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生物学

Détection des formes modifiées de Cytosine Utilisation Sensible immunohistochimie

Published: August 16, 2016
doi:
10.3791/54416
, , , ,
1Laboratoire de Neurophysiologie (CP601), ULB Neuroscience Institute (UNI),Université Libre de Bruxelles, 2Medical Molecular Sciences, Centre for Biomolecular Sciences,University of Nottingham, 3School of Life Sciences,University of Nottingham, 4Division of Cancer and Stem Cells, Centre for Biomolecular Sciences, School of Medicine,University of Nottingham

Summary

Herein we describe a sensitive immunochemical method for mapping the spatial distribution of 5mC oxidation derivatives based on the use of peroxidase-conjugated secondary antibodies and tyramide signal amplification.

Abstract

Methylation of cytosine bases (5-methylcytosine, 5mC) occurring in vertebrate genomes is usually associated with transcriptional silencing. 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC) are the recently discovered modified cytosine bases produced by enzymatic oxidation of 5mC, whose biological functions remain relatively obscure. A number of approaches ranging from biochemical to antibody based techniques have been employed to study the genomic distribution and global content of these modifications in various biological systems. Although some of these approaches can be useful for quantitative assessment of these modified forms of 5mC, most of these methods do not provide any spatial information regarding the distribution of these DNA modifications in different cell types, required for correct understanding of their functional roles. Here we present a highly sensitive method for immunochemical detection of the modified forms of cytosine. This method permits co-detection of these epigenetic marks with protein lineage markers and can be employed to study their nuclear localization, thus, contributing to deciphering their potential biological roles in different experimental contexts.

Introduction

Méthylation des bases cytosine dans l' ADN (5mC) représente une marque épigénétique majeur trouvé dans les vertébrés génomes associés à la transcription taire 1. 5mC est introduite et maintenue par les ADN méthyltransférases 2-5, et il a été démontré que pour jouer des rôles importants dans un certain nombre de processus biologiques , y compris l' empreinte génomique, inactivation du chromosome X, la différenciation cellulaire, et le développement 3, 6. Par conséquent, la perturbation de la 5mC motifs génomiques est associé à un certain nombre de maladies 7, 8-11. Malgré les progrès dans la compréhension de rôle 5mC dans le développement et la maladie, il est encore largement inconnue reste comment cette marque est enlevée dans le développement et les tissus adultes. Plusieurs mécanismes potentiels de déméthylation de l' ADN ont été proposées récemment , y compris des mécanismes actifs et passifs déméthylation 12, 13, 14, 15. Découverte des produits de 5mC oxydation séquentielle médiées par dix à onze translocation enzymes (TET1 / 2/3) de telle sorte que le 5-hydroxylmethylcytosine (5hmC), 5 formylcytosine (5FC) et 5 carboxylcytosine (5caC) dans eucaryote ADN 16, 17, 18, ​​19 a incité les spéculations si elles peuvent servir d'intermédiaires de processus de déméthylation d'ADN ou des marques épigénétiques agissent comme stables dans leur propre droit 13. Pendant que la démonstration que le composant de la base de réparation de l' excision, la thymine ADN-glycosylase (TMD) peut lier et supprimer à la fois 5FC et 5caC à partir d' ADN 19, 20 suggère un rôle pour les dérivés 5mC modifiés dans une déméthylation d'ADN actif. Des données récentes montrant que 5FC / 5caC peut moduler le taux de points de processivité ARN II à la participation potentielle de ces marques dans la régulation transcriptionnelle 29. En raison de cette importance biologique potentiel des formes oxydées de 5mC, une gamme de techniques biochimiques et d' anticorps à base ont été employées pour étudier leur distribution génomique et le contenu global 16, 19-24.

Étant donné que la plupart des til vertébré les organes sont constitués de différents types de cellules et que la distribution des bases cytosine modifiée est un tissu et le type de cellule spécifique 16-18, 20, 23, 25-27, pour déterminer la distribution spatiale des dérivés 5mC oxydées dans différents tissus devient importante expérimentale tâche nécessaire pour dévoiler leurs fonctions biologiques. La plupart des approches biochimiques et d'anticorps à base ne fournissent aucune information spatiale en ce qui concerne la répartition des formes modifiées de 5mC dans différents tissus et types de cellules. En revanche, les techniques d'immunochimie base peuvent fournir un outil rapide pour l' évaluation de la distribution spatiale et la localisation nucléaire de 5mC 28 et ses dérivés oxydés 20. Cela est dit, la très faible abondance déclarée de 5FC (20 dans chaque 10 6 cytosine) et 5caC (3 dans chaque 10 6 cytosine) dans le génome de la souris 18 représente un défi important pour l' immunochimie standard.

