Met behulp van Touch-opgeroepen Response en Locomotion Testen om Muscle Prestaties en functie in zebravis Assess
Summary
Zebrafish are an excellent model to study muscle function and disease. During early embryogenesis zebrafish begin regular muscle contractions producing rhythmic swimming behavior, which is altered when the muscle is disrupted. Here we describe a touch-evoked response and locomotion assay to examine swimming performance as a measure of muscle function.
Abstract
Zebravis spierontwikkeling is sterk geconserveerd met zoogdier-systemen waardoor ze een uitstekend model om de spierfunctie en ziekte te bestuderen. Veel myopathieën beïnvloeden skeletspieren functie kan snel en eenvoudig worden beoordeeld in de zebravis gedurende de eerste paar dagen van de embryogenese. Door 24 uur na de bevruchting (HPF), wildtype zebravis spontaan samentrekken hun staart spieren en met 48 HPF, zebravis vertonen gecontroleerde zwemmen gedrag. Lagere frequentie van, of andere wijzigingen in kunnen deze bewegingen een skeletspier disfunctie geven. Zwemmen gedrag te analyseren en spier prestaties te beoordelen in de vroege ontwikkeling van de zebravis, maken we gebruik van zowel keer opgeroepen escape reactie en motoriek testen.
-Touch opgewekte ontsnapping respons assays kunnen worden gebruikt om de spier prestaties tijdens korte uitbarsting bewegingen als gevolg van inkrimping van de fast-twitch spiervezels te beoordelen. In reactie op een externe stimulus, die in dit geval is een tik ophet hoofd, wildkleur zebravis op 2 dagen na de bevruchting (DPF) vertonen typisch een krachtige uitbarsting zwemmen, begeleid door scherpe bochten. Onze methode kwantificeert skeletspierfunctie door meting van de maximale versnelling tijdens een burst zwembeweging, de versnelling die recht evenredig met de kracht die door spiercontractie.
In tegenstelling, zijn motoriek testen tijdens de vroege zebravis larvale ontwikkeling gebruikt om de spier prestaties te beoordelen tijdens langdurige periodes van spieractiviteit. Met een tracking systeem zwemgedrag volgen, verkrijgen wij een geautomatiseerde berekening van de frequentie van de activiteit en afstand in 6 dagen oude zebravis, reflecterende hun skeletspierfunctie. Metingen van het zwemmen uitvoering zijn waardevol voor fenotypische beoordeling van ziektemodellen en high-throughput screening van mutaties of chemische behandelingen beïnvloeden skeletspierfunctie.
Introduction
In het afgelopen decennium zebravis zijn steeds meer gebruikt om spieren celbiologie en ziekte te bestuderen. De snelle ontwikkeling van de externe zebravis embryo, in combinatie met de optische helderheid, kan de directe visualisatie van de spier vorming, groei en functie. Het proces van spierontwikkeling is sterk geconserveerd in zebravis en dit heeft de succesvolle modellering van diverse spierziekten zoals spierdystrofie en congenitale myopathieën 1-8 toegestaan. Gedetailleerd onderzoek van de zebravis modellen niet alleen voorzien van nieuwe inzichten in de pathobiologie van deze voorwaarden, maar ook een platform voor het testen van geschikte therapieën 6,9-13.
De analyse van de zebravis modellen van spierziekten is gebaseerd op betrouwbare en reproduceerbare assays om spieren te meten. Eerdere studies zijn erin geslaagd de kracht genererende vermogen van de zebravis Rompspieractiviteit in vis tussen 3 en 7 DPF doorhet elektrisch stimuleren contractie van stilstaande vis bevestigd aan een kracht transductiesysteem 14. Dit kan gedetailleerde metingen van kracht verschaffen maar zijn niet ideaal voor hogere doorvoer experimenten en er voordelen aan het meten spierprestaties tijdens het zwemmen. Op 2 DPF zebravis spier is volledig functioneel en de vis kan burst zwembewegingen wekken in reactie op prikkels. Het aanraakgevoelige roepen escape response test wordt gebruikt om acceleratie tijdens een burst zwembeweging, die kan worden gebruikt als een maat van de contractiekracht.
