Agregada la optimización del tamaño de micropocillos para basada en suspensión cardiaca diferenciación de células madre pluripotentes

1. Preparación de los componentes del medio Preparar medio de lavado. Por 100 ml de DMEM / F12, añadir 1 ml de 100x penicilina / estreptomicina (Pen / Strep), 1 ml de 100x L-glutamina, y 5 ml de la sustitución de suero. Preparar el químicamente definido basal cardiaca de inducción medio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Preparar los reactivos siguientes acciones para los medios que serán utilizados en este protocolo. Ácido L-ascórbico: Preparar una solución madre de 5 mg por ml en 4 ° C, el agua destilada ultrapura estéril en un tubo cónico. Deja esta solución en hielo y agitar el tubo periódicamente hasta que el soluto se disuelve completamente. Filtros de esterilizar la solución de ácido ascórbico usando un filtro de jeringa de 0,22 micras. Preparar alícuotas de 1 ml de la solución de ácido ascórbico y almacenar estas alícuotas a -20 ° C. Utilice una alícuota recién descongelado se prepara cada medio tiempo. En el día de la preparación de medio, Diluir 13 l de monotioglicerol (MTG) en 1 ml de Basal Medium cardíaca inducción. Descartar sin usar, MTG diluida. Preparar alícuotas de 1 ml de transferrina (30 mg / ml) para almacenar a -20 ° C. Tienda descongeló alícuotas a 4 ° C durante un máximo de 3 meses. Preparar ácido 4 mM clorhídrico (HCl) que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina (BSA). En una campana de humos, añadir 30 l de solución de HCl 6,0 N a 50 ml de agua destilada ultrapura. Filtros de esterilizar la solución utilizando un filtro de jeringa de 0,22 micras. Añadir 2 ml de solución de BSA al 25% a la solución de HCl 50 ml. Preparar Phosphate Buffered Saline (PBS) que contiene 0,1% de BSA. Añadir 20 l de solución de BSA 25% por ml de PBS. Preparar humana Proteína morfogenética ósea 4 (BMP-4) solución madre (10 ng / l). Disolver 10 mg liofilizados BMP-4 en 1 ml de solución tampón 4 mM HCl que contiene 0,1% de BSA. Preparar 50 l alícuotas para almacenar a -20 ° C. Preparar humano factor de crecimiento fibroblástico 2 solución madre (bFGF)(10 ng / l). Disolver 10 mg liofilizado bFGF en 1 ml de salina tamponada con fosfato (PBS) conteniendo 0,1% de BSA. Preparar 50 l alícuotas para almacenar a -20 ° C. Preparar Vascular Endotelial Growth Factor humano (VEGF) stock solución (5 ng / l). Disolver 5 g VEGF liofilizado en 1 ml de PBS que contenía 0,1% de BSA. Preparar 50 l alícuotas para almacenar a -20 ° C. Preparar una solución madre activina (10 ng / l). Disolver 10 mg liofilizados activina A en 1 ml de PBS que contenía 0,1% albúmina de suero bovino (BSA). Preparar 50 l alícuotas para almacenar a -20 ° C. Preparar inhibidor de Wnt Producción-2 (2-IWP) solución madre (10 mM). Disolver 2 mg IWP-2 en 429 l sulfóxido de dimetilo (DMSO). Preparar 10 l alícuotas para almacenar a -80 ° C. Preparar completa cardiaca inducción Medio. A 100 ml de Inducción cardíaca basal mediano, añadir 1 ml de 100x penicilina / estreptomicina, 1 ml de 100x L-glutamina, 500 l de transferrina, 1ml de ácido ascórbico recién descongelado, y 300 l de MTG. Desechar medio sin usar. 2. Preparación de la microplaca NOTA: Todos los pasos deben realizarse en una cabina de seguridad biológica. Añadir 0,5 ml de solución de lavado (componente del kit) a cada pocillo que se utilizará en el plato. Para asegurarse de que los contactos de la solución toda la superficie interior de cada pocillo, se centrifuga la placa a 840 xg durante 2 min. Incubar la placa durante 30 a 60 min a TA. Aspirar el líquido de lavado de los pocillos. Lavar cada pocillo dos veces de la siguiente manera: Añadir 1 ml de PBS a cada pocillo, se centrifuga la placa a 840 xg durante 2 minutos, y luego aspirar el PBS. 3. Formación de HPSC agregados en la microplaca NOTA: Todos los pasos deben realizarse en una cabina de seguridad biológica. Coloque medio de lavado en un baño de agua a 37 °. NOTA: El volumen requerido = 1 ml x número de pozos de HPSC que se disocia. Disociar hPSCs a células individuales NOTA: Estos pasos describen la disociación de las células cultivadas en placas de 6 pocillos – los volúmenes de reactivos se pueden escalar proporcionalmente para