Comportamientos olfativas ensayó mediante seguimiento informático de<em> Drosophila</em> En un olfatómetro de cuatro cuadrantes

La capacidad de adaptarse y responder al entorno externo es fundamental para la supervivencia de todos los animales. Un animal necesita para evitar peligros, buscar comida y encontrar compañeros, y aprender de las experiencias anteriores. Los sistemas sensoriales funcionan para recibir una variedad de estímulos, tales como visual, químicas y mecanosensorial, y enviar estas señales al sistema nervioso central debe ser interpretado y decodificada. Entonces, el cerebro dirige conductas motoras apropiadas basadas en la percepción del medio ambiente, tales como la búsqueda de alimentos o escapar de un depredador. La comprensión de cómo los sistemas sensoriales detectan el mundo exterior, y cómo el cerebro decodifica y dirige las decisiones, es un reto importante en la neurobiología.

Drosophila melanogaster es un sistema poderoso modelo para la investigación de cómo los comportamientos de los nervios de guía circuitos. Además de ser sencillo y barato de mantener, Drosophila exhiben muchos de los comportamientos estereotipados diversas y complejas, sin embargo, lo hacen con un compacT del sistema nervioso de los cerca de 100.000 neuronas. Existen poderosas técnicas genéticas para manipular el genoma de Drosophila, y miles de líneas transgénicas que se han generado de forma selectiva y reproducible etiquetar los mismos subconjuntos de neuronas ^10-13. Estas líneas transgénicas se pueden utilizar para manipular selectivamente la actividad de las neuronas marcadas (activar o inhibir), y estas manipulaciones se pueden utilizar para investigar cómo neural comportamientos funciones de guía.

Ensayos de comportamiento múltiples se han desarrollado para el estudio de diversos comportamientos de Drosophila. Drosophila, al igual que muchos animales, usan su sentido del olfato para guiar muchas opciones de comportamiento, tales como la búsqueda de alimentos, la búsqueda de compañeros, y evitar peligros. Por lo tanto, el olfato es un buen sistema sensorial para investigar cómo se detectan e interpretados por el sistema nervioso de un animal para guiar las decisiones adecuadas estímulos externos. Como tal, un número de ensayos han sido desarrollados para Investigalarvario Ting y comportamientos olfativas adultos. Tradicionalmente, los comportamientos olfativas en Drosophila se ensayaron mediante un paradigma laberinto en T de dos elección, que se puede utilizar para ensayar innata y los comportamientos aprendidos olfativas ^3. En este ensayo, alrededor de 50 moscas se les da a elegir entre dos tubos: uno de los tubos contiene el olor en cuestión y la otra contiene un odorizante de mando (generalmente el disolvente olor). Las moscas se les da un período determinado de tiempo para tomar una decisión, y después se contó el número de moscas que se encuentran en las diferentes cámaras. Aunque el T-laberinto es un ensayo simple para muchos experimentos, hay varias limitaciones. Por ejemplo, los comportamientos olfativas se miden en un solo punto del tiempo, y diferentes elecciones realizadas antes de este punto de tiempo se descartan. Del mismo modo, los comportamientos individuales de las moscas dentro de la población se descuidan. Además, el laberinto en T requiere conteo manual de las moscas, que puede introducir errores. Finalmente, puesto que sólo hay dos opciones de medición, estereduce la potencia estadística a menudo requerido para detectar sutiles cambios de comportamiento. Una alternativa a una elección de dos T-laberinto es un olfatómetro de cuatro cuadrantes (de cuatro campos) ^14-18. En este ensayo, los animales exploran un escenario en el que cada una de las cuatro esquinas de la arena se llena con una posible fuente de aire olorizado. La arena tiene una forma de estrella fruncido para maximizar la formación de cuatro cuadrantes de olor definidos experimentalmente. Si el olor se suministra en una de las esquinas entonces se incluirá solamente en que un cuadrante. Los comportamientos de los animales pueden ser rastreados a medida que entran y salen del cuadrante olor, y fácilmente en comparación con su comportamiento en los tres cuadrantes de control. Así, el ensayo olfatómetro de cuatro cuadrantes registros de respuesta de comportamiento espacial y temporal de los estímulos de olor más de un gran estadio experimental.

El olfatómetro de cuatro cuadrantes fue desarrollado por primera vez por Pettersson et al. ¹⁵ y Vet et al. ¹⁷ para investigar el ollas respuestas de comportamiento de fábrica de los himenópteros parásitos individual. Faucher et al. ¹⁸ y ¹⁶ Semmelhack y Wang adaptaron la configuración para supervisar las respuestas olfativas de Drosophila individuo. El olfatómetro de cuatro cuadrantes es igualmente sensible a las respuestas de atracción y repulsión, lo que permite una amplia gama de odorantes y condiciones de ensayo. Software de seguimiento de mosca por encargo por escrito, desarrollado por Alex Katsov ¹⁹ y actualmente mantenido por Julian Brown (se detalla en Materiales), presentó ventajas adicionales para las implementaciones más recientes del olfatómetro de cuatro cuadrantes ^14,20-23. Ahora es posible ensayar hasta 100 moscas simultáneamente en alta resolución espacial (27,5 píxeles / cm) y temporales (30 cuadros por segundo) de resolución, que permite extraer varios parámetros, tales como posición, velocidad y aceleración de las moscas en cualquier punto de tiempo. Esto permite que las investigaciones sobre la dinámica de las respuestas de comportamiento de las moscas a los olores ²⁰ </sarriba>. Cabe señalar, sin embargo, que la identidad de moscas individuales dentro de la población durante todo el período de seguimiento no se mantiene. En su lugar, cada pista mosca se registra durante el tiempo de dos pistas de la mosca no se cruzan. Momento en el cual, las nuevas pistas se les asignan después de las moscas divergen. Mediante la incorporación de otro software de captura de vídeo (que se detallan en la Tabla Materiales), la misma configuración permite que los períodos de seguimiento flexible y se podría utilizar para realizar un seguimiento de las moscas para un máximo de 24 h por la toma de imágenes a una velocidad inferior. Esta opción se utiliza para estudiar los comportamientos que ponen huevos de moscas y comparar sus posiciones corporales con las preferencias de oviposición ^14. El olfatómetro de cuatro campos también se puede utilizar para estudiar las respuestas a multimodal (por ejemplo, olfativos y visuales) estímulos, o para combinar optogenético ⁹ o ²¹ thermogenetic estimulación con presentaciones de estímulos sensoriales. Además, la alta resolución temporal permite la extracción de trayectorias for cada una mosca individual en el conjunto de datos de conjunto. Por lo tanto, el método permite la investigación en comportamientos de la población-olfativas guiadas y las interacciones sociales individuales. Los datos generados por este ensayo son robustos y altamente reproducible, lo que permite el uso del olfatómetro de cuatro campos para pantallas de comportamiento.

Se describe aquí el conjunto de configuración para un olfatómetro de cuatro cuadrantes. Además, demuestran su uso en el ensayo de atracción olfativa en respuesta a vinagre de manzana y repulsión en respuesta a propionato de etilo altamente concentrado. Finalmente, describimos y proporcionamos código de ejemplo para el análisis de los datos de seguimiento mosca grabados.