De alto rendimiento de identificación de bacterias polímeros repelentes para dispositivos médicos

1. Preparación de las placas recubiertas de agarosa NOTA: Antes de la fabricación de los microarrays de polímero, portaobjetos de vidrio recubiertos con aminoalquilsilano se recubren con agarosa IB para minimizar la unión no específica de fondo y permitir la evaluación de los polímeros que se unen o repeler bacterias 6. revestimiento de silano facilita la unión de agarosa para las diapositivas. Hacer un 2% de solución de agarosa IB en agua destilada en una botella de 250 ml (v / w). Después de cerrar la botella sin apretar, calentar la suspensión en un horno de microondas en 30 períodos seg hasta que se disuelva. Asegúrese de que la tapa no está bien cerrado para evitar cualquier posible acumulación de presión hacia arriba. Retire la botella regular y homogeneizar suavemente. Asegúrese de que el sólido se haya disuelto y la solución es clara. Verter esta solución de agarosa en un vaso de 100 ml, y colocar en un baño de agua a 65 ° C para mantener una solución líquida. Sumergir los portaobjetos recubiertos de silano en la solución de agarosa, asegurando un recubrimiento uniforme, y wipe la parte posterior de la corredera con un papel de seda. Secar las diapositivas, con la cara recubierta hacia arriba, en un entorno libre de polvo (por ejemplo, dentro de un armario o campana extractora) durante un mínimo de 24 hr. Confirmar un revestimiento uniforme mediante inspección visual. Revestimiento se puede evaluar fácilmente por la respiración en la diapositiva – condensación se formará en las regiones no recubiertas. Solamente los portaobjetos recubiertos por completo y de manera uniforme se deben utilizar para la impresión de microarrays. 2. Preparación de las soluciones de polímeros para su impresión Preparar soluciones (1% w / v) de una selección de polímeros preformados consiste en poliacrilatos, poliacrilamidas y poliuretanos en N metilpirrolidona (NMP) en viales de vidrio. (Preparar 1 ml de cada polímero). Vortex hasta que el polímero se haya disuelto completamente. Síntesis de polímeros se describe en otro 6. El uso de un micro-pipeta, llenar cada pocillo de una placa de micropocillos 384 con una solución de polímero de 25 l, asegurándose de que no hay conta cruzminación y cada pocillo contiene un polímero único. Utilice NMP como control negativo en al menos 2 pocillos. Registro de la identidad de la solución de polímero en cada pocillo en un archivo de plantilla de la placa u hoja de cálculo también. 3. Las micromatrices de polímero se imprime utilizando una impresora de contacto NOTA: La impresión de los microarrays se realizó utilizando una impresora de contacto. Las instrucciones específicas con respecto a la impresión de microarrays de polímero se dan a continuación. Para directrices generales sobre el uso de las recomendaciones de la impresora y de seguridad, siga las instrucciones del fabricante. Aunque se utiliza una impresora de contacto, un dispositivo de estampado manual de adecuado también podría ser utilizado. Como estaba previsto en el manual del usuario de la impresora, crear una rutina (véase el paso 3.3) que permite la impresión de 384 líquidos (las soluciones poliméricas o NMP) por cuadruplicado, utilizando una cabeza microarraying de 32 pines (dispuestos como 8 filas y 4 columnas). Imprimir 1.536 puntos dispuestos como 48 filas y 32 columnas. Programar la rutina para imprimir en la sección 12s, es decir., 32 soluciones a la vez, para que la impresora se puede detener después de imprimir cada sección para permitir la limpieza de los pines. Para crear una rutina de impresión: Abra el programa y de las opciones disponibles eligen 'Crear una nueva rutina'. Seleccione la pestaña 'Descripción' para detalles de entrada del experimento. Seleccione la pestaña 'Cabeza' y elija '32 cabeza microarraying -pin '. Seleccione la pestaña 'Fuente' y elija soporte de la placa (soporte de la placa fuente (1×5)), tipo de placa (placa de 384 x 6.000), el total de las placas (1) y el orden de las fuentes (por columnas). En el 'Estilo de la diapositiva' ficha, seleccione '3×1' 'slide' y elija poner en orden por "Número de campo '. A continuación, seleccione 'patrón Arraying'. Entrada 'visión del punto "como" diseño "y" dimensiones Pattern' como 'Número de filas' (6), 'El número de columnas' (8), "paso de fila '(750) y' pitch Columna '(560). Elija una sección para imprimir abetost. En el 'Diseño de diapositiva' de entrada ficha el número de diapositivas utilizado para la impresión. Seleccione la pestaña "Imprimir" para introducir los