Ici,Nous décrivons un procédé immunochimique très sensible qui fournit robuste et une détection rapide de la forme oxydée de la cytosine dans le tissu cérébral de mammifère. En incorporant des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase couplée à une étape d'amplification de signal, ce procédé évite les difficultés de la détection des très faibles quantités de 5FC et 5caC. En outre, cette technique peut être utilisée pour détecter les co-formes modifiées de la cytosine avec des marqueurs spécifiques de la lignée, complétant efficacement d'autres approches pour élucider les fonctions biologiques de ces marques épigénétiques.

Protocol

Toutes les procédures d'animaux impliqués ont été effectuées en conformité avec l'éthique comité d'examen de l'Université de Nottingham. 1. Sélection de la préparation des tissus Convient pour immunocoloration Générer section de paraffine d'embryons CD1 souris de type sauvage et les tissus du cerveau adulte , comme décrit précédemment 25. Utiliser des coupes de tissus cérébraux fixes soit avec 4% de formaldehyde (FA) , soit 4% de paraformaldehyde (PFA) pour le procédé 25 d' immunocoloration. NOTE: L'utilisation de sections de tissus de paraffine nécessite de-épilation avant l'étiquetage des anticorps. Étant donné que le traitement avec 2-4 M d'acide chlorhydrique (HCl) utilisé dans le protocole pour l'ADN dénaturant est pas compatible avec la plupart des stratégies de recherche d'antigène, nous recommandons l'utilisation soit sections cryo ou microtome pour co-détection de dérivés d'oxydation 5mC avec des protéines des feutres. 2. Dewaxing paraffiniques coupes de tissus incluses < / P> Dans une enceinte de sécurité classe II en marche, laver la paraffine sections de tissu noyées dans une jarre de Coplin rempli de xylène, 2 fois pendant 10 minutes chacune à la température ambiante. NOTE: Il est important d'utiliser le xylène frais comme une élimination incomplète de la paraffine peut conduire à des motifs de coloration incompatibles. Après de-épilation à la cire, réhydrater rapidement les coupes de tissus par lavage consécutivement dans 95, 75, et 50% d'éthanol pendant 10 minutes chacun à RT. 3. Fixation et perméabilisation de Cryo et Sections Microtome Fixer les coupes de tissus réhydratés en les plaçant dans les deux froid de la glace 4% PFA ou 4% FA pendant 15 min à température ambiante. Éliminer l'excès de fixatif par lavage des coupes dans du PBS (solution saline de tampon phosphate) pendant 5 min à température ambiante. Perméabiliser les coupes de tissu en plaçant dans une jarre de Coplin remplie d'autocommutateur privé (0,5% de Triton X-100 dans du PBS) pendant 30 min à température ambiante. Enlever l'excès PBX en lavant les sections peu en PBT (0,01% de Tween 20 dans du PBS). jove_title "> 4. immunocoloration pour Oxi-5mC Dérivés Placer les sections perméabilisées dans du HCl 2 N pendant 60 minutes à la température ambiante pendant une dépurination de l'ADN. NOTE: Bien que des concentrations plus élevées de HCl (par exemple, 4 N) conduisent à une dénaturation de l' ADN plus efficace, ils ne sont pas compatibles pour la co-détection de oxi-Mcs avec DAPI. Placer les sections dans 10 mM de Tris-HCl (pH 8,5) pendant 30 min à température ambiante pour neutraliser le HCl. Sinon, laver les sections trois fois pendant 5 minutes chacun dans du PBS. Incuber les sections dans PBT pendant 5 min à température ambiante. Retirez délicatement le liquide de la zone entourant la section de tissu sans laisser la section de tissu pour sécher complètement à toute étape en agitant doucement la diapositive. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour encercler la section sans toucher la section. NOTE: Le stylo barrière hydrophobe réduit la quantité d'anticorps nécessaire pour teindre le tissu et peut permettre à de multiples sections d'être colorées avec différent anticorps sur la même diapositive. Incuber sections dans 100 ul de solution de blocage (10% d 'albumine de sérum bovin dans du PBS) pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humide. REMARQUE: sauter cette étape ne serait pas affecter l'efficacité de la coloration des bases cytosine modifiés. Incuber les coupes de tissus dans 100 pl d'une dilution 1: 5000 d'anticorps monoclonal de souris anti-5hmC et 1: 1000 dilution des anticorps primaires de lapin polyclonal anti-5caC dans une solution de blocage pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humide. Vous pouvez également effectuer l'incubation d'une nuit à 4 ° C si nécessaire. NOTE: Les sections traitées sans anticorps primaires peuvent servir de témoins négatifs appropriés pour la procédure de coloration. Les 12,5 jours après sections embryonnaires murines coïtum cérébrales enrichies en 5caC, 5FC et 5hmC 20 peut être utilisé comme témoin positif. Retirer les anticorps en excès par lavage des sections dans un bocal rempli de Coplin PBT trois fois pendant 5 min chacun dans un Copjar lin à la température ambiante. NOTE: L' augmentation du volume des solutions de lavage peut réduire la coloration de fond. Enlever l'excès de PBT et, si nécessaire, encercler les sections à nouveau avec le stylo barrière hydrophobe PBT contiennent un détergent qui peut affaiblir la barrière hydrophobe. Faire une dilution 1: 400 d'anticorps conjugué à HRP de chèvre anti-lapin et une dilution 1: 400 d'âne anti-souris conjuguée à l'anticorps 555 dans une solution de blocage. Incuber les coupes de tissus dans 100 pl d' un mélange d'anticorps secondaire à l' étape 4.9 pendant 1 heure à température ambiante dans une chambre humide. Laver les coupes de tissus dans un bocal de Coplin remplie de PBT trois fois pendant 5 minutes à chaque fois à température ambiante. Placer les coupes de tissus dans 100 pl d'une dilution 1: 200 de tyramide dans le tampon d'amplification du signal tyramide pendant 2 minutes à la température ambiante. Immédiatement, éliminer la solution de tyramide excès par lavage des lames trois fois pendant 5 minutes dans chacune des PBT. carefully enlever l' excès de PBT et couvrir immédiatement les sections avec une goutte d'un milieu de montage (voir la liste des matériaux). Placez délicatement une lamelle sur les coupes de tissus et sceller immédiatement la lamelle avec du vernis à ongles. Stocker les coupes de tissus à 4 ° C pendant plusieurs heures avant l'examen microscopique. Examinez au microscope à fluorescence à 405, 488 et / ou 555 nm (10 – 40X).

