胞嘧啶修饰形式使用敏感免疫组化检测

所有动物参与的程序是按照英国诺丁汉大学的伦理审查委员会进行。 1.选择用于免疫染色合适的组织准备如先前25描述的生成的野生型CD1小鼠胚胎和成人脑组织的石蜡包埋部分。使用固定为4％甲醛（FA）或4％多聚甲醛（PFA）的免疫染色方法25的脑组织切片。 注：使用的石蜡包埋组织切片之前必须获得抗体标记脱蜡。由于有2个治疗 – 4中的协议，用于DNA变性采用1M盐酸（HCl）的不与大多数抗原修复策略的兼容性，我们推荐使用的联合检测5MC氧化衍生物与蛋白质无论是永冻或切片机切片的标记。 2.脱蜡石蜡包埋组织切片< / P> 在II类运行安全柜，洗石蜡包埋组织切片在科普林罐子装满二甲苯，2次，每次10分钟在室温。 注：为未完成清蜡会导致不一致的染色模式，是用新鲜二甲苯重要。 脱蜡后，迅速再水化通过洗涤的组织切片连续在95，75，并在RT每10分钟50％的乙醇。 3.固定和永冻和切片机切片的透将它们放置在任何冰冷的4％PFA或4％FA在室温为15分钟修复再水化组织切片。 通过在RT洗涤在PBS 5分钟的节（磷酸盐缓冲盐水）除去过量的固定剂。 通过在科普林缸（在PBS中0.5％的Triton X-100）填充有PBX在R​​T 30分钟将透化的组织切片。在PBT（0.01％吐温20的PBS）洗不久的部分去除多余的PBX。 jove_title“> 4。免疫染色OXI-5MC衍生品放置在2当量盐酸的透截面在RT 60分钟为的DNA脱嘌呤。 注意：虽然高浓度的盐酸（ 例如，4 N），导致更有效的DNA变性，它们不是用于共检测OXI-MCS的用DAPI兼容。 放置在10mM的Tris-HCl（pH为8.5）进行30分钟的部分在RT以中和盐酸。可替代地，洗部分三次，每次在PBS中5分钟。孵育在PBT中的章节在RT 5分钟。 小心地从周围组织部分区域的液体而不会被轻轻摇晃幻灯片让组织切片完全干燥在任何步骤。使用疏水性障碍笔包围部分不接触部分。 注：疏水屏障笔减少抗体染色的组织可以允许多个部分与differen染色所需的音量同一张幻灯片上牛逼的抗体。 孵育在潮湿的腔室中加入100μl阻断溶液（在PBS中的10％牛血清白蛋白）在RT 1小时的部分。 注：跳过此步骤将不会影响染色的修饰的胞嘧啶碱基的效率。 孵育在100μl1的组织切片：5000稀释的小鼠单克隆抗5hmC和一个1：在在潮湿室阻挡在RT 1小时溶液兔多克隆抗5caC初级抗体1,000稀释。可替代地，如果需要，过夜，在4℃下进行温育。 注：没有初级抗体处理的部分可以作为适合阴性对照的染色过程。 12.5天后富集5caC，5FC和5hmC 20可以用作阳性对照交配小鼠胚胎的脑切片。 通过三次洗涤部分在科普林罐子装满PBT，每次5分钟在警察去除多余的抗体林瓶在室温。 注意：增加洗涤溶液的体积可以减少背景染色。 除去过量的PBT和，如果需要的话，与疏水屏障笔再次包围的部分作为PBT的含有洗涤剂，可以削弱疏水屏障。 使1：山羊抗兔HRP偶联抗体的1:400稀释并以1：在阻断溶液400稀释的驴抗小鼠555缀合的抗体。 从步骤4.9孵育在100μl第二抗体混合物的组织切片在室温在潮湿室中1小时。 洗在科普林罐子装满PBT三次，每次5分钟，在RT下的组织切片。 放置在100μl1的组织切片：在酪酰胺信号放大缓冲器酪酰胺的1:200稀释，在室温2分钟。 立即，由每个洗涤载玻片3次5分钟在PBT中除去过量的酪酰胺溶液。 小心ý除去过量PBT和立即覆盖部分带有一个安装介质的压降（见材料清单）。 轻轻地放在组织切片盖玻片，并立即密封指甲油盖玻片。 存放在4℃的组织切片用显微镜检验前几个小时。 （ – 40X放大率10）在405，488和/或555纳米的荧光显微镜下检查。