Detección Molecular rápida y diferenciación de virus gripales A y B
Summary
Se describe un ensayo rápido, a base de molecular Influenza A y B. El ensayo detecta la influenza cada objetivo en los 15 minutos mediante el empleo de amplificación isotérmica con cebadores específicos de la influenza, seguido de la detección de objetivos con sondas de baliza molecular. El ensayo de la gripe A y B es fácil de usar y requiere práctica en un mínimo de tiempo para llevar a cabo.
Abstract
La gripe es una enfermedad respiratoria contagiosa causada por el virus de la influenza A y B en los seres humanos y causa una cantidad significativa de la morbilidad y la mortalidad cada año. La influenza A y B del ensayo fue la primera prueba rápida de la gripe molecular CLIA renunciado disponible. La prueba de la gripe A y B funciona mediante el empleo de amplificación isotérmica con cebadores específicos de la influenza, seguido de la detección de objetivos con sondas de baliza molecular. Aquí, el rendimiento de la Influenza A y el ensayo B en congelado, archivadas hisopo nasofaríngeo (NPS) muestras almacenadas en medio de transporte viral (VTM) se compararon con un ensayo de panel de respiratoria.
El rendimiento del ensayo A y B de la gripe se evaluó mediante la comparación de los resultados con el método de referencia del panel respiratorio. La sensibilidad para el virus de la gripe A fue total de 67,5% (IC del 95% (IC), 56,6-78,5) y la especificidad fue del 86,9% (IC, 71,0 a 100). Para las pruebas de virus de la gripe B, la sensibilidad y la especificidad fueron del 90,2% (IC, 68,5-100) Y 98,8% (IC, 68,5 a 100), respectivamente.
Este sistema tiene la ventaja de un tiempo de prueba significativamente más corto que cualquier otro ensayo molecular actualmente disponibles y el procedimiento simple, libre de pipeta se ejecuta en un sistema totalmente integrado, cerrado, que ocupa poco espacio. En general, la influenza A y B de ensayo evaluados en este estudio tiene el potencial de servir como una prueba de diagnóstico rápido de la influenza en el punto de atención.
Introduction
Infecciones por virus de la influenza como resultado una cantidad significativa de la morbilidad y la mortalidad cada año 1, 2, 3. La gripe sin complicaciones se caracteriza por síntomas constitucionales y respiratorias, tales como fiebre, mialgia, dolor de cabeza y tos no productiva 4, 5. Las personas mayores, niños pequeños, pacientes inmunocomprometidos y pacientes con comorbilidades subyacentes están en un mayor riesgo de sufrir complicaciones graves como neumonía, miocarditis, enfermedad del sistema nervioso central, o la muerte 6, 7.
Infección de la gripe es único de otros virus respiratorios en ese pronta administración de la terapia antiviral dentro de las 48 h del inicio de los síntomas puede reducir la gravedad de la enfermedad y la longitud 8. La identificación rápida de la gripe también ha sidodemostrado reducir el uso de antibióticos innecesarios 9, 10. Además, los pacientes hospitalizados con infecciones por influenza deben ser colocados en habitaciones aisladas con las precauciones de control de infecciones. Sin embargo, las enfermedades respiratorias causadas por virus de la gripe no pueden ser difíciles de distinguir clínicamente de la gripe. Por esta razón, las pruebas de diagnóstico rápido y preciso para la influenza es muy importante para el manejo clínico del paciente.
Varios ensayos están disponibles para la detección e identificación de virus de influenza. Pruebas de detección de antígenos de la gripe rápido (RIDT) son ampliamente utilizados en la práctica clínica como pruebas de punto de atención, ya que son fáciles de usar y proporcionan resultados dentro de 15 a 30 minutos 11, 12; Sin embargo, sus sensibilidades varían ampliamente (10-80%), dependiendo del fabricante y de la población que se está probando, y el tipo influenza y subtyPE 13, 14, 15. Ensayos de fluorescencia directa (DFA) proporcionan sensibilidades superiores sobre RIDTs, pero el tiempo de procesamiento es mayor (~ 3 h) y deben ser completado por técnicos cualificados 16, 17. El cultivo del virus ha sido el estándar de oro para el diagnóstico de la gripe y ha mejorado la sensibilidad sobre ambos RIDTs y DFA 18. Sin embargo, el cultivo del virus de la gripe puede tomar de 2-14 d para completar, lo que disminuye su utilidad en la ayuda a la gestión de pacientes 19. Por último, las pruebas de amplificación de ácidos nucleicos (NAAT) han reemplazado a las técnicas de cultivo como el nuevo estándar de oro en el diagnóstico de la gripe. NAAT se considera que tienen la mayor sensibilidad para la detección de la gripe en un par de horas. Sin embargo, AEAC son los ensayos más caras y requieren equipos especializados y técnicos para llevar a cabo 5 <sarriba>, 20, 21, 22, 23, 24, 25.
