Aggregate Optimization Taille en micropuits pour base Suspension-cardiaque Différenciation des pluripotentes humaines Cellules souches

1. Préparation des composants Medium Préparer Wash Medium. Par 100 ml de DMEM / F12, ajouter 1 ml de 100X pénicilline / streptomycine (Pen / Strep), 1 ml de L-glutamine 100X et 5 ml de remplacement de sérum. Préparer la constitution chimique définie Basal cardiaque Induction moyenne selon les instructions du fabricant. Préparer les réactifs d'achat d'actions suivantes pour les médias qui seront utilisés dans ce protocole. Acide L-Ascorbique: Préparer une solution mère de 5 mg par ml dans 4 ° C, l'eau distillée ultra pure stérile dans un tube conique. Laissez cette solution sur la glace et le tube vortex périodiquement jusqu'à ce que le soluté soit complètement dissous. Filtre à stériliser la solution d'acide ascorbique à l'aide d'un filtre à seringue de 0,22 um. Préparer aliquotes de 1 ml de la solution d'acide ascorbique et de stocker ces aliquotes à -20 ° C. Utilisez un aliquote fraîchement décongelé chaque milieu de temps est préparé. Le jour de la préparation du milieu, Diluer 13 pi de monothioglycérol (MTG) dans 1 ml de Basal cardiaque Induction Medium. Jeter utilisé, MTG dilué. Préparer aliquotes de 1 ml de la transferrine (30 mg / ml) pour stocker à -20 ° C. Magasin aliquotes décongelée à 4 ° C pendant jusqu'à 3 mois. Préparer l'acide 4 mM chlorhydrique (HCl) contenant 0,1% de sérum-albumine bovine (BSA). Dans une hotte aspirante, ajouter 30 ul de solution 6,0 N de HCl à 50 ml d'eau distillée ultra pure. Filtre à stériliser la solution en utilisant un filtre à seringue de 0,22 um. Ajouter 2 ml de solution de BSA à 25% à la solution 50 ml de HCl. Préparer une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,1% de BSA. Ajouter 20 pl de solution de BSA à 25% par ml de PBS. Préparer Human Bone Morphogenetic Protein 4 (4-BMP) solution mère (10 ng / ul). Dissoudre 10 ug de BMP-4 lyophilisé dans 1 ml d'une solution tampon contenant 4 mM de HCl à 0,1% de BSA. Préparer 50 ul aliquotes pour stocker à -20 ° C. Préparer Human Fibroblast Growth Factor 2 (bFGF) solution mère(10 ng / ul). Dissoudre 10 pg de bFGF lyophilisé dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) contenant 0,1% de BSA. Préparer 50 ul aliquotes pour stocker à -20 ° C. Préparer Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) humain solution mère (5 ng / ul). Dissoudre 5 pg de VEGF lyophilisée dans 1 ml de PBS contenant 0,1% de BSA. Préparer 50 ul aliquotes pour stocker à -20 ° C. Préparer activine Une solution mère (10 ng / ul). Dissoudre 10 ug lyophilisées activine A dans 1 ml de PBS contenant 0,1% de sérumalbumine bovine (BSA). Préparer 50 ul aliquotes pour stocker à -20 ° C. Préparer Inhibiteur de Wnt production-2 (2-IWP) solution mère (10 mM). Dissoudre 2 mg IWP-2 dans 429 ul de diméthylsulfoxyde (DMSO). Préparer 10 ul aliquotes pour stocker à -80 ° C. Préparer Complete Cardiac Induction Medium. Pour 100 ml de Basal cardiaque Induction moyenne, ajouter 1 ml de 100x Pen / Strep, 1 ml de 100x L-glutamine, 500 pi de transferrine, 1ml d'acide ascorbique fraîchement décongelé et 300 pi de MTG. Jeter moyen utilisé. 2. Préparation de la plaque de micropuits NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. Ajouter 0,5 ml de solution de rinçage (composante de kit) à chaque puits qui sera utilisé sur la plaque. Pour veiller à ce que les contacts de la solution, la surface entière à l'intérieur de chaque puits, centrifuger la plaque à 840 g pendant 2 min. Incuber la plaque pendant 30 à 60 min à température ambiante. Aspirer la solution de rinçage des puits. Laver chaque puits deux fois comme suit: Ajouter 1 ml de PBS à chaque puits, la plaque centrifuge à 840 g pendant 2 min, puis aspirer le PBS. 3. Formation des HPSC Granulats dans la plaque de micropuits NOTE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une enceinte de sécurité biologique. Placez Wash Medium dans un bain d'eau C 37 °. NOTE: Le volume requis = 1 ml x nombre de puits de HpSC qui sera dissociée. Dissocier hPSCs à des cellules individuelles REMARQUE: Ces étapes décrivent la dissociation des cellules en culture sur plaques de 6 puits – les volumes de réactifs peuvent être mis à l'échelle proportionnellement pour les différents formats de culture. Aspirer le milieu de culture de chaque culture HPSC bien pour la dissociation. Rincer chaque puits avec 1 ml de la dissociation enzymatique, puis aspirer immédiatement l'enzyme de dissociation de chaque puits. NOTE: résiduelle enzyme de dissociation devrait être suffisante pour dissocier les cellules. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 3 min. Ajouter 1 ml de milieu de lavage dans chaque puits et se dissocier mécaniquement les cellules de la surface de culture de tissu en pipetant le milieu de lavage avec une micropipette P1000 sur la surface de culture tissulaire. Si la dissociation semble être des amas cellulaires incomplètes et restent, passer la suspension à travers une passoire à ce point. Transférer la suspension cellulaire à un tube conique de 15 ml et conserverle tube dans l'incubateur pendant que la numération cellulaire est effectuée dans l'étape suivante. Effectuer une numération cellulaire: Prélever un échantillon de 10 ul de la suspension cellulaire recueillie dans l'étape précédente. Ajouter 30 pi de bleu Trypan et mélanger la suspension bien par pipetage. Transférer 10 pl de cellules colorées au bleu Trypan à chaque chambre d'un hémocytomètre et de visualiser au microscope inversé à l'objectif 10X. Compter les cellules. D'après les résultats de comptage de cellules, calculer le nombre de puits peuvent être ensemencées à 1,2 x 10 6 cellules par puits de la plaque de micropuits. Calculer Agrégation moyen nécessaire pour ensemencer les cellules à 1 ml par puits. Préparer le milieu d'agrégation. Par 10 ml de Complete cardiaque Induction Medium, ajouter 0,5 pi de BMP4 solution mère (concentration finale = 0,5 ng / ml) et Y-27632 ROCK Inhibitor (concentration finale = 10 uM). Retirer le tube conique contenant les hPSCs de l'incubateur et centrifuge du tube à 200 xg pendant 5 min. Aspirer le milieu de lavage et de remettre en suspension les cellules dans un milieu d'agrégation à une densité de 1,2 x 10 6 cellules par ml. Aspirer la solution de lavage PBS de chaque puits de la plaque de micropuits. En utilisant une micropipette P1000, répartir uniformément et semences 1 ml de la suspension cellulaire à chaque puits sur la plaque de micropuits. Pour semer un grand nombre de puits, vortex périodiquement la suspension cellulaire pour empêcher la sédimentation. Centrifuger la plaque à 200 xg pendant 5 min. Observer la plaque sous le microscope pour confirmer les cellules ont filé au fond de chaque puits. Incuber la plaque pendant 24 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2, 5% de O 2 (hypoxique) incubateur. 4. cardiaque Induction Stage 1 Un jour suivant l'agrégation (jour 1), préparer le volume requis de l'étape 1 moyen d'induction (pour une plaque de 24 puits, volume = 1 ml x nombre de puits). Pour 1 ml de complètemilieu d'induction cardiaque, ajouter 1 pl de BMP4 solution mère (concentration finale = 10 ng / ml), 0,5 pi de solution mère bFGF (concentration finale = 5 ng / ml) et 0,6 pi d'activine A (concentration finale = 6 ng / mL). Placer le milieu dans un bain-marie à 37 ° C pendant au moins 15 min. Retirer la plaque de micropuits de l'incubateur. Inspecter les agrégats sous le microscope. Par rapport à l'agrégation immédiatement post-centrifugeuse, ils doivent apparaître intact avec des bords lisses (plus rond et moins carré que la veille). Retirer le surnageant sans déranger les agrégats à l'intérieur de la cupule: Tenir la plaque de micropuits horizontale (ie., Ne pas pencher). Pour chaque puits de la plaque de micropuits, placez la pointe d'une micropipette P1000 à la surface du milieu de culture et contre le bord du puits. Retirez lentement le moyen, en faisant attention à ne pas perturber les agrégats au fond de la cupule. Après réduction de til niveau moyen d'environ 1 à 2 mm de la surface de micropuits