diferentes formatos de cultivo. Aspirar el medio de cultivo de cada cultivo HPSC bien para la disociación. Enjuague cada pocillo con 1 ml de enzima de disociación y, a continuación aspirar de inmediato la enzima de disociación de cada pocillo. NOTA: enzima de disociación residual debe ser suficiente para disociar las células. Incubar la placa a 37 ° C durante 3 min. Añadir 1 ml de medio de lavado a cada pocillo y mecánicamente disociar las células de la superficie de cultivo de tejidos pipeteando el medio de lavado con una micropipeta P1000 sobre la superficie de cultivo de tejidos. Si la disociación parece ser permanecen grupos incompletos y celulares, pasar la suspensión a través de un colador en este punto. Transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y almacenarel tubo en la incubadora, mientras que el recuento de células se lleva a cabo en la siguiente etapa. Realizar un recuento de células: Tomar una muestra de 10 l de la suspensión celular recogida en el paso anterior. Añadir 30 l de azul de tripano y mezclar bien la suspensión con la pipeta. Transferencia de 10 l de células teñidas con azul de tripano para cada cámara de un hemocitómetro y visualizar bajo el microscopio invertido con el objetivo de 10X. Contar las células. A partir de los resultados del conteo de células, calcular cuántos pozos se pueden sembrar a 1,2 x 10 6 células por pocillo de la microplaca. Calcula Agregación Medio necesaria para sembrar las células en 1 ml por pocillo. Para preparar el medio de agregación. Por 10 ml de completa cardíaca inducción mediana, añadir 0,5 l de solución madre de BMP4 (concentración final = 0,5 ng / ml) y Y-27632 ROCA inhibidor (concentración final = 10 mM). Retire el tubo cónico que contiene los hPSCs de la incubadora y centrifuge el tubo a 200 xg durante 5 min. Aspirar el medio de lavado y resuspender las células en medio de agregación a una densidad de 1,2 x 10 6 células por ml. Aspirar la solución de lavado PBS de cada pocillo de la microplaca. Usando una micropipeta P1000, distribuir uniformemente y de semillas de 1 ml de la suspensión celular a cada pocillo en la placa de micropocillos. Para sembrar un gran número de pozos, vórtice periódicamente la suspensión de células para evitar la sedimentación. Centrifugar la placa a 200 xg durante 5 min. Examinar la placa bajo el microscopio para confirmar las células han hecho girar a la parte inferior de cada pocillo. Se incuba la placa durante 24 horas a 37 ° C en un 5% de CO2, 5% de O2 (hipoxia) incubadora. 4. Inducción cardíaca Etapa 1 Un día después de la agregación (día 1), preparar el volumen requerido de la Etapa 1 medio de inducción (para una placa de 24 pocillos, de volumen = 1 ml x número de pozos). Para 1 ml de completamedio de inducción cardiaca, añadir 1 l de BMP4 solución madre (concentración final = 10 ng / ml), 0,5 l de bFGF solución madre (concentración final = 5 ng / ml), y 0,6 l de activina A (concentración final = 6 ng / ml). Coloque el medio en un baño de agua C 37 ° durante al menos 15 min. Retire la placa de micro de la incubadora. De los agregados bajo el microscopio. En comparación con la agregación inmediatamente después de la centrifugadora, que deben aparecer intacta, con bordes lisos (más redonda y cuadrada de menos que el día anterior). Eliminar el sobrenadante sin perturbar los agregados dentro de los pocillos: Mantenga la microplaca en posición horizontal (es decir., No lo incline). Para cada pozo de la placa de micro, coloque la punta de una micropipeta P1000 en la superficie del medio de cultivo y contra el borde del pozo. Retire lentamente el medio, teniendo cuidado de no molestar a los agregados en el fondo de los pocillos. Después de la reducción de tque el nivel medio de alrededor de 1 a 2 mm de la superficie de micropocillos texturizado, lentamente incline la placa para recoger medio en un lado del pozo (una vez que el volumen es suficientemente baja, el movimiento del fluido se reduce en gran medida y es más fácil para evitar agregados conseguir levantado fuera de sus pocillos individuales). Lentamente pipetear a cabo el medio restante en el pozo. Para agregar fresco Etapa 1 Inducción Medium garantizando al mismo tiempo los agregados permanecen en sus pocillos