El ensayo de la influenza A y B se describe aquí es la primera prueba rápida de la gripe molecular CLIA renunciado a que está fácilmente disponible. Este ensayo funciona mediante el empleo de una reacción nicking endonucleasa de amplificación (NEAR) que utiliza la amplificación isotérmica con cebadores específicos de la influenza, seguido de la detección de objetivos con sondas de baliza molecular. Este ensayo se diferencia de la gripe A de B, requiere 2 minutos para configurar y procesar una muestra, y requiere un total de 15 minutos para completar.
A continuación, presentamos el protocolo para el ensayo de influenza A y B. Además, proporcionamos un conjunto de datos de muestra comparando el rendimiento de la influenza A y B en el ensayo de frotis nasofaríngeo archivado (NPS) los especímenes almacenados en un medio de transporte viral (VTM) a otro panel de ensayo de patógenos respiratorios.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los virus de influenza son importantes causas mundiales de morbilidad y mortalidad. El diagnóstico rápido y preciso de la gripe es una de las principales claves para manejar los brotes de gripe durante la temporada respiratoria. Otras pruebas basados en antígenos son rápidos y fáciles de realizar; sin embargo, tienen bajas sensibilidades 13. Por otra parte, las pruebas moleculares tradicionales han mejorado la sensibilidad, pero requieren técnicos de laboratorio más experimentados de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Clinical Microbiology Service staff of the Memorial Sloan-Kettering Cancer Center for help in collecting clinical specimens. This study was supported in part by a research agreement between MSKCC and Alere Scarborough (SK2013-0262).
Materials
| Alere i Instrument | Alere | NAT-000 (Global), NAT-024 (US) | |
| Alere i Influenza A & B 24 Test Kit | Alere | 425-000 (Global), 425-024 (US) | |
| Alere i Barcode Scanner | Alere | EQ001001 | |
| Alere Universal Printer | Alere | 55115 (Global), alereiprinter (US) | |
| 200 µL precision pipette | |||
| 200 µL disposable pipette tips | |||
| Viral transport medium | Remel | M4-RT |
References
- . . Prevention control of seasonal influenza with vaccines. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices–United States, 2013-2014. , 1-43 (2013).
- Poehling, K. A., et al. The Underrecognized Burden of Influenza in Young Children. New England Journal of Medicine. 355 (1), 31-40 (2006).
- . Estimates of Deaths Associated with Seasonal Influenza — United States, 1976-2007. MMWR. 59 (33), 1057-1089 (2010).
- Agrawal, A. S., et al. Comparative evaluation of real-time PCR and conventional RT-PCR during a 2 year surveillance for influenza and respiratory syncytial virus among children with acute respiratory infections in Kolkata, India, reveals a distinct seasonality of infection. Journal of Medical Microbiology. 58 (12), 1616-1622 (2009).
- Ginocchio, C. C. Strengths and Weaknesses of FDA-Approved/Cleared Diagnostic Devices for the Molecular Detection of Respiratory Pathogens. Clinical Infectious Diseases. 52, 312-325 (2011).
- Grohskopf, L. A., et al. Prevention and control of seasonal influenza with vaccines: recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices-United States, 2013-2014. MMWR Recomm Rep. 62 (07), 1-43 (2013).
- Molinari, N. -. A. M., et al. The annual impact of seasonal influenza in the US: measuring disease burden and costs. Vaccine. 25 (27), 5086-5096 (2007).
- Aoki, F. Y., et al. Early administration of oral oseltamivir increases the benefits of influenza treatment. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 51 (1), 123-129 (2003).
- Noyola, D. E., Demmler, G. J. Effect of rapid diagnosis on management of influenza A infections. The Pediatric infectious disease journal. 19 (4), 303-307 (2000).