texturée, incliner lentement la plaque pour recueillir milieu d'un côté du puits (une fois que le volume est suffisamment faible, le mouvement du fluide est considérablement réduite et il est plus facile d'éviter les agrégats se lever de leurs micropuits individuels). pipette lentement le reste moyen dans le puits. Pour ajouter frais Etape 1 Induction moyenne tout en assurant les agrégats restent dans leurs micropuits individuels: Dessinez 1 ml de la phase 1 milieu d'induction avec une micropipette P1000. Maintenez la pointe de la pipette contre le bord intérieur du puits et distribuer très lentement le moyen contre la paroi intérieure du puits. Répétez l'opération pour les puits restants. Retourner la plaque dans l'incubateur dans des conditions hypoxiques pendant 3 jours. 5. Induction cardiaque Etape 2 Le jour 4, place de lavage moyen (volume = nombre de puits x 2 ml) dans un bain d'eau à 37 ° pour un minimum de 15 min. Préparer le volume nécessaire de la phase 2 Induction Medium (volume = nombre de puits x 1 ml): Par ml de Complete cardiaque Induction Medium, ajouter 2 pi de solution VEGF de stock (concentration finale = 10 ng / ml) et 0,5 ul IWP-2 solution mère (concentration finale = 5 uM). Placer le stade 2 préparé un milieu d'induction dans un bain d'eau à 37 ° C pendant un minimum de 15 min. En utilisant une pipette de 5 ml sérologiques, récolter les agrégats de chaque puits de la plaque de micropuits et de recueillir la suspension totale dans un tube de 15 ml conique (recueillir jusqu'à 10 puits par 15 ml tube). Permettre aux agrégats de se déposer pendant 15 minutes dans un incubateur à hypoxique. REMARQUE: Cette étape est importante pour séparer les cellules individuelles et les débris cellulaires des agrégats intacts. Aspirer le surnageant avec précaution et remettre en suspension les agrégats dans 10 ml de la pré-chauffé Wash Medium pour éliminer les cytokines inductifs résiduelles (par exemple, l' activine A est une molécule de signalisation puissante , même à très faible concentrations). Centrifuger les granulats à 50 x g pendant 2 min. Aspirer le surnageant. Resuspendre les agrégats granulées dans l'induction 2 Medium préchauffée. Transférer la suspension totale à une plaque de fixation ultra-bas 24 puits (ULA) à 1 ml par puits. Observer les agrégats sous le microscope comme uniforme, des amas de cellules serrées. Incuber dans des conditions hypoxiques jusqu'au jour 6. 6. cardiaque Induction Etape 3 Le jour 6, préparer le volume nécessaire de la phase 3 Induction Medium (volume = nombre de puits x 1 ml). Pour 1 ml de Complete cardiaque Induction Medium, ajoutez VEGF solution mère 2 pl (concentration finale = 10 ng / ml) et 0,5 pi de solution mère bFGF (concentration finale = 5 ng / ml). Placer préparé Etape 3 milieu d'induction dans un bain d'eau à 37 ° C pendant un minimum de 15 min. Utiliser une pipette 5 ml sérologiques pour transférer les agrégats à 15 ml tubes coniques, la mise en commun jusqu'à 10 ml d'agrégats par tube. Autoriser 10 min pour les agrégats de se déposer. Aspirer le surnageant et remettre les agrégats dans le pré-chauffé Etape 3 Induction Medium. En utilisant une pipette de 5 ml sérologiques, redistribuer les agrégats dans une plaque de 24 puits ULA à 1 ml par puits. Au jour 10, le volume nécessaire de préparer de l'étape 3 à induction moyenne (volume = nombre de puits x 1 ml) comme indiqué à l'étape 6.1. Utilisez 5 ml pipette sérologique pour transférer les agrégats à 15 ml tubes coniques, la mise en commun jusqu'à 10 ml d'agrégats par tube. Autoriser 10 min pour les agrégats de se déposer. Aspirer le surnageant et remettre les agrégats au stade 3 Induction Medium. En utilisant une pipette de 5 ml sérologiques, redistribuer les agrégats dans une plaque de 24 puits ULA à 1 ml par puits. Incuber dans des conditions hypoxiques pendant deux jours. Au jour 12, commencer l' incubation des cellules à des niveaux d'oxygène normoxiques pendant le reste de la période de culture (37 ° C, 20% de O 2, 5% CO 2). REMARQUE:Après ce point de temps, les cellules ne sont plus cultivées dans des conditions hypoxiques. Répétez cet échange milieu complet (étapes 6.2 et 6.3) tous les 4 jours, à partir de 14 jours jusqu'à la récolte de cellules (typiquement, les concentrations de cardiomyocytes pics sont observés après 14 jours de différenciation). 