individuales: Dibuje 1 ml de medio de inducción de la etapa 1 con una micropipeta P1000. Mantenga la punta de la pipeta contra el borde interior del pozo y muy lentamente dispensar el medio contra la pared interior del pozo. Repita para los pocillos restantes. Devolver la placa a la incubadora en condiciones de hipoxia durante 3 días. 5. cardíaca inducción Etapa 2 En el día 4, el lugar medio de lavado (volumen = número de pocillos x 2 ml) en un baño de agua a 37 ° C durante un mínimo de 15 min. Preparar el volumen necesario de la Etapa 2 de inducción Medium (volumen = número de pocillos x 1 ml): por ml de completa cardíaca inducción mediana, añadir 2 l de solución de VEGF de la (concentración final = 10 ng / ml) y 0,5 l IWP-2 solución madre (concentración final = 5 M). Coloque el preparado de la etapa 2 medio de inducción en un baño de agua a 37 ° durante un mínimo de 15 min. Utilizando una pipeta serológica de 5 ml, cosechar los agregados de cada pocillo de la microplaca y recoger la suspensión total en unos 15 ml tubo cónico (obtener hasta 10 pozos por tubo de 15 ml). Permitir que los agregados se asienten durante 15 minutos en una incubadora hipóxica. NOTA: Este paso es importante para separar las células individuales y los restos celulares de los agregados intactos. Aspirar el sobrenadante y resuspender cuidadosamente los agregados en 10 ml de la pre-calentado medio de lavado para eliminar las citoquinas inductivas residuales (por ejemplo, activina A es una molécula de señalización potente incluso a muy bajo concentrations). Centrifugar los agregados a 50 xg durante 2 min. Aspirar el sobrenadante. Volver a suspender los agregados granulados en la pre-calentado por inducción 2 Medio. Transferir la suspensión agregada a una placa de 24 pocillos de ultra bajo de fijación (ULA) a 1 ml por pocillo. Observar los agregados bajo el microscopio como uniforme, grupos de células cerradas. Incubar en condiciones de hipoxia hasta el día 6. 6. cardíaca inducción Etapa 3 En el día 6, preparar el volumen necesario de la Etapa 3 Inducción Medium (volumen = número de pocillos x 1 ml). Para 1 ml de completa cardíaca inducción mediana, añadir 2 l solución de VEGF de la (concentración final = 10 ng / ml), y 0,5 l de solución madre de bFGF (concentración final = 5 ng / ml). Coloque medio de inducción de la etapa 3 preparado en un baño de agua a 37 ° durante un mínimo de 15 min. Usar una pipeta de 5 ml serológica para transferir los agregados a tubos de 15 ml cónicos, la puesta en común de hasta 10 ml de agregados por tubo. Permita 10 minutos para los agregados se asienten. Aspirar el sobrenadante y resuspender los agregados en el pre-calentado Etapa 3 Inducción Medium. Utilizando una pipeta serológica de 5 ml, redistribuir los agregados en una placa de 24 pocillos ULA a 1 ml por pocillo. En el día 10, preparar el volumen necesario de la Etapa 3 Inducción Medium (volumen = número de pocillos x 1 ml) según el paso 6.1. Utilice a 5 ml pipeta serológica para transferir los agregados a tubos de 15 ml cónicos, la puesta en común de hasta 10 ml de agregados por tubo. Permita 10 minutos para los agregados se asienten. Aspirar el sobrenadante y resuspender los agregados en la Etapa 3 Inducción Medium. Utilizando una pipeta serológica de 5 ml, redistribuir los agregados en una placa de 24 pocillos ULA a 1 ml por pocillo. Incubar en condiciones hipóxicas durante dos días. En el día 12, comenzará la incubación de las células a los niveles de oxígeno de normoxia durante el resto del periodo de cultivo (37 ° C, 20% de O 2, 5% de CO 2). NOTA:Después de este punto de tiempo, las células ya no son cultivadas bajo condiciones de hipoxia. Repita este cambio de medio completo (pasos 6.2 y 6.3) cada 4 días, comenzando día 14 hasta la cosecha de células (típicamente, las concentraciones máximas de cardiomiocitos se observan después de día 14 de diferenciación). 