באמצעות תגובת מגע עוררת ו תנועת מבחנים להעריך שריר ביצועים ופונקציות של דג זברה
Summary
Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Abstract
פיתוח שרירי דג זברה הוא שמור ביותר עם מערכות יונקות הפיכתם מודל מצוין ללמוד את תפקוד שרירים ומחלות. myopathies רב המשפיע תפקוד שרירי שלד ניתן במהירות להעריך בקלות דג זברה במהלך הימים הראשונים של עובר. ב -24 שעות לאחר ההפריה (hpf), דג הזברה wildtype ספונטני השרירים מתכווצים הזנב שלהם ועל ידי 48 hpf, התנהגויות שחייה מבוקר התערוכה דג הזברה. צמצום תדירות, או שינויים אחרים, תנועות אלה עשויים להצביע על תפקוד לקוי שרירי שלד. כדי לנתח את התנהגות שחייה וכדי להעריך את ביצועי שריר בפיתוח דג זברה מוקדם, אנו מנצלים, הוא בתגובת בריחה עוררת מגע מבחני תנועה.
מגע עורר מבחנים בתגובת בריחה יכולים לשמש כדי להעריך את ביצועי שריר במהלך פרקים קצרים פרץ וכתוצאה מהתכווצות של סיבי שריר מהיר עווית. בתגובה לגירוי חיצוני, אשר במקרה זה היא טפיחה עלראש, דג הזברה wildtype ב 2 ימים לאחר ההפריה (DPF) בדרך כלל מפגינים לשחות פרץ חזק, מלווה פניות חדות. השיטה שלנו מכמתת את תפקוד שרירי שלד על ידי מדידת האצה מקסימלית במהלך תנועה שחי פרץ, ההאצה להיות ביחס ישר את הכח הנוצר על ידי התכווצות שרירים.
בניגוד לכך, מבחני תנועה במהלך התפתחות זחל דג זברה מוקדם משמשים כדי להעריך את ביצועי שריר בתקופות מתמשכות של פעילות שרירה. באמצעות מערכת מעקב כדי לפקח על התנהגות שחייה, נקבל חישוב אוטומטי של תדירות הפעילות ומרחק דג זברה ישנה ל- 6 ימים, רעיוני של תפקוד שרירי השלד שלהם. מדידות של ביצועי שחייה הן בעלי ערך עבור הערכה פנוטיפי של מודלי מחלות הקרנת תפוקה גבוהה של מוטציות או טיפולים כימיים המשפיעות תפקוד שרירי שלד.
Introduction
במהלך דג הזברה בעשור האחרון שמש יותר ויותר ללמוד ביולוגיה של תא שריר ומחלות. הפיתוח החיצוני המהיר של עובר דג הזברה, בשילוב עם הבהירות האופטית שלה, מאפשר הדמיה הישירה של בניית שריר, צמיחה, ותפקוד. תהליך פיתוח שריר שמור ביותר דג זברה וזה אפשר דוגמנות המוצלחת של מגוון רחב של מחלות שרירים כוללים בניוון שרירים ו myopathies המולד 1-8. בחינה מדוקדקת של מודלי דג זברה לא ספקה רק תובנה רומן לתוך pathobiology תנאים אלה, אלא גם מספקת מצע שיאפשר הבדיקה של טיפולים מתאימים 6,9-13.
ניתוח מודלי דג זברה של מחלות שריר מסתמך על מבחנים אמינים לשחזור למדוד ביצועי שריר. מחקרים קודמים מדדו את יכולת יצירת כוח בהצלחה של שריר תא המטען דג הזברה בדגים בין 3 ל 7 DPF ידיבגירוי חשמלי התכווצות של דג משותק מחוברת מערכת התמרת כוח 14. זה יכול לספק מדידה מפורטת של כוח אבל הם לא אידיאלי ניסויי תפוקה גבוהים יותר ויש יתרונות למדידת ביצועים שרירים במהלך שחייה. בשעה 2 DPF שריר דג הזברה היא מתפקדת במלואה הדג יכול לעורר תנועות שחייה פרץ בתגובה לגירויים. את assay בתגובה בריחה מגע לעורר משמש למדידת תאוצה במהלך תנועה שחייה פרץ, אשר ניתן להשתמש בהם כאמצעי בכוח התכווצות.
אחד המדדים המנוצלים ביותר של תפקוד שרירים בחולי מיופתיה הוא מבחן 6 דקות הליכה, אשר מתעד את המרחק הכולל הלך על משטח שטוח קשה 15,16. יש לנו ליישם מבחן השוואה כדי למדוד את תפקוד שריר 6 DPF זחלי דג זברה, לפיה אנו עוקבים אחר המרחק הכולל ושחה, ואת המספר הכולל של תנועות שנעשו על ידי כל זחל על פני תקופה של 10 דקות. זו מבוצעתבאמצעות מערכת מעקב אוטומטית, אשר מספקת מדידות אמינות תפוקה גבוהה של ביצועי שריר. שתי הבדיקות שרירים הם מאוד לשחזור שימשו לכמת הבדלים בביצועי השריר במודלים מיופתיה דג הזברה 8.
