Utilizzando risposta al tocco evocata e di locomozione saggi per valutare le prestazioni e sulla funzione muscolare in Zebrafish
Summary
Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Abstract
lo sviluppo muscolare zebrafish è altamente conservata con i sistemi di mammiferi che li rende un ottimo modello per studiare la funzione muscolare e le malattie. Molti miopatie che influenzano la funzione del muscolo scheletrico possono essere rapidamente e facilmente valutati in zebrafish nel corso dei primi giorni di embriogenesi. Con 24 ore di post-fecondazione (HPF), di tipo selvatico zebrafish spontaneamente contrarre i muscoli della coda e del 48 HPF, comportamenti di nuoto mostrano controllato zebrafish. Riduzione della frequenza di o altre alterazioni, questi movimenti possono indicare una disfunzione muscolo scheletrico. Per analizzare il comportamento di nuoto e valutare l'andamento del muscolo nei primi mesi di sviluppo zebrafish, utilizziamo entrambi i test di risposta e di locomozione di fuga al tocco evocato.
saggi di risposta di fuga touch-evocati possono essere utilizzati per valutare le prestazioni dei muscoli durante i movimenti breve scoppio risultante dalla contrazione delle fibre muscolari a contrazione rapida. In risposta ad uno stimolo esterno, che in questo caso è un rubinettola testa, di tipo selvatico zebrafish a 2 giorni dopo la fecondazione (DPF) di solito presentano una potente nuotata raffica, accompagnato da curve strette. Il nostro metodo quantifica funzione del muscolo scheletrico misurando l'accelerazione massima durante un movimento raffica nuoto, l'accelerazione essendo direttamente proporzionale alla forza prodotta dalla contrazione muscolare.
Al contrario, saggi di locomozione durante precoce sviluppo larvale zebrafish sono utilizzati per valutare le prestazioni dei muscoli durante lunghi periodi di attività muscolare. Utilizzando un sistema di monitoraggio per monitorare il comportamento nuoto, otteniamo un calcolo automatico della frequenza di attività e distanza in 6 giorni old zebrafish, riflettente della loro funzione muscolare scheletrico. Le misurazioni delle prestazioni nuoto sono preziose per la valutazione fenotipica dei modelli di malattia e di high-throughput screening di mutazioni o trattamenti chimici che interessano la funzione del muscolo scheletrico.
Introduction
Negli ultimi dieci anni zebrafish sono stati utilizzati sempre più per studiare la biologia delle cellule muscolari e le malattie. Lo sviluppo esterna rapida dell'embrione zebrafish, insieme con la sua chiarezza ottica, permette la visualizzazione diretta della formazione muscolare, la crescita, e la funzione. Il processo di sviluppo muscolare è altamente conservata in zebrafish e questo ha permesso la modellazione di successo di una serie di malattie muscolari tra cui distrofie muscolari e miopatie congenite 1-8. Analisi dettagliata dei modelli zebrafish non solo ha fornito nuove intuizioni nella patobiologia di queste condizioni, ma anche fornito una piattaforma per la sperimentazione di terapie adeguate 6,9-13.
L'analisi dei modelli zebrafish di malattie muscolari si basa su analisi affidabili e riproducibili per misurare le prestazioni muscolari. Studi precedenti hanno misurato con successo la capacità forza generatrice del muscolo tronco zebrafish nel pesce tra 3 e 7 DPF bystimolando elettricamente contrazione di un pesce immobilizzato collegato a un sistema di forze trasduzione 14. Questo può fornire misurazioni dettagliate di forza, ma non sono l'ideale per esperimenti di throughput più elevati e ci sono vantaggi per la misurazione delle prestazioni muscolari durante il nuoto. Al 2 dpf zebrafish muscolare è completamente funzionale e il pesce può suscitare movimenti scoppio di nuoto in risposta agli stimoli. Il test di risposta di fuga touch-evocare viene utilizzato per misurare l'accelerazione durante un movimento raffica nuoto, che può essere usato come una misura della forza contrattile.