7. cytométrie de flux Analyse de Troponine T (cTnT) Expression Fréquence des micropuits Culture sortie Dissocier les agrégats comme suit: Utiliser une pipette de 5 ml sérologiques pour transférer 1 puits d'agrégats à un tube conique de 15 ml. Centrifuger les agrégats à 50 g pendant 2 min et aspirer soigneusement le surnageant. Ajouter 1 ml de solution fraîchement dissous 1 mg / ml de collagénase de type II aux agrégats. Transférer la suspension totale à un tube de 1,5 ml. Incuber les agrégats dans la collagénase de type II pendant une nuit à température ambiante. Le jour suivant, utiliser une micropipette P1000 pour dissocier doucement les agrégatsdans une suspension homogène de la cellule unique. Si les agrégats ne se dissocient pas facilement, régler les agrégats, aspirer le surnageant, et incuber les agrégats dans 700 ul de Dissociation enzymatique pour 1 à 2 min à température ambiante. pipeter doucement les agrégats 1 à 2 fois avec une micropipette P1000 à dissocier. Diluer l'enzyme de dissociation: Ajouter 700 pi de milieu de lavage contenant 14 pi de 1 mg / ml solution de DNase. Prenez un échantillon de 10 pi pour effectuer une numération cellulaire, et centrifuger la suspension restante en utilisant une microcentrifugeuse de paillasse à 300 g pendant 2 min. Effectuer une numération cellulaire: Colorer le 10 ul comptage échantillon avec un volume égal de bleu Trypan et compter en utilisant un hémocytomètre. Retirez le tube de 1,5 ml contenant les cellules restantes de la microcentrifugeuse. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les cellules à une concentration de 200 000 à 500 000 cellules par 100 pi, dans une solution saline équilibrée de Hanks contenant2% de sérum bovin fœtal (HF). Pour chaque condition, transférer 100 ul de suspension cellulaire par puits à 2 puits d'une plaque à 96 puits (un puits sera coloré avec l'anticorps cTnT et l'autre sera le contrôle de l'anticorps secondaire). Centrifuger la plaque à 300 g pendant 2 min. Retirer le surnageant avec une micropipette multicanaux. Fixer les cellules: Ajouter 200 pi de solution de fixation (composant du kit) par puits et incuber la plaque pendant 15 min à température ambiante. Centrifuger la plaque à 300 g pendant 2 min. Utilisez une micropipette multicanaux de retirer soigneusement le surnageant des puits. Jeter le surnageant dans un conteneur de déchets de paraformaldehyde. Laver les cellules fixées à deux reprises: Ajouter 200 pi de HF à chaque puits. Centrifuger la plaque à 300 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant, et répéter l'étape de lavage une fois de plus. Les cellules fixées peuvent être stockées pendant jusqu'à une semaine dans HF à 4 ° C. Perméabiliser les cellules: Centrifuger la plaque à 300g pendant 2 min. Ajouter 100 pi de solution de perméabilisation (composant du kit) à chaque puits et incuber la plaque à température ambiante pendant 5 min. Centrifuger la plaque à 300 g pendant 2 min et aspirer le surnageant. Préparer un mélange maître d'anti-cTnT en HF à la concentration optimale pour le numéro de lot donné (La dilution optimale doit être déterminée par titrage et est généralement comprise entre 1: 500 à 1: 2000). Pour chaque condition (2 puits par condition), ajouter 100 pi de mélange maître d'un puits (échantillon coloré) et 100 pi de HF plaine à l'autre bien (contrôle d'anticorps secondaire). Incuber les cellules à 4 ° C pendant 30 min. Centrifuger les cellules à 300 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant et ajouter 200 pi de HF par puits. Répétez cette étape de lavage une fois de plus. Préparer un mélange maître de l'anticorps secondaire. Transférer un volume de HF qui correspond à 100 pi pour chaque puits (contrôle de l'anticorps secondaire etcTnT tachée) traitée. Ajouter 