Representative Results

Pour déterminer la répartition des 5hmC dans des coupes de tissus du cerveau, nous avons effectué des co-détection de cette modification épigénétique avec un marqueur pour les neurones post-mitotiques, NeuN, employant des anticorps 5hmC anti- commerciale qui interagit spécifiquement avec cette marque, mais pas avec d'autres formes de modification cytosine 20, 25. l' analyse immunohistochimique de 5hmC et 5caC distributions dans le cerveau adulte a révélé que , si la coloration 5hmC importante de co-localise avec les cellules positives NeuN, les cellules gliales NeuN négatives possèdent des niveaux inférieurs de 5hmC génomique (figure 1) 20. Nous avons récemment montré que l' oxydation 5mC Tet-dépendante est active pendant la spécification de la lignée de cellules souches neurales (NSC) 20. En dépit d'être immunochimique indétectable dans NSCs, 5FC et 5caC présentent immunocoloration proéminente aux premiers stades de la différenciation neuronale NSCs vers un nd lignées gliales. Ces deux marques accumulent transitoirement en même temps que l' apparence des marqueurs de neuronal précoce et la différenciation gliale 20. Pour déterminer la répartition des 5caC dans la différenciation NSCs nous avons effectués co-coloration de cette marque avec un marqueur GFAP gliale sur les cultures fixes de NNC à 3 jours d'induction de la différenciation gliale. Contrairement à NNC ​​ou astrocytes matures (données non présentées), nous avons observé signal 5caC forte proportion relativement importante des cellules exprimant GFAP dans ces cultures (Figure 2) 20. Figure 1. Co-immunocoloration de 5hmC (vert) avec NeuN (rouge) dans le tissu adulte cerveau DAPI (bleu). Les canaux individuels et la vue fusionnée sont présentés. Les barres d'échelle sont de 25 um.blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. Co-immunocoloration de 5caC avec GFAP dans la culture de NSC au Jour 3 du gliales Différenciation. Les canaux individuels et la vue fusionnée sont présentés. Les barres d'échelle sont de 20 um. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

Bien que la faible abondance rapporté des dérivés d'oxydation 5mC, 5FC et 5caC dans certains tissus présenterait des limitations significatives pour un protocole d'immunohistochimie standard, l'incorporation des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase a permis la détection de ces modifications de la cytosine dans des tissus fixés et des cellules (figure 2) . Cependant, le temps d'incubation optimal avec la solution de tyramide doit être optimisée expérimentalement pour chaque lot individuel de tyramide trousse d'amplification de signal , où une relation linéaire entre l' intensité du signal et la durée de tyramide l' amplification du signal sur la base est observée, pour plus de détails se reporter à Almeida et al. , 2012 26 . En outre, le rapport signal / fond peut être considérablement améliorée en effectuant les lavages dans une jarre de Coplin pour permettre une élimination efficace des anticorps en excès. Après l'incubation avec une solution de tyramide, il est important d'arrêter immédiatement la réaction par un lavage dans une solution de PBT à dfond iminution coloration. Il est essentiel de ne pas laisser les sections sécher à tout moment au cours de la procédure.

