تصميم واستخدام ومنخفضة التكلفة، الآلي Morbidostat عن التكيف تطور البكتيريا تحت المضادات الحيوية اختيار الدواء
Summary
We describe a low cost, configurable morbidostat that enables the characterization of antibiotic drug resistance by dynamically adjusting the drug concentration. The device can be integrated with a multiplexed microfluidic platform. The approach can be scaled up for laboratory antibiotic drug resistance studies.
Abstract
نحن تصف منخفضة التكلفة، morbidostat شكلي لوصف المسار التطوري للمقاومة المضادات الحيوية. وmorbidostat هو جهاز ثقافة البكتيرية التي تراقب باستمرار نمو البكتيريا وضبط تركيز الدواء للطعن في البكتيريا باستمرار لأنها تتطور لاكتساب المقاومة للأدوية بشكل حيوي. ويتميز الجهاز بحجم العمل ~ 10 مل ومؤتمتة بالكامل ومجهزة قياس الكثافة الضوئية والمضخات الصغيرة المتوسطة وتسليم المخدرات. للتحقق من صحة منصة، قمنا بقياس الاستحواذ التدريجي من المقاومة ميثوبريم في القولونية MG 1655، ودمج الجهاز مع منصة ميكروفلويديك المضاعفة للتحقيق في مورفولوجيا الخلايا والتعرض للمضادات الحيوية. النهج يمكن أن تصل إلى تحجيم الدراسات المختبرية من مقاومة الجراثيم للأدوية المضادات الحيوية، وهو للتمديد لالتكييفية تطور لتحسين السلالة في الهندسة الأيضية وغيرها من تجارب زراعة البكتيرية.
Introduction
منذ إدخال أول البنسلين المخدرات المضادات الحيوية، وقد وضعت المقاومة للمضادات الحيوية الميكروبية إلى مشكلة صحية عالمية 1. على الرغم من أن اكتساب مقاومة للمضادات الحيوية يمكن دراستها بأثر رجعي في الجسم الحي، وغالبا ما لا تسيطر على ظروف هذه التجارب في جميع أنحاء تطور كامل 2. بدلا من ذلك، يمكن أن تطور مختبر التكيف تكشف عن التطور الجزيئي من الأنواع الميكروبية في ظل الضغوط البيئية أو ضغط اختيار من الدواء المضاد 3. في الآونة الأخيرة، وإجمال العديد من التجارب التطورية تسيطر عليها بشكل جيد لمقاومة المضادات الحيوية في ظهور مقاومة الجراثيم للأدوية المضادات الحيوية. على سبيل المثال، أظهرت مجموعة أوستن الظهور السريع في ميكروفلويديك هندسيا بشكل صحيح بيئة compartmented 4. وmorbidostat وضعت مؤخرا يدفع الطفرات منتظمة تحت المخدرات اختيار ضغط 5،6. وmorbidostat، وSELEC الميكروبيجهاز نشوئها باستمرار على تعديل نسبة تركيز المضادات الحيوية للحفاظ على عدد السكان ثابتا تقريبا، يمثل تقدما كبيرا من الاختبار تذبذب المستخدمة في علم الأحياء المجهرية 7،8. في اختبار التذبذب، يتم حقن الدواء المضاد في تركيز عال، ويتم فحص المسوخ على قيد الحياة وفرزها. بدلا من ذلك، الميكروبات في morbidostat وتحدى باستمرار، والحصول على طفرات متعددة.
وmorbidostat تعمل على غرار ناظم كيميائي، جهاز الثقافة التي اخترعها نوفيك وSzliard في عام 1950 التي تحافظ على السكان المستمر من خلال توفير المواد الغذائية بشكل مستمر في حين تمييع الميكروبي السكان 9. منذ بدء العمل به، وقد تقدمت وناظم كيميائي وتحسينها. وقد وصلت chemostats ميكروفلويديك الحالية نانولتر وحيدة الخلية القدرات. ومع ذلك، وهذه الأجهزة هي غير صالحة للتجارب التطور على التكيف، والتي تتطلب السكان خلية كبيرة مع العديد من الأحداث طفرة 10،11. في الآونة الأخيرة، مصغرةكما تم تطوير chemostats مع وحدات التخزين عمل ~ 10 مل لملء الفجوة بين المفاعلات الحيوية على نطاق ولتر وميكروفلويديك ناظم كيميائي 12،13.
هنا نقدم تصميم واستخدام منخفضة التكلفة، morbidostat الآلي لدراسة مقاومة المضادات الحيوية. وحدة المقترحة يمكن استخدامها في حاضنة شاكر في مختبر علم الأحياء المجهرية مع متطلبات الأجهزة الحد الأدنى. وأيضا مصممة الثابتة المصدر المفتوح بسهولة إلى تطبيقات محددة من تطور على التكيف، مثل الهندسة الأيضية 3. وأخيرا، تم دمج morbidostat إلى منصة ميكروفلويديك المضاعفة لاختبار الحساسية للمضادات الحيوية 14.
