Aggregate ottimizzazione Dimensione in pozzetti per sospensione a base cardiaco differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti

1. Preparazione dei Componenti medie Preparare Wash Medium. Per 100 ml di DMEM / F12, aggiungere 1 ml di 100x penicillina / streptomicina (Pen / Strep), 1 ml di 100x L-glutammina, e 5 ml di sostituzione del siero. Preparare la chimica definita basale cardiaca induzione medio in base alle istruzioni del produttore. Preparare i seguenti reagenti azionari per i supporti che verranno utilizzati in questo protocollo. Acido L-ascorbico: Preparare una soluzione stock di 5 mg per ml in 4 ° C, acqua distillata ultrapura sterile in una provetta conica. Lasciare questa soluzione su ghiaccio e agitare la provetta periodicamente fino il soluto è completamente sciolto. Filtro-sterilizzare la soluzione Acido Ascorbico con un filtro siringa da 0,22 micron. Preparare 1 ml della soluzione di acido ascorbico e memorizzare questi aliquote a -20 ° C. Utilizzare una un'aliquota appena scongelato ogni mezzo di tempo è preparato. Il giorno di preparazione medio, Diluire 13 ml di monotioglicerolo (MTG) in 1 ml di Basal Cardiac induzione Medium. Eliminare inutilizzato, MTG diluito. Preparare 1 ml aliquote di transferrina (30 mg / ml) per conservare a -20 ° C. Conservare aliquote scongelato a 4 ° C per un massimo di 3 mesi. Preparare 4 mM di acido cloridrico (HCl) contenente 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA). In una cappa aspirante, aggiungere 30 ml di soluzione 6,0 N HCl a 50 ml di acqua distillata ultra-pura. Filtro-sterilizzare la soluzione con un filtro a siringa da 0,22 micron. Aggiungere 2 ml di soluzione di BSA 25% alla soluzione 50 ml di HCl. Preparare tampone fosfato (PBS) contenente 0,1% di BSA. Aggiungere 20 ml di soluzione di BSA 25% per ml di PBS. Preparare umana proteina morfogenetica 4 (4-BMP) soluzione di riserva (10 ng / ml). Sciogliere 10 mg liofilizzato BMP-4 in 1 ml di 4 soluzione tampone mM HCl contenente 0,1% BSA. Preparare 50 ml aliquote per conservare a -20 ° C. Preparare umana Fibroblast Growth Factor 2 soluzione madre (bFGF)(10 ng / ml). Sciogliere 10 mg liofilizzato bFGF in 1 ml di tampone fosfato (PBS) contenente 0,1% di BSA. Preparare 50 ml aliquote per conservare a -20 ° C. Preparare fattore umano di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF) soluzione madre (5 ng / ml). Sciogliere 5 mcg VEGF liofilizzato in 1 ml di PBS contenente 0,1% BSA. Preparare 50 ml aliquote per conservare a -20 ° C. Preparare Activin Una soluzione madre (10 ng / ml). Sciogliere 10 mg liofilizzati Activin A in 1 ml di PBS contenente 0,1% di sieroalbumina bovina (BSA). Preparare 50 ml aliquote per conservare a -20 ° C. Preparare inibitore di Wnt Production-2 (2-IWP) soluzione di riserva (10 mm). Sciogliere 2 mg IWP-2 in 429 ml dimetilsolfossido (DMSO). Preparare 10 ml aliquote per conservare a -80 ° C. Preparare completa cardiaco induzione media. Per 100 ml di basale cardiaca induzione media, aggiungere 1 ml di 100x Pen / Strep, 1 ml di 100x L-glutammina, 500 ml di transferrina, 1ml di acido ascorbico appena scongelato, e 300 ml di MTG. Eliminare medio inutilizzato. 2. Preparazione del micropiastre NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica. Aggiungere 0,5 ml di soluzione di risciacquo (componente kit) a ciascun pozzetto che verrà utilizzato sulla piastra. Per garantire che i contatti soluzione l'intera superficie interna ciascun micropozzetto, centrifugare la piastra a 840 g per 2 minuti. Incubare la piastra per 30 a 60 minuti a temperatura ambiente. Aspirare la soluzione di risciacquo dai pozzi. Lavare ciascun pozzetto due volte come segue: Aggiungere 1 ml di PBS a ciascun pozzetto, centrifugare la piastra a 840 xg per 2 minuti, quindi aspirare il PBS. 3. La formazione di HPSC aggregati nel micropiastre NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica. Lavatoio medio a bagnomaria C 37 °. NOTA: il volume richiesto = 1 ml x numero di pozzi di HpSC che sarà dissociato. Dissociarsi hPSCs a singole cellule NOTA: Questi passaggi descrivono la dissociazione delle cellule in coltura su 6 pozzetti – i volumi di reagente