Een van de meest gebruikte maatregelen van spierfunctie in myopathie patiënten de 6 minuten looptest, die registreert de totale afstand gelopen op een hard vlak oppervlak 15,16. We hebben een vergelijkbare test om spierfunctie te meten toegepast in 6 DPF zebravis larven, waarbij we toezicht op de totale afstand gezwommen, en het totale aantal bewegingen van elke larve gedurende een periode van 10 min. Dit gebeurtbehulp van een geautomatiseerd volgsysteem, dat betrouwbaar en zeer snelle metingen van spierprestaties bepaalt. Beide spiertests zijn zeer reproduceerbaar en zijn gebruikt om verschillen in spierprestaties in zebravis myopathie modellen 8 kwantificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veel verschillende diermodellen zoals muizen, honden, zebravis, vliegen en wormen hebben bijgedragen aan ons begrip van de genetische en moleculaire basis van spierziekten en geholpen bij de ontwikkeling van therapeutische benaderingen te bestrijden. De zebravis biedt een aantal voordelen bij de bestudering van spierziekte. De zebravis biedt een genetisch manipuleerbaar systeem complexe patronen spier beoordelen in een geschikte fysiologische omgeving, die in vitro kweeksystemen onmogelijk is. In tegenstelling tot andere gewervelde diermodellen, het grote aantal vissen, tezamen met zijn optische helderheid, maakt snelle, hoge verwerkingscapaciteit in vivo chemische en genetische screening.
Hier beschrijven wij de ontwikkeling bij de zebravis beweging assays een hoge doorvoer en geautomatiseerde methode om spierprestaties beoordelen tijdens zebravis embryogenese verschaffen. Voor beide tests moet worden erkend dat circadiane ritmes enexterne prikkels uit de omgeving zal significante invloed op de zebravis zwemgedrag 17,18. Herhaalde tests van dezelfde zebravis zal ook leiden tot gewenning hetgeen voor een reactie op de tactiele stimulus 23. Daarom, om reproduceerbare resultaten te bereiken tussen experimenten elk zebravisembryo mag slechts eenmaal getest, het tijdstip van de dag en lichtomstandigheden worden gestandaardiseerd en watertemperatuur moet strak gereguleerd.
Het aanraakscherm opgeroepen analyse op 2 dpf we direct de maximale versnelling van een burst zwemactie, dat evenredig is met spierkracht kan meten. Previous technieken zebravis hebben spierkracht onderzocht door binden de beide uiteinden van de embryo experimentele apparatuur waarna spiercontractie gestimuleerde gebruikt een elektrisch veld en de kracht genererende vermogen van de spier 14 wordt gemeten. Hoewel deze methode meet de kracht genererende capaciteit van tHij larvale spier, is het niet meten van de werkelijke kracht die door de larvale spieren tijdens het zwemmen. We ontwikkelden ook een werkwijze om indirect beoordelen van de kracht die tijdens de normale larvale zwembeweging een algehele mate van gezondheid spier verschaffen. De high-speed video-systeem, geschikt voor het opnemen afzonderlijke zebravis bewegingen een framesnelheid van 1000 frames / sec kan worden gebruikt om kleine maar significante verschillen in spierfunctie, die niet direct te onderscheiden met het blote oog te identificeren. Het zal interessant zijn om te zien hoe eerder gerapporteerde wijzigingen in de elektrisch gestimuleerde kracht generatie correleren met veranderingen in het zwemmen prestaties.
Bovendien opgewekte TOUCH op assays kunnen ook worden gebruikt om zwemmen kinematica, zoals de vorm en de snelheid van het lichaam golf tijdens de zwembeweging 24 beoordelen, een kwantitatieve meting van het motorisch gedrag.
Door de spontane beweging van zebrafish larven na 3 DPF, waren we niet in staat om de touch-oproepen testen uit te voeren om de spierfunctie te meten. Omgekeerd, meten we de spier prestaties over een langere periode door het bepalen van de afstand gezwommen door zebravis larven op 6 dpf. Deze test Hoewel een indirecte maat voor spierfunctie, kan worden gebruikt om vis te tonen verminderde spierfunctie 8 of neurodegeneratie 25,26 identificeren. Deze test geeft niet alleen een meting analoog aan de 6 minuten looptest maar is ook geschikt voor geautomatiseerde high-throughput drug in vivo mutagenese of schermen.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Viewpoint for their kind sponsorship of this manuscript. This work was funded by an Australian National Health and Medical Research Council (NHMRC) Project Grant (APP1010110).