parámetros de impresión (número de sellos por entintado: 1, número de sellos por punto: 5, sellado de tiempo: 200 ms, tiempo de entintado: 100 ms). NOTA: Una rutina ya está creado para la impresión de 384 líquidos (las soluciones poliméricas o NMP) por cuadruplicado, utilizando una cabeza microarraying de 32 pines (8 dispuestos como filas y 4 columnas). En total, la rutina debe imprimir 1.536 puntos dispuestos como 48 filas y 32 columnas, con un paso de fila de 750 micras y el tono de la columna de 560 micras. Colocar los portaobjetos recubiertos de agarosa sobre la plataforma y asegurar un buen sellado al vacío para mantener las diapositivas en su posición. Ajuste el cabezal de impresión de manera que todos los pasadores están a la misma altura. Marque esta bajando manualmente la cabeza a un portaobjetos de vidrio y la confirmación de que los pasadores se mueven hacia arriba al mismo tiempo. Si hay alguna discrepancia con la altura, ajuste mediante el uso de la sleeve en el pasador hacia arriba o hacia abajo. Coloque la placa de bien en el soporte de la placa en la orientación correcta, es decir., Así A1 es la parte superior derecha de la titular y garantizar así la placa se fija con firmeza. Usando el ajuste de la altura, asegúrese de que la altura del soporte de la placa es tal que al momento de retirar las soluciones de polímeros, los pasadores no tocan el fondo de los pocillos. NOTA: Esto es importante para la localización de polímero uniforme y también para evitar el derrame de soluciones de polímeros en los pozos adyacentes, causando con ello la contaminación cruzada. Seleccione la pestaña "Inicio" y seleccione el "Tipo de funcionar con" como "Normal". Haga clic en "Ejecutar", y confirmar que la diapositiva, así plato, etc., son en su posición cuando se le solicite. Impresión 1 de la sección a la vez (32 soluciones a la vez; 12 secciones), lo que permite la limpieza de los pines entre secciones. Limpiar los pasadores a fondo con toalla de papel humedecido en acetona, seguido de papel de seda seco para asegurar los pasadores son completamente seco. Al término de la impresión de los microarrays, colocarlos en un soporte de diapositivas y secar durante la noche en una estufa de vacío ajustada a 45 ° C para eliminar el NMP en los puntos de polímero. Después de la esterilización con luz UV durante 30 min, los microarrays están listos para la inoculación de las bacterias. Antes de la inoculación con bacterias diapositivas, realizar una medición de la fluorescencia de fondo (como se describe en la sección 5). Utilice esta medición en el cálculo de la unión bacteriana. 4. La inoculación de Microarrays polímero con bacterias NOTA: Asegurar una buena técnica aséptica. Toda la manipulación de las culturas debe realizarse en un entorno estéril: o bien el uso de un quemador Bunsen o en una campana de flujo. Los cultivos deben ser cultivadas con la disponibilidad de oxígeno, medio de crecimiento, y la temperatura ajustada a los requerimientos de cada especie. Preparar cultivos durante la noche mediante la inoculación de 5 ml de caldo Luria-Bertani (LB: 10 g L-1 Bacto-triptona, 5 g L-1 de NaCl y 10 g L <sup> -1 extracto de levadura) con una colonia de una placa. Incubar toda la noche a 37 ° C, con agitación a 200 rpm. Preparar las existencias congelador de cultivos durante la noche mediante la adición de glicerol (10% de concentración global) y almacenar el archivo a -80 ° C. Con el fin de determinar el número de células a partir de muestras de las poblaciones bacterianas descongeladas, realizar diluciones en serie de cada población y crecer las bacterias durante la noche en medios sólidos. La determinación precisa del número de células en las poblaciones asegura la inoculación apropiada de cada especie 6. Preparar inóculos para microarrays. solo cultivo de especies se cultivan como antes y se aplican directamente a los microarrays. BacMix-1 es una mezcla bacteriana de Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), Staphylococcus saprophyticus (S. saprophyticus) y Staphylococcus aureus (S. aureus). BacMix-2 es una mezcla bacteriana que consiste en Streptococcus mutans (S. mutans), S. aureus </em>, K. pneumoniae y Enterococcus faecalis (E. faecalis). Para producir ya sea un cultivo mixto, mezcla noches en volúmenes iguales (3 ml cada uno) y se diluye cuatro veces con LB fresco (alrededor de 50 ml de volumen final). Coloque los microarrays de polímero esterilizada por UV en placas rectangulares de 4 pocillos e incubar con 6 ml de cultivos bacterianos mixtos a 37 ° C con agitación suave (30 rpm) durante 5 días. Después de la incubación, lavar suavemente los microarrays dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS: NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4) y se incuba con una solución de 1 mg ml -1 de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) mancha en PBS durante 30 min. Lavar los microarrays diapositivas manchadas en una placa fresca cubriendo con PBS y se agita suavemente, cambiando el PBS una vez. En seco bajo un flujo de aire. Aplicar una hoja de cubierta de vidrio para los microarrays de diapositivas y el sello en su lugar con pegamento. Una vez dry, esterilizar la superficie exterior con 70% (v / v) de etanol. Disposición segura de los cultivos en función de su nivel de contención. 5. Análisis de microarrays de imagen y Capturar imágenes individuales para cada punto de polímero en campo claro y DAPI (/ em = 358 nm / 361 nm) Ex canales. Realice esto manualmente con un microscopio de fluorescencia o el uso de un microscopio de fluorescencia automatizado (con una etapa de XYZ controlada por un software de adquisición de imágenes) equipado con un objetivo de 20X. NOTA: Consulte el manual de 18 para hacer funcionar el software y el ajuste del microscopio para obtener imágenes utilizando canales de campo claro y DAPI. Asegúrese de que el tiempo de la ganancia y la exposición para la captura de imágenes para todos los microarrays son los mismos. Obtener la intensidad media de fluorescencia de cada punto en el canal de DAPI eligiendo el área de la mancha y la cuantificación de la fluorescencia con un software de procesamiento de imágenes. Para el fondo de fluorescencia de cada mancha, obtaen las imágenes de los puntos de polímero en un microarray de duplicados se incubaron solamente con los medios de comunicación sin bacterias. Deducir la fluorescencia de fondo de la intensidad del punto de obtener la fluorescencia de las bacterias. Calcular el valor medio normalizado de los cuatro puntos, lo que representa cada polímero, que se utiliza para comparar las bacterias unión de varios polímeros 6. Identificar los polímeros que exhiben la unión (fluorescencia más bajo) menos bacteriana como polímeros 'hit' 6. 6. Revestimiento de cubreobjetos para la Validación 'Hit' Para Cubreobjetos de capa con polímeros: Se preparan soluciones de polímeros 'hit' (~ 2% w / v) en tetrahidrofurano (THF), u otro disolvente apropiado. capa de la vuelta cubreobjetos de vidrio circular de tamaño adecuado con las soluciones de polímero utilizando una recubridora de rotación a 2000 rpm durante 10 s. NOTA: En ausencia de una recubridora de rotación, cubreobjetos u otros materiales puede ser recubierto por inmersión, a pesar de girorevestimiento produce una superficie más uniforme. Secar los cubreobjetos recubiertos en un horno de convección a 40 ° C durante la noche y esterilizar usando luz UV durante 30 min antes de la inoculación de las bacterias. Para Cubreobjetos de capa con agarosa Para los controles negativos: cubreobjetos limpias, ya sea por tratamiento de plasma de 10 min o la inmersión en NaOH 1 M durante 4 horas. Sumergir los cubreobjetos en acetonitrilo que contiene 1% trietoxisilano (3-aminopropil) durante la noche. Limpiar los cubreobjetos con acetona 3 veces y puesto en un horno (100 ° C) durante 1 hr. escudo Dip los cubreobjetos secos con solución de agarosa acuosa al 1% mantenido en un baño de agua a 60 ° C. Coloque el cubreobjetos recubiertos de agarosa en la superficie plana en condiciones ambiente libre de polvo durante 24 horas y esterilizar usando luz UV durante 30 minutos antes de la inoculación de las bacterias. 7. El apego y el análisis de hoja de la cubierta Uso de microscopio electrónico de barrido (SEM) Despuésla esterilización con luz UV durante 30 min, colocar la cubierta se desliza (vidrio de polímero / agarosa, recubierto o no) en una placa de 12 pocillos estándar o placa de 24 pocillos (dependiendo del tamaño de los cubreobjetos) y se incuba con las bacterias como se describe en la sección de 4. Después de la incubación con bacterias, lavar los cubreobjetos no recubiertos y recubiertos dos veces con tampón cacodilato 0,1 M (pH 7,4) y luego fijar con 2,5% glutaraldehído en tampón de cacodilato 0,1 M (w / v) (pH 7,4) durante 2 horas. muestras post-fix con 1% (w / v) tetróxido de osmio durante 1 hora a temperatura ambiente y se deshidratan con lavados de etanol secuenciales a 50, 70, 90 y 100% (v / v) durante 30 min cada uno. Las muestras secas en CO 2 de acuerdo con los protocolos estándar de 19. El tiempo de secado dependerá de la naturaleza de la muestra. muestras de capa de una aleación de oro / paladio (60/40%) utilizando un dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica con corriente a 30 mA y vacío a 0,75 Torr. Examinar bajo el microscopio electrónico como por protocolos estándar 20. NOTA: Ensure adecuadas precauciones de seguridad para manejar los riesgos resultantes de almacenamiento, manipulación y eliminación de tetróxido de osmio, ya que es altamente tóxico. comparar visualmente imágenes de los cubreobjetos no recubiertos y las revestidas con agarosa o los polímeros 'hit' para confirmar bacterianas capacidades de unión / repelen de los polímeros. NOTA: La resistencia de la unión debe ser fácilmente visible como una reducción de células presentes. Elija el más prometedor 'hit' polímeros no vinculantes para los estudios de pintura, haciendo los productos sanitarios (por ejemplo, catéteres venosos centrales) 6. 8. Selección de un disolvente para el recubrimiento de catéteres Evaluar diversos disolventes para su compatibilidad con la parte permanente del catéter, así como su capacidad para disolver el polímero 'golpeado'. Cortar partes del cateterismo-1 y en piezas cilíndricas de 5 mm de longitud, y medir con un calibrador Vernier digital. Evaluar diversos disolventes tales como ACETácido ic, amoníaco, acetona, acetonitrilo, éter dietílico, tetrahidrofurano (THF), dimetilformamida (DMF), N-metil-2-pirrolidona (NMP), etanol, metanol, etilenglicol, tolueno y xileno. Sumergir piezas de catéter en los disolventes durante 12 horas y evaluar visualmente la integridad del catéter y la claridad de disolvente. NOTA: Elija un disolvente que no hacen que los catéteres que se hinchan o se desintegran o resultan en un disolvente turbia. El disolvente debe disolver los polímeros 'hit'. 9. Análisis de la adhesión bacteriana en catéteres por microscopía confocal Preparar 2,5% (w / v) soluciones de polímeros en acetona u otro disolvente adecuado, según lo indicado en la sección 8. Colocar piezas 5 mm catéter en un pequeños frascos de vidrio (5 ml) y se sumerja en 1 ml de la solución de polímero durante 2 minutos . Retire el exceso de solución de polímero y secar las piezas del catéter durante la noche en un horno de vacío a 40 ° C. Preparar el inóculo mediante la mezcla de descongelado st bacterianaocks para dar aproximadamente 10 6 células de cada especie en 50 ml de LB 6. Esterilizar piezas de catéteres recubiertos y no recubiertos con luz UV durante 30 minutos y se incuba con 1 ml de LB inoculados en una placa de 24 pocillos, a 37 ° C durante 3 días, con agitación suave 6. Después de la incubación, lavar los catéteres con PBS (2x, 2 ml), fijar las bacterias con 10% de paraformaldehído en PBS durante 30 min, y se lava con PBS (1 ml). Tinción de las bacterias en piezas de catéter con DAPI (1 mg ml – 1) durante 20 min y se lava con PBS (1 ml). Obtener imágenes confocales de las piezas de catéter utilizando la siguiente configuración: 405nm diodo láser azul, rango detector de 414-502 nm, agujero pin – Airy1, imagen Tamaño – 1.024 × 1.024 píxeles, el ancho del voxel – 105,2 nm, Z-pilas espaciamiento 0.5μ m , magnificación – 40X 1.25. Completar la imagen confocal por apilamiento Z 50 imágenes a través de 100 micras de longitud del catéter. Analizar las imágenes utilizando él apropiadosoftware de análisis le: aplanar las imágenes apiladas Z-en el plano Z, usando la función de extender la profundidad de campo, para crear una sola imagen de una pieza catéter. NOTA: Esta imagen debería analizarse entonces para obtener el área del catéter cubierto por bacterias, después de fondo de corrección mediante la función 'aplanar fondo'. 10. Análisis de la adhesión bacteriana en catéteres por SEM Preparar 10% de solución de polímero (w / v) en acetona. Presione una punta de pipeta (para 200 l micropipeta) en la parte media de la pieza cortada del catéter para sostenerlo y sumergir la pieza en la solución de polímero durante aproximadamente 30 segundos. Secar la pieza recubierta en condiciones ambientales durante 30 min. Aplicar un segundo recubrimiento por inmersión de nuevo en la solución polimérica y secar durante la noche en condiciones ambientales. Después del tratamiento UV y la incubación con bacterias lavar las piezas (n = 3) con PBS (2x, 1 ml) y transferirlas en placas de 48 pocillos que contienen 10% de formaldehído en PBS durante 30 min. Después de la fijación, lavar las piezas con PBS (1 ml), secar durante la noche a temperatura ambiente, montar en trozos con discos de carbono conductoras, y una capa de oro usando un recubridor de pulverización catódica (véase el paso 7.5). Obtener imágenes utilizando un microscopio electrónico de barrido 6.