7. Análisis de Flujo Citometría de troponina T (TnT) Expresión de frecuencia de salida de micropocillos de Cultura Disociar los agregados de la siguiente manera: Use un 5 ml pipeta serológica para transferir 1 bien de los agregados a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar los agregados a 50 xg durante 2 min y aspirar cuidadosamente el sobrenadante. Añadir 1 ml de solución de 1 mg / ml de colagenasa tipo II recién disuelto a los agregados. Transferir la suspensión agregada a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Incubar los agregados en colagenasa de tipo II durante la noche a temperatura ambiente. El día siguiente, utilizar una micropipeta P1000 para disociar los agregados suavementeen una suspensión de células individuales homogénea. Si los agregados no se disocian fácilmente, resolver los agregados, aspirar el sobrenadante, y se incuban los agregados en 700 l de enzima de disociación para 1-2 min a TA. pipetear suavemente los agregados de 1 a 2 veces con una micropipeta P1000 disociar. Diluir la enzima de disociación: Añadir 700 l de medio de lavado que contienen 14 l de 1 mg solución madre de ADNasa ml /. Tomar una muestra de 10 l para realizar un recuento de células y centrifugar la suspensión restante utilizando una microcentrífuga de sobremesa a 300 xg durante 2 min. Realizar un recuento de células: Mancha de la muestra de recuento 10 l con un volumen igual de Trypan Blue y contar con un hemocitómetro. Retire el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml que contiene las células restantes de la microcentrífuga. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células, a una concentración de 200.000 a 500.000 células por 100 l, en solución salina equilibrada de Hanks que contiene2% de suero bovino fetal (HF). Para cada condición, la transferencia de 100 l de suspensión de células por pocillo a 2 pocillos de una placa de 96 pocillos (un pocillo se tiñeron con el anticuerpo cTnT y el otro será el control anticuerpo secundario). Centrifugar la placa a 300 xg durante 2 min. Eliminar el sobrenadante con una micropipeta multicanal. Fijar las células: Añadir 200 l de solución de fijación (componente del kit) por pocillo y se incuba la placa durante 15 min a TA. Centrifugar la placa a 300 xg durante 2 min. Utilice una micropipeta multicanal de retirar cuidadosamente el sobrenadante de los pocillos. Desechar el sobrenadante en un contenedor de residuos paraformaldehído. Se lavan las células fijadas dos veces: Añadir 200 l de HF a cada pocillo. Centrifugar la placa a 300 xg durante 2 min. Aspirar el sobrenadante y repetir el paso de lavado una vez más. Las células fijadas se pueden almacenar durante un máximo de una semana de HF a 4 ° C. Permeabilizar las células: Centrifugar la placa a 300xg durante 2 min. Añadir 100 l de permeabilización de la solución (componente del kit) a cada pocillo y se incuba la placa a temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar la placa a 300 xg durante 2 min y aspirar el sobrenadante. Preparar una mezcla maestra de anti-cTnT en HF en la concentración óptima para el número de lote dado (La dilución óptima debe determinarse por titulación y típicamente varía de 1: 500 a 1: 2000). Para cada condición (2 pozos por condición), añadir 100 l de mezcla maestra a un pocillo (muestra teñida) y 100 l de HF sin formato a otro bien (control anticuerpo secundario). Se incuban las células a 4 ° C durante 30 min. Centrifugar las células a 300 xg durante 2 min. Aspirar el sobrenadante y añadir 200 l de HF por pocillo. Repita este paso de lavado una vez más. Preparar una mezcla maestra de la secundaria de anticuerpos. Transferir un volumen de HF que corresponde a 100 l por cada pocillo (control de anticuerpo secundario ycTnT-manchado) se está tratando. Añadir 1 l de cabra anti-ratón-APC anticuerpo secundario por cada 200 l de HF (dilución 1: 200). Manchar las muestras. Añadir 100 l de solución de tinción a cada pocillo (tanto el control de anticuerpo secundario y pozos teñidas con anti-cTnT). Se incuban las células en la oscuridad a 4 ° C durante 30 minutos (mantenga la placa de cubierta o en la oscuridad después de la adición de anticuerpo secundario fluorescente para evitar photobleaching). Centrifugar las células a 300 xg durante 2 min. Aspirar el sobrenadante y añadir 200 l de HF por pocillo. Repita este paso de lavado una vez más. Transferir las muestras a 5 ml de fondo redondo de flujo citómetro de tubos de análisis y realizar citometría de flujo para la señal en el canal de APC utilizando los protocolos estándar para el instrumento 19.