Materials
| 21G X 1' Blunt Needle | Terumo/Admiral Medical Supplies | TE2125 | |
| 48-well plates | Sigma | M8937 | |
| 90mm Petri Dishes | Pacific Laboratory Products PT | S90001 | |
| High Speed Camera | Baumer | HXC20 | |
| http://www.randomization.com | N/A | Steps 1.1.2, 2.1.3 | |
| Incubator | Thermoline Scientific | TEI-43L | |
| Plastic Pipette | VWR | 16001-188 | |
| StreamPix5 | NorPix | Step 1.2.3 | |
| Temperature Control Unit | Viewpoint | ||
| Tweezers, style 8 | ProSciTech | T04-821 | |
| Zebrabox System | Viewpoint | ||
| Zebralab | Viewpoint | Steps 1.3.1, 2.2.1 |
References
- Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).
- Gupta, V. A., Kawahara, G., et al. A splice site mutation in laminin-α2 results in a severe muscular dystrophy and growth abnormalities in zebrafish. PLoS ONE. 7 (8), e43794 (2012).
- Gupta, V., Kawahara, G., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20 (9), 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci. 108 (13), 5331-5336 (2011).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model & Mech. 5 (3), 389-396 (2012).
- Ruparelia, A. A., Oorschot, V., Vaz, R., Ramm, G., Bryson-Richardson, R. J. Zebrafish models of BAG3 myofibrillar myopathy suggest a toxic gain of function leading to BAG3 insufficiency. Acta Neuropathol. 128 (6), 821-833 (2014).
- Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle. Hum Mol Genet. 21 (21), 4718-4731 (2012).
- Sztal, T. E., Zhao, M., et al. Zebrafish models for nemaline myopathy reveal a spectrum of nemaline bodies contributing to reduced muscle function. Acta Neuropathol. 130 (3), 389-406 (2015).
- Pichler, F. B., Laurenson, S., Williams, L. C., Dodd, A., Copp, B. R., Love, D. R. Chemical discovery and global gene expression analysis in zebrafish. Nat Biotechnol. 21 (8), 879-883 (2003).
- Peterson, R. T., Shaw, S. Y., et al. Chemical suppression of a genetic mutation in a zebrafish model of aortic coarctation. Nat Biotechnol. 22 (5), 595-599 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem Bioph Res Co. 413 (2), 358-363 (2011).
- Zon, L. I., Peterson, R. T. In vivo drug discovery in the zebrafish. Nat Rev Drug Discov. , (2005).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. (82), e50925 (2013).
- Sloboda, D. D., Claflin, D. R., Dowling, J. J., Brooks, S. V. Force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae. J Vis Exp. (77), (2013).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy. Muscle Nerve. 41 (4), 500-510 (2010).
- McDonald, C. M., Henricson, E. K., et al. The 6-minute walk test and other clinical endpoints in duchenne muscular dystrophy: reliability, concurrent validity, and minimal clinically important differences from a multicenter study. Muscle Nerve. 48 (3), 357-368 (2013).
- Hurd, M. W., Debruyne, J., Straume, M., Cahill, G. M. Circadian rhythms of locomotor activity in zebrafish. Physiol Behav. 65 (3), 465-472 (1998).
- MacPhail, R. C., Brooks, J., Hunter, D. L., Padnos, B., Irons, T. D., Padilla, S. Locomotion in larval zebrafish: Influence of time of day, lighting and ethanol. Neurotoxicology. 30 (1), 52-58 (2009).
- Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish. J Cell Mol Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Bioph Res Co. 423 (4), 785-788 (2012).
- Ravenscroft, G., Jackaman, C., et al. Mouse models of dominant ACTA1 disease recapitulate human disease and provide insight into therapies. Brain. 134 (4), 1101-1115 (2011).
- Ravenscroft, G., Wilmshurst, J. M., et al. A novel ACTA1 mutation resulting in a severe congenital myopathy with nemaline bodies, intranuclear rods and type I fibre predominance. Neuromuscular Disord. 21 (1), 31-36 (2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Müller, U. K., van Leeuwen, J. L. Swimming of larval zebrafish: ontogeny of body waves and implications for locomotory development. J Exp Biol. 207 (Pt 5), 853-868 (2004).
- Cheng, W., Tian, J., Burgunder, J. M., Hunziker, W., Eng, H. L. Myotonia congenita-associated mutations in chloride channel-1 affect zebrafish body wave swimming kinematics. PLoS ONE. 9 (8), e103445 (2014).
- Moggio, M., Colombo, I., et al. Mitochondrial disease heterogeneity: a prognostic challenge. Acta Myol. 33 (2), 86-93 (2014).