L'efficacité de l'ADN dépurination peut être améliorée en effectuant la réaction de dépurination à 37 ° C. Tout en utilisant N HCl 4 au lieu de 2 N améliore la coloration des formes modifiées de 5mC utilisant HCl 4 N pour l'ADN dépurination ne permettrait pas co-coloration avec DAPI, car il interagit exclusivement avec de l'ADN double brin.

Bien que cette technique peut fournir une évaluation semi-quantitative solide des formes modifiées de bases cytosine où détectable, il ne peut pas être utilisé pour évaluer les niveaux absolus de 5mC ou ses dérivés d'oxydation. Par conséquent, nous recommandons l'utilisation d'autres complémentaires , mais quantitative approches 16, 19 -24. Depuis la découverte de produits dérivés d'oxydation 5mC dans les génomes de mammifères, plusieurs approches ont été développées pour étudier leurs rôles biologiques 16, 19-24. Bien que ces approChes peuvent être utiles pour déterminer les niveaux absolus de dérivés d'oxydation 5mC, ils ne fournissent pas d' informations sur leur répartition spatiale 20, 26. Nous avons utilisé avec succès la méthode décrite ici pour cartographier la distribution spatiale et la localisation des dérivés d'oxydation 5mC dans différents types de cellules du développement et cerveau adulte 20

En révélant leur distribution spatiale 20, cette technique peut être cruciale pour comprendre les implications biologiques et le sort des dérivés oxydés de 5mC dans divers contextes biologiques où ces dérivés modifiés de 5mC peuvent être détectés , y compris la différenciation cellulaire, le développement et la maladie. En outre, la méthode que nous décrivons ici peut donner des évaluations semi-quantitatives des dérivés oxydés de 5mC dans différents tissus en évaluant la cinétique de la réaction de la peroxydase (qui est proportionnelle à l'intensité de la coloration) à différents temps d'incubation avec tyramide 26.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank the Advanced Microscopy Unit (School of Life Sciences, University of Nottingham) and the Histology team of MRC Human Reproductive Sciences Unit (Edinburgh), the Institute of Neuroscience at the ULB and the FNRS for help and support. This work was supported by MRC (MR/L001047/1 to A.D.J.).

Materials

Coplin jar Cole-Parmer UY-48585-30 Glass made
Xylene Use only in Class II safety cabinet
Phosphate buffer saline (PBS) Fisher Scientific 12821680 pPH 7.5, filtered before use
4% paraformaldehyde (PFA) Sigma Aldrich P6148 Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months
4% formaldehyde  (FA) Sigma Aldrich F8775 Once made can be stored at -20°C in aliquotes for several months
Ethanol, anhydrous denatured, histological grade Sigma Aldrich  64-17-5   95, 75, 50 % in PBS
0.01 % Tween 20 in PBS Sigma Aldrich P9416 PBT
0.5% Triton X-100 in PBS Sigma Aldrich X100 PBX
2 N HCl Sigma Aldrich 71826 caution extremely toxic
100 mM Tris-HCl  Promega H5121 PH adjusted to 8.5
hydrophobic barrier pen Abcam ab2601 for immunohistochemistry
Slide moisture chamber Scientific Device Laboratory 197-BL
anti-5mC mouse antibody Diagenode C15200081 monoclonal primary antibody
Anti-5hmC antibody Active Motif 39791 rabbit polyclonal primary antibody
Anti-5caC antibody Active Motif 61225 rabbit polyclonal primary antibody
Peroxidase-conjugated anti-rabbit seconday antibody Dako K1497
555-congjuated goat anti-mouse antibody Molecular probes A-11005  secondary antibody
10% BSA Sigma Aldrich A9418 Blocking solution
22x32mm Glass cover slips BDH 406/0188/24
Tyramide Signal Amplification System Perkin Elmer NEL741001KT Other fluorochome conjugated seconday antibodies can be used for co-detection of oxi-5mC 
 Mounting Medium with DAPI Vector Labs H-1200
Colourless nail polish
chicken polyclonal anti-GFAP polyclonal antibody Thermo Scientific PA5-18598 1:400 dilution
anti-NeuN mouse monoclonal antibody Merck milipore MAB377B 1:400 dilution
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References

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Abakir, A., Wheldon, L., Johnson, A. D., Laurent, P., Ruzov, A. Detection of Modified Forms of Cytosine Using Sensitive Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (114), e54416, doi:10.3791/54416 (2016).
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