüzme sırasında larva kas tarafından üretilen gerçek gücü ölçmez. Bu nedenle dolaylı olarak kas sağlığının genel bir ölçü sağlamak için, normal larva yüzme hareketi sırasında oluşan kuvveti değerlendirmek için bir yöntem geliştirdi. 1000 kare hızında bireysel zebrabalıkları hareketleri kayıt yeteneğine yüksek hızlı video sistemi, / sn gözle doğrudan ayırt edilemez kas fonksiyonlarının küçük ama anlamlı farklılıklar tespit etmek için kullanılabilir. Bu elektriksel olarak uyarılmış kuvvet nesil değişiklikleri yüzme performansında değişiklikler ile ilişkili bildirilen ne kadar önceden görmek için ilgi olacaktır.
Ek olarak dokunmatik yanıt deneyler ayrıca lokomotor davranışlar nicel bir ölçümünü elde etmek için, yüzme hareketi 24 boyunca vücut dalga şekli ve hız gibi yüzme kinematik değerlendirmek için kullanılabilir uyarılmış.
Nedeniyle zebraf spontan hareketineish larvalar 3 dpf'e sonra, biz kas fonksiyonunu ölçmek için dokunmatik uyandırmak deneyleri gerçekleştirmek mümkün değildi. Tersine, biz 6 dpf'e Zebra balığı larvalarının mesafe swum belirleyerek daha uzun bir süre boyunca kas performansını ölçtük. Bu test, kas fonksiyonunun dolaylı ölçüm de, balık bozulmuş kas performansının 8 veya nörodejenerasyonu 25,26 görüntülendiği belirlemek için kullanılabilir. Bu test 6 dakika yürüme testine benzer bir ölçüm sağlar ama aynı zamanda in vivo ilaç ya da mutagenez ekranlarında otomatik yüksek verimlilik için uygun değil sadece.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
Materials
| 21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
References
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish. PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).
- Gupta, V., Kawahara, G., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
- Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency. Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).
- Sztal, T. E., Zhao, M., et al. Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function. Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).
- Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish. Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).
- Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. , (2005).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. (82), e50925 (2013).
- Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae. J Vis Exp. (77), (2013).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study. Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).
- Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish. Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).
- MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).
- Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies. Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).
- Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance. Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development. J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).
- Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics. PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).
- Moggio, M., Colombo, I., et al. Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge. Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).