Una delle misure più utilizzate della funzione muscolare nei pazienti miopatia è il test del cammino di 6 minuti, che registra la distanza totale camminato su una superficie piatta e dura 15,16. Abbiamo applicato un test simile per misurare la funzione muscolare in 6 dpf larve di pesce zebra, per cui monitoriamo la distanza totale nuotato, e il numero totale di movimenti effettuati da ciascun larva in un periodo di 10 min. Questa operazione viene eseguitautilizzando un sistema automatizzato di monitoraggio, che fornisce misurazioni affidabili e ad elevato throughput di prestazioni muscolari. Entrambi i test muscolari sono altamente riproducibili e sono stati utilizzati per quantificare le differenze di prestazioni muscolari nei modelli miopatia zebrafish 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
Molti modelli animali diversi, tra cui topi, cani, zebrafish, mosche e vermi hanno contribuito alla nostra comprensione delle basi genetiche e molecolari di malattie muscolari, e assistito allo sviluppo di approcci terapeutici per combatterli. Il pesce zebra vanta diversi vantaggi per lo studio della malattia muscolare. Il zebrafish fornisce un sistema geneticamente manipolabile per valutare complesso patterning muscolare in un ambiente fisiologico, la quale non è possibile in sistemi di coltura in vitro. A differenza di altri modelli animali vertebrati, il gran numero di pesci prodotte, insieme con la sua chiarezza ottica, facilita la rapida, ad alta produttività in chimica vivo e screening genetico.
Qui si descrive lo sviluppo di saggi di movimento zebrafish per fornire un alto throughput e metodo automatizzato per valutare le prestazioni dei muscoli durante l'embriogenesi zebrafish. Per entrambi i test si deve riconoscere che i ritmi circadiani estimoli ambientali esterni influenzeranno in modo significativo il comportamento di nuoto zebrafish 17,18. Test ripetuta dello stesso zebrafish anche portare ad assuefazione causando una diminuzione in risposta tattile stimolo 23. Pertanto, al fine di ottenere risultati riproducibili tra esperimenti ogni embrione zebrafish dovrebbe essere testato solo una volta, il tempo delle condizioni di giorno e di illuminazione deve essere standardizzato, e la temperatura dell'acqua deve essere strettamente regolata.
Utilizzando il touch evocata analisi a 2 dpf possiamo misurare direttamente l'accelerazione massima di un'azione raffica nuoto, che è proporzionale alla forza muscolare. Tecniche precedenti in zebrafish hanno esaminato la forza muscolare legando entrambe le estremità degli embrioni destinati attrezzature sperimentali a seguito della quale la contrazione del muscolo viene stimolato utilizzando un campo elettrico e la capacità di generare forza del muscolo 14 viene misurata. Mentre questo metodo misura la forza capacità di generazione di tegli muscolare larvale, non misura la forza effettiva generata dal muscolo larvale durante il nuoto. Abbiamo quindi sviluppato un metodo per valutare indirettamente la forza generata durante il normale movimento natatorio larvale per fornire una valutazione generale della salute dei muscoli. Il sistema video ad alta velocità, in grado di registrare singoli movimenti zebrafish in un frame rate di 1.000 fotogrammi / sec può essere utilizzato per identificare piccole ma significative differenze nella funzionalità muscolare, che non sono direttamente distinguibile ad occhio. Sarà interessante vedere come precedentemente riportato cambiamenti nella stimolato elettricamente vigore generazione correlazione con i cambiamenti nelle prestazioni di nuoto.
Inoltre il tocco evocata saggi di risposta possono anche essere utilizzati per valutare la cinematica nuoto, quali la forma e la velocità dell'onda corpo durante il movimento natatorio 24, per dare una misura quantitativa del comportamento locomotorio.
A causa del movimento spontaneo di zebraflarve ish dopo 3 dpf, non siamo stati in grado di eseguire le analisi al tocco evocare per misurare la funzione muscolare. Al contrario, abbiamo misurato prestazioni muscolari nel corso di un periodo più lungo per la determinazione della distanza nuotato da larve zebrafish a 6 dpf. Questo test, anche se una misura indiretta della funzione muscolare, può essere utilizzato per identificare i pesci visualizzazione rendimento muscolare alterata 8 o neurodegenerazione 25,26. Questo test non solo fornisce una misura analoga al test del cammino 6 min, ma è adatto anche per automatizzata ad alta produttività in droga o mutagenesi schermi vivo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
Materials
| 21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
References
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