possono essere scalati proporzionalmente per i diversi formati di cultura. Aspirare il terreno di coltura di ogni cultura HPSC bene per la dissociazione. Lavare ogni pozzetto con 1 ml di enzima dissociazione e quindi aspirare immediatamente l'enzima dissociazione da ogni pozzetto. NOTA: residua enzimatica dissociazione dovrebbe essere sufficiente per dissociare le cellule. Incubare la piastra a 37 ° C per 3 min. Aggiungere 1 ml di Wash medio di ogni bene e dissociarsi meccanicamente le cellule dalla superficie di coltura tissutale pipettando Medium Wash con una micropipetta P1000 sulla superficie coltura di tessuti. Se la dissociazione sembra essere ciuffi incompleti e cellule rimangono, passare la sospensione attraverso un filtro a questo punto. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 ml e conservareil tubo in incubatrice mentre il conteggio delle cellule è effettuata nella fase successiva. Eseguire un numero di celle: Prelevare 10 ml di sospensione cellulare raccolte nel passaggio precedente. Aggiungere 30 ml di Trypan Blue e mescolare bene la sospensione pipettando. Trasferire 10 ml di cellule Trypan Blue-macchiato a ciascuna camera di un emocitometro e visualizzare al microscopio invertito con l'obiettivo 10X. Contare le cellule. Dai risultati di conteggio delle cellule, calcolare quanti pozzi possono essere seminati in 1,2 x 10 6 cellule per pozzetto della micropiastra. Calcola aggregazione medio richiesto per seminare le cellule a 1 ml per bene. Preparare mezzo di aggregazione. Per 10 ml di completo cardiaco induzione medio, aggiungere 0,5 ml di soluzione madre BMP4 (concentrazione finale = 0,5 ng / ml) e Y-27632 ROCK Inhibitor (concentrazione finale = 10 micron). Rimuovere il tubo conico contenente le hPSCs dal termostato e centrifuge la provetta a 200 xg per 5 min. Aspirare il mezzo di lavaggio e risospendere le cellule in terreno aggregazione ad una densità di 1,2 x 10 6 cellule per ml. Aspirare la soluzione di lavaggio PBS da ciascun pozzetto della micropiastra. Usando una micropipetta P1000, distribuire uniformemente e semi di 1 ml di sospensione cellulare a ciascun pozzetto nella piastra. Per seminare un gran numero di pozzi, vortice periodicamente la sospensione cellulare per evitare la sedimentazione. Centrifugare la piastra a 200 xg per 5 min. Osservare la lastra sotto il microscopio per confermare cellule sono filata a fondo di ciascun pozzetto. Incubare la piastra per 24 ore a 37 ° C in 5% CO 2, 5% O 2 (ipossica) incubatore. 4. cardiaca induzione Stage 1 Un giorno dopo l'aggregazione (giorno 1), preparare il volume richiesto di Fase 1 di media induzione (per un piatto ben 24, volume = 1 ml x numero di pozzi). Per 1 ml di completoinduzione a media cardiaca, aggiungere 1 ml di BMP4 soluzione madre (concentrazione finale = 10 ng / ml), 0,5 ml di soluzione madre bFGF (concentrazione finale = 5 ng / ml), e 0,6 ml di Activin A (concentrazione finale = 6 ng / ml). Posizionare il mezzo a bagnomaria C 37 ° per almeno 15 min. Rimuovere la piastra di micropozzetti dal termostato. Gli aggregati sotto il microscopio. Rispetto al immediatamente aggregazione post-centrifuga, essi dovrebbero apparire intatta con bordi arrotondati (più rotondo e meno quadrata rispetto al giorno precedente). Rimuovere il surnatante senza disturbare gli aggregati all'interno dei pozzetti: Tenere la micropiastra orizzontale livello (es., Non inclinarlo). Per ciascun pozzetto nella piastra, inserire la punta di una micropipetta P1000 alla superficie del terreno di coltura e contro il bordo del pozzo. Lentamente rimuovere il supporto, facendo attenzione a non disturbare gli aggregati al fondo dei pozzetti. Dopo aver ridotto tegli livello medio di circa 1 a 2 mm dalla superficie dei pozzetti strutturato, inclinare lentamente la piastra di raccogliere media su un lato del pozzo (quando il volume è sufficientemente bassa, movimento fluido è molto ridotto ed è più facile evitare aggregati sempre sollevata dalle loro singoli pozzetti). Lentamente pipettare il supporto rimanente nel pozzo. Per aggiungere fresco Fase 1 induzione Media garantendo al tempo stesso gli aggregati rimangono nei loro singoli pozzetti: Disegna 1 ml della Fase 1 di media ad induzione con una micropipetta P1000. Tenere la punta della pipetta contro il bordo interno del pozzo e dispensare lentamente il mezzo contro la parete interna del pozzo. Ripetere l'operazione per i pozzetti rimanenti. Riportare la piastra per l'incubatore in condizioni di ipossia per 3 giorni. 