Protocol
Representative Results
Discussion
وأظهر الجهاز morbidostat البصمة المنخفضة من مكونات منخفضة التكلفة. الزيادات في مستوى مقاومة الجراثيم للأدوية المسجلة من قبل الجهاز متوافقة مع تلك التقارير السابقة 5. مصممة للدراسات التطورية للمقاومة المخدرات، والجهاز هو الواجب التطبيق المحتمل لكثير من التجارب الأ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Sze-Bi Hsu and Ms. Zhenzhen for useful discussions and help in the theoretical analysis and numerical simulation. Y. T. Y. would like to acknowledge funding support from the Ministry of Science and Technology under grant numbers MOST 103-2220-E-007-026 and MOST 104-2220-E-007-011, and from the National Tsing Hua University under grant numbers 103N2042E1, 104N2042E1, and 105N518CE1.
Materials
| Environmental Shaker Incubator | BioSan | ES-20 | |
| Arduino Leonardo board | Arduino | Leonardo | |
| 680 Ohm Carbon Resistor | Digikey | Bias resistor for LED | |
| 100k Ohm Carbon resistor | Digikey | Bias resistor for phototransistor | |
| 940 nm light emitting diode | Bright LED Electronic | BIR-BM13E4G-2 | Optical density measurement |
| 940 nm phototransistor | Kodenshi | ST-2L2B | Optical density measurement |
| Darlington pair IC Toshiba | Mouser | ULN2803APG | this IC drives micropumps and magnetic stirring unit |
| 5V DC brushless fan | ADDA | AD0405LX-G70 | spec: 5V supply voltage and 80mA available www.jameco.com |
| Piezoelectric micropump | CurieJet | PS15I-FT-5L | Pressure >3kPa Flow rate >5 ml/min |
| Tygon 3350 Tuning | Saint Gobain | ABW00001 | ID: 1/32" OD: 3/32" L:50' |
| Magnetic Stir bar | COWIE | tapered shape dim: 10 mm x 4mm | |
| Glass scintillation 20ml vial | DGS | Pyrex glass 28mm(dia.)x 61 mm(h) | |
| Culture vial holder | Custom made from Polyformaldehyde | ||
| Silicone | Dow Corning | Sylgald 184 | used to seal the glass vial |
| Medium bottle | VWR | 66022-065 | |
| Difco M9 minimal salt 5x | BD | Medium | |
| Cadamino Acid | BD | Medium | |
| glucose | Sigma | ||
| Agar Bateriological | Oxoid | for agar plate | |
| Luria Bertani medium | |||
| Inverted microscope | Leica Microsystems | Leica DMI-LED | used for microfluidic measurement Use X40 objective NA=0.55 |
| Microscope Incubator | Live Cell Instrument | CU-109 | used for microfluidic measurement |
| Solenoidal valves | Pneumadyne | S10MM-31-12-3 | Normally open 1.3 Watt 12 Vdc |
| USB interface card | Hobby Engineering | USBIO24-R Digital I/O Module | for microfluidics measurement |
| Air compressor | Rocker Scientific | ROCKER 440 | Pressure source for microfluidcs Max. Pressure 80 Psi |
| Male luer-lock fittings to 1/8" barb | ValuePlastics.com | MTLL230-1 | used for microfluidic control |
| 1/8" barb to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | B-1 | used for microfluidic control |
| Female luer-lock fittings to 10-32 threaded port | ValuePlastics.com | KFTL-1 | used for microfluidic control |
| NPN darlington transistor 500mA, 40V (2N6427) | DigiKey.com | 2N6427GOS-ND | used for microfluidic control |
| 10kOhm, carbon film resistor, 0.25W | DigiKey.com | P10KBACT-ND | used for microfluidic control |
| Tantalum capacitor, 10uF, 25V, 10% | DigiKey.com | 478-1841-ND | used for microfluidic control |
| Andor CCD camera | Andor | Zyla 4.2 Plus SCMOS | used for microfluidic on chip imaging |
| ELISA plate reader | |||
| two component Silicone | Momentive | RTV 615 | used for microfluidic chip fabrication |
| SU-8 photoresist | Micrchem | SU8 2015 | used for microfluidic chip fabrication |
| AZ4620 photoresist | Clariant | AZ 4620 | used for microfluidic chip fabrication |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC 32G | used for microfluidic chip fabrication |
| 20 Gauge Syringe Needle | BD | used for microfluidic chip fabrication | |
| Labcycler | Sensoquest | Labcycler | PCR |
| DNA polymerase | Toyobo | KDO Plus | PCR amplification |
| Trimethoprim | Sigma | ||
| Plate reader | Biotek | Synergy H1 hybrid | antibiotic resistane measurement |
References
- Levy, S. B., Marshall, B. Antibiotic resistance worldwide: causes, challenges, and responses. Nat. Med. 10, s122-s129 (2004).