- Sharma, V., Dowd, M., Slaughter, A. J., Simon, S. D. EFfect of rapid diagnosis of influenza virus type a on the emergency department management of febrile infants and toddlers. Archives of Pediatrics & Adolescent Medicine. 156 (1), 41-43 (2002).
- Dale, S. E., Mayer, C., Mayer, M. C., Menegus, M. A. Analytical and clinical sensitivity of the 3M rapid detection influenza A+B assay. J Clin Microbiol. 46 (11), 3804-3807 (2008).
- van Doorn, H. R., et al. Clinical validation of a point-of-care multiplexed in vitro immunoassay using monoclonal antibodies (the MSD influenza test) in four hospitals in Vietnam. J Clin Microbiol. 50 (5), 1621-1625 (2012).
- Hurt, A. C., Alexander, R., Hibbert, J., Deed, N., Barr, I. G. Performance of six influenza rapid tests in detecting human influenza in clinical specimens. Journal of Clinical Virology. 39 (2), 132-135 (2007).
- Fiore, A. E., et al. Antiviral agents for the treatment and chemoprophylaxis of influenza — recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP). MMWR Recomm Rep. 60 (1), 1-24 (2011).
- Harper, S. A., et al. Seasonal influenza in adults and children–diagnosis, treatment, chemoprophylaxis, and institutional outbreak management: clinical practice guidelines of the Infectious Diseases Society of America. Clin Infect Dis. 48 (8), 1003-1032 (2009).
- Hannoun, C., Tumova, B. Survey on influenza laboratory diagnostic and surveillance methods in Europe. European Journal of Epidemiology. 16 (3), 217-222 (2000).
- Leonardi, G. P. Rapid identification of 2009 H1N1 influenza A virus using fluorescent antibody methods. Am J Clin Pathol. 134 (6), 910-914 (2010).
- Chartrand, C., Leeflang, M. M. G., Minion, J., Brewer, T., Pai, M. Accuracy of Rapid Influenza Diagnostic TestsA Meta-analysis. Annals of Internal Medicine. 156 (7), 500-511 (2012).
- Lee, G. C., et al. Evaluation of a rapid diagnostic test, NanoSign(R) Influenza A/B Antigen, for detection of the 2009 pandemic influenza A/H1N1 viruses. Virol J. 7, 244 (2010).
- Tang, Y. W., et al. Clinical accuracy of a PLEX-ID flu device for simultaneous detection and identification of influenza viruses A and B. J Clin Microbiol. 51 (1), 40-45 (2013).
- Bandt, D., et al. Economic high-throughput-identification of influenza A subtypes from clinical specimens with a DNA-oligonucleotide microarray in an outbreak situation. Molecular and Cellular Probes. 26 (1), 6-10 (2012).
- Pierce, V. M., Elkan, M., Leet, M., McGowan, K. L., Hodinka, R. L. Comparison of the Idaho Technology FilmArray system to real-time PCR for detection of respiratory pathogens in children. J Clin Microbiol. 50 (2), 364-371 (2012).
- Teo, J., et al. VereFlu™: an integrated multiplex RT-PCR and microarray assay for rapid detection and identification of human influenza A and B viruses using lab-on-chip technology. Archives of Virology. 156 (8), 1371-1378 (2011).
- Babady, N. E., et al. Comparison of the Luminex xTAG RVP Fast assay and the Idaho Technology FilmArray RP assay for detection of respiratory viruses in pediatric patients at a cancer hospital. J Clin Microbiol. 50 (7), 2282-2288 (2012).
- Chidlow, G., et al. Duplex real-time reverse transcriptase PCR assays for rapid detection and identification of pandemic (H1N1) 2009 and seasonal influenza A/H1, A/H3, and B viruses. J Clin Microbiol. 48 (3), 862-866 (2010).
- Bell, J. J., Selvarangan, R. Evaluation of the Alere I influenza A&B nucleic acid amplification test by use of respiratory specimens collected in viral transport medium. J Clin Microbiol. 52 (11), 3992-3995 (2014).
- Nie, S., et al. Evaluation of Alere i Influenza A&B for Rapid Detection of Influenza Viruses A and B. Journal of Clinical Microbiology. 52 (9), 3339-3344 (2014).
- Chapin, K. C., Flores-Cortez, E. J. Performance of the Molecular Alere i Influenza A&B Test Compared to That of the Xpert Flu A/B Assay. Journal of Clinical Microbiology. 53 (2), 706-709 (2015).