5. cardiaca induzione Fase 2 Il giorno 4, posto lavaggio medio (volume = numero di pozzetti x 2 ml) in un bagno di acqua a 37 ° C per almeno 15 min. Preparare il volume necessario di Fase 2 induzione media (volume = numero di pozzi x 1 ml): per ml di completo cardiaco induzione medio, aggiungere 2 ml di soluzione di VEGF magazzino (concentrazione finale = 10 ng / ml) e 0,5 ml IWP-2 soluzione madre (concentrazione finale = 5 micron). Posizionare il preparato mezzo induzione Fase 2 in un bagno d'acqua a 37 ° C per almeno 15 min. Usando una pipetta da 5 ml sierologica, raccogliere gli aggregati da ciascun pozzetto della micropiastra e raccogliere la sospensione di aggregazione in un tubo da 15 ml (raccogliere fino a 10 pozzetti per 15 ml di tubo). Lasciare gli aggregati di stabilirsi per 15 minuti in un incubatore ipossico. NOTA: Questo passaggio è importante separare singole cellule e detriti cellulari dagli aggregati intatte. Aspirare il surnatante con cura e risospendere gli aggregati in 10 ml di Wash medio pre-riscaldato per rimuovere le citochine induttivi residui (ad esempio, Activin A è una molecola di segnalazione potente, anche a bassissima concentrations). Centrifugare gli aggregati a 50 xg per 2 min. Aspirare il surnatante. Risospendere gli aggregati in pellet nel pre-riscaldato a induzione 2 Media. Trasferire la sospensione aggregato ad una piastra 24 pozzetti attacco ultra-bassa (ULA) a 1 ml per bene. Osservare gli aggregati al microscopio più uniforme, gruppi di cellule strette. Incubare in condizioni di ipossia fino al giorno 6. 6. cardiaco induzione Fase 3 Il giorno 6, preparare il volume necessario di Fase 3 induzione media (volume = numero di pozzi x 1 ml). Per 1 ml di Complete cardiaco induzione medio, aggiungere 2 ml soluzione VEGF magazzino (concentrazione finale = 10 ng / ml), e 0,5 ml di soluzione madre bFGF (concentrazione finale = 5 ng / ml). Posizionare preparati induzione a media Fase 3 in un bagno d'acqua a 37 ° C per almeno 15 min. Utilizzare una pipetta 5 ml sierologica per trasferire gli aggregati a 15 ml provette coniche, mettendo in comune fino a 10 ml di aggregaziones per provetta. Lasciare 10 minuti per gli aggregati di stabilirsi. Aspirare il surnatante e risospendere gli aggregati nella Fase 3 di induzione medio pre-riscaldato. Usando una pipetta da 5 ml sierologica, ridistribuire gli aggregati in un 24-pozzetti ULA a 1 ml per bene. Il giorno 10, preparare il volume necessario di Fase 3 induzione media (volume = numero di pozzi x 1 ml) come da Passo 6.1. Utilizzare un 5 ml pipetta sierologica per trasferire gli aggregati a 15 ml provette coniche, mettendo in comune fino a 10 ml di aggregati per provetta. Lasciare 10 minuti per gli aggregati di stabilirsi. Aspirare il surnatante e risospendere gli aggregati nella Fase 3 induzione media. Usando una pipetta da 5 ml sierologica, ridistribuire gli aggregati in un 24-pozzetti ULA a 1 ml per bene. Incubare in condizioni di ipossia per due giorni. Il giorno 12, inizierà incubando le cellule a livelli di ossigeno normossia per il resto del periodo di coltura (37 ° C, 20% O 2, 5% CO 2). NOTA:Dopo questo punto di tempo, le cellule non sono coltivate in condizioni di ipossia. Ripetere questo completo cambio medio (i punti 6.2 e 6.3) ogni 4 giorni, a partire giorno 14 fino alla raccolta delle cellule (in genere, le concentrazioni di cardiomiociti di picco si osservano dopo giorno 14 di differenziazione). 