- Wang, M. M., et al. Tracking the in vivo evolution of multidrug resistance in Staphylococus aureus by whole genome sequencing. Pro. Natl. Acad. Sci. 104, 9451 (2007).
- Dragosits, M., Mattanovich, D. Adaptive laboratory evolution – principles and applications for biotechnology. Microbial Cell Factory. 12, 64 (2013).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironment. Science. 333, 1764-1767 (2011).
- Toprak, E., Veres, A., Michel, J. B., Chait, R., Hartl, D. L., Kishony, R. Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection. Nature Genetics. 44, 101-106 (2012).
- Toprak, E., et al. Building a morbidostast: an automated continuous culture device for studying bacterial drug resistance under dynamically sustained drug inhibition. Nature Protocol. 8, 555-567 (2013).
- Rosenthal, A. Z., Elowitz, M. B. Following evolution of bacterial antibiotic resistance in real time. Nature Genetics. 44, 11-13 (2012).
- Young, K. In vitro antibacterial resistance selection and quantitation. Curr Protoc Pharmacol. , (2006).
- Novick, A., Szilard, L. Experiments with the Chemostat on spontaneous mutations of bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 36, 708-719 (1950).
- Balagadde, F. K., You, L., Hansen, C. L., Arnold, F. H., Quake, S. R. Long-term monitoring of bacteria undergoing programmed population control in a microchemostat. Science. 309, 137-140 (2005).
- Groisman, A., et al. A microfluidic chemostat for experiments with bacterial and yeast cells. Nat. Methods. 2, 685-689 (2005).
- Miller, A. W., Befort, C., Kerr, E. O., Dunham, M. J. Design and Use of Multiplexed Chemostat Arrays. J. Vis. Exp. (72), e50262 (2013).
- Takahashi, C. N., Miller, A. W., Ekness, F., Dunham, M. J., Klavins, E. A low cost, customizable turbidostat for use in synthetic circuit characterization. ACS Synthetic Biology. , (2015).
- Mohan, R., et al. A multiplexed microfluidic platform for rapid antibiotic susceptibility testing. Biosens Bioelectrons. 49, 118-125 (2013).
- Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Kellogg, R. A., Gomez-Sjoberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. . Nat. Protocols. 9, 1713 (2014).
- Gu, G. Y., Lee, Y. W., Chiang, C. C., Yang, Y. T. A nanoliter microfluidic serial dilution bioreactor. Biomicrofluidics. 9, 044126 (2015).
- Gonzalez, R. C., Woods, R. E., Eddins, S. L. . Digital image using Matlab processing. , (2004).
- Heikkila, E., Sundstrom, L., Huovinen, P. Trimethoprim resistance in Escherichia coli isolates from a geriatric unit. Antimicrob. Agents Chemother. 34, 2013-2015 (1990).
- Flensburg, J., Skold, O. Massive overproduction of dihydrofolate reductase in bacteria as a response to the use of trimethoprim. Eur. J. Biochem. 162, 473-476 (1987).
- Ohmae, E., Sasaki, Y., Gekko, K. Effects of five-tryptophan mutations on structure, stability and function of Escherichia coli dihydrofolate reductase. J. Biochem. 130, 439-447 (2001).
- Smith, D. R., Calvo, J. M. Nucleotide sequence of dihydrofolate reductase genes from trimethoprim-resistant mutants of Escherichia coli. Evidence that dihydrofolate reductase interacts with another essential gene product. Mol. Gen. Genet. 187, 72-78 (1982).
- Okumus, B., Yildiz, S., Toprak, E. Fluidic and microfluidic tools for quantitative systems biology. Curr Opin Biotech. 25, 30-38 (2014).
- Cho, J., et al. A rapid antimicrobial susceptibility test based on single-cell morphological analysis. Sci. Transl. Med. 17, 267 (2014).
- Hsu, S. B., Waltman, P. E. Analysis of a model of two competitors in a chemostat with an external inhibitor. SIAM J. Applied Math. , 528-540 (1992).
- Fu, W., et al. Maximizing biomass productivity and cell density of Chlorella vulgaris by using light-emitting diode-based photobioreactor. J. Biotech. 161, 242-249 (2012).
- Peabody, V. G. L., Winkler, J., Kao, K. C. Tools for developing tolerance to toxic chemicals in microbial systems and perspectives on moving the field forward and into the industrial setting. Curr Opin in Chem Eng. 6, 9-17 (2014).