Protocol
Representative Results
Discussion
רבי מודלים שונים של בעלי חיים כוללים עכברים, כלבים, דג זברה, זבובים ותולעים תרמו לכיוון הבנתנו את הבסיס הגנטי המולקולרי של מחלות שרירים, וסייעו בפיתוח גישות טיפוליות כדי להילחם בם. דג הזברה מתגאה מספר יתרונות לחקר מחלת שריר. דג הזברה מספקת מערכת manipulable גנטית להעריך דפוסים שרירים מורכבים בסביבה פיזיולוגית מתאימה, הדבר שאינו אפשרי במערכות בתרבות חוץ גופייה. בניגוד למודלים בעלי חיים בעלי חוליות אחרים, המספר הגדול של דגים מיוצרים, יחד עם הבהירות האופטית שלה, הופך לפשוט יותר מהירה, תפוקה גבוהה ב כימי vivo ו סריקות גנטיות.
כאן אנו מתארים את הפיתוח של מבחני תנועת דג זברה לספק תפוקה גבוהה שיטה אוטומטית כדי להעריך את ביצועי שריר במהלך embryogenesis דג הזברה. המבחנים הם יש להודות כי מקצבי יממהגירויים סביבתיים חיצוניים ישפיעו התנהגות שחי דג זברה באופן משמעותי 17,18. בדיקות חוזרות ונשנות של אותו דג הזברה גם תובלנה הרגלה וגרמו לצמצום בתגובת מישוש גירוי 23. לכן, על מנת להשיג תוצאות לשחזור בין ניסויים כל עובר דג זברה צריך להיבדק פעם אחת בלבד, בזמן תנאי היום ותאורה צריך להיות אחיד, וטמפרטורת מים צריך להיות מוסדרת בחוזקה.
באמצעות המגע עורר ניתוח ב -2 DPF אנו יכולים למדוד את התאוצה המרבית ישירות תובענה שחי פרץ, אשר עומדת ביחס לכוח שריר. טכניקות קודמות דג זברה בחנו כוח שריר על ידי קשירת שני הקצוות של העוברים באי ציוד ניסיוני אשר התכווצות שרירים מגורה באמצעות שדה חשמלי ואת יכולת כוח המניבה של השריר 14 נמדד. בעוד שיטה זו מודדת את כוח קיבולת ייצור של tהוא שריר הזחל, זה לא למדוד את הכח בפועל שנוצר על ידי שריר הזחל במהלך שחייה. לפיכך, אנו פתחנו שיטה בעקיפין להעריך את הכח שנוצר במהלך תנועת שחי זחל הנורמלית לספק מדד כולל של בריאות שרירים. מערכת הווידאו במהירות גבוהה, מסוגלת להקליט תנועות דג זברה בודדות בשיעור מסגרת של 1,000 מסגרות / שנייה יכולה לשמש כדי לזהות הבדלים קטנים אך משמעותיים בתפקוד שריר, אשר אינם שונים באופן ישיר על ידי עין. זה יהיה עניין לראות איך שדווח בעבר שינויים בכוח-דור גירוי חשמלי לתאם עם שינויים בביצועים שחייה.
בנוסף למגע עורר מבחני תגובה יכולים לשמש גם כדי להעריך קינמטיקה שחי, כמו צורה ומהירות גל הגוף במהלך התנועה שחי 24, לתת מדידת כמותית של התנהגות locomotory.
בשל התנועה הספונטנית של zebrafהזחלים ish לאחר 3 DPF, לא הצלחנו לבצע את מבחני-לעורר מגע למדוד את תפקוד השרירים. לעומת זאת, מדדנו ביצועים שרירים על פני תקופה ארוכה על ידי קביעה ושח המרחק ידי זחלי דג זברה ב 6 DPF. בדיקה זו, אם כי אמצעי עקיף של תפקוד השרירים, שניתן להשתמש בהם כדי לזהות דגים מוצגות ביצועים שריר לקוי 8 או ניוון מוחיים 25,26. בדיקה זו לא רק מספקת מדידה מקבילה במבחן 6 דקות ההליכה אבל מתאים גם תפוקה גבוהה אוטומטית מסכי סמים או mutagenesis vivo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
Materials
| 21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
References
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish. PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).
- Gupta, V., Kawahara, G., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
- Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency. Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).
- Sztal, T. E., Zhao, M., et al. Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function. Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).
- Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish. Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).
- Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. , (2005).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. (82), e50925 (2013).
- Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae. J Vis Exp. (77), (2013).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study. Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).
- Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish. Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).
- MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).
- Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies. Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).
- Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance. Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development. J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).
- Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics. PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).
- Moggio, M., Colombo, I., et al. Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge. Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).