7. flusso Analisi Citometria di cardiaca Troponina T (cTnT) Espressione Frequenza di uscita Micropiastra Cultura Dissociare il aggregati come segue: Utilizzare un 5 ml pipetta sierologica per trasferire 1 e di aggregati di un tubo da 15 ml. Centrifugare gli aggregati a 50 xg per 2 minuti ed aspirare accuratamente il surnatante. Aggiungere 1 ml di fresco disciolto soluzione 1 mg / ml Collagenasi tipo II agli aggregati. Trasferire la sospensione di aggregazione in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Incubare gli aggregati di Collagenasi di tipo II notte a temperatura ambiente. Il giorno seguente, utilizzare una micropipetta P1000 a dissociarsi delicatamente gli aggregatiin una sospensione singola cella omogenea. Se gli aggregati non facilmente dissociano, risolvere gli aggregati, aspirare il surnatante, e incubare gli aggregati in 700 ml di dissociazione enzimatica per 1-2 minuti a temperatura ambiente. Delicatamente pipetta gli aggregati 1 a 2 volte con una micropipetta P1000 a dissociarsi. Diluire l'enzima di dissociazione: Aggiungere 700 ml di Wash mezzo contenente 14 ml di 1 mg / ml di soluzione DNAsi. Prelevare 10 microlitri di eseguire una conta cellulare e centrifugare la sospensione rimanente utilizzando una microcentrifuga da banco a 300 xg per 2 min. Eseguire un numero di celle: Colorare il campione di conteggio 10 microlitri con un uguale volume di Trypan Blue e contare con un emocitometro. Rimuovere il tubo di 1,5 ml microcentrifuga contenente le restanti cellule dal microcentrifuga. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule, ad una concentrazione di 200.000 a 500.000 cellule per 100 ml, in Hanks Balanced Salt Solution contenente2% siero fetale bovino (HF). Per ogni condizione, trasferire 100 l di sospensione cellulare per pozzetto a 2 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti (un pozzo sarà macchiato con l'anticorpo cTnT e l'altro sarà il controllo anticorpo secondario). Centrifugare la piastra a 300 xg per 2 min. Rimuovere il surnatante con una micropipetta multicanale. Fissare le cellule: Aggiungere 200 ml di soluzione di fissaggio (componente del kit) per pozzetto e incubare la piastra per 15 minuti a temperatura ambiente. Centrifugare la piastra a 300 xg per 2 min. Utilizzare una micropipetta multicanale di ritirare con attenzione il surnatante dai pozzetti. Smaltire il surnatante in un contenitore per rifiuti paraformaldeide. Lavare le cellule fissate due volte: Aggiungere 200 ml di HF in ogni pozzetto. Centrifugare la piastra a 300 xg per 2 min. Aspirare il surnatante, e ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta. Cellule fisse possono essere conservate per un massimo di una settimana in alta frequenza a 4 ° C. Permeabilize le cellule: Centrifugare la piastra a 300xg per 2 min. Aggiungere 100 ml di soluzione permeabilizzazione (componente del kit) per ciascun pozzetto ed incubare la piastra a temperatura ambiente per 5 min. Centrifugare la piastra a 300 xg per 2 minuti e aspirare il surnatante. Preparare una master mix di anti-cTnT in HF alla concentrazione ottimale per un dato numero di lotto (La diluizione ottimale deve essere determinata per titolazione e in genere varia da 1: 500 a 1: 2.000). Per ogni condizione (2 pozzi per condizione), aggiungere 100 ml di master mix per un bene (campione colorato) e 100 ml di HF pianura verso l'altro bene (controllo anticorpo secondario). Incubare le cellule a 4 ° C per 30 min. Centrifugare le cellule a 300 xg per 2 min. Aspirare il surnatante e aggiungere 200 ml di HF per pozzetto. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta. Preparare una master mix dell'anticorpo secondario. Trasferire un volume di HF che corrisponde a 100 l per ogni bene (controllo anticorpo secondario ecTnT-macchiato) da trattare. Aggiungere 1 ml di anticorpo secondario di capra anti-topo-APC per 200 ml di HF (diluizione 1: 200). Colorare i campioni. Aggiungere 100 ml di soluzione colorante in ogni pozzetto (sia il controllo anticorpo secondario e pozzi anti-cTnT-macchiati). Incubare le cellule al buio a 4 ° C per 30 min (mantenere placca coperta o al buio dopo l'aggiunta di anticorpo secondario fluorescente per evitare photobleaching). Centrifugare le cellule a 300 xg per 2 min. Aspirare il surnatante e aggiungere 200 ml di HF per pozzetto. Ripetere questa fase di lavaggio ancora una volta. Trasferire i campioni da 5 ml flusso fondo tondo citometro tubi di analisi ed eseguire citometria a flusso per il segnale nel canale APC utilizzando i protocolli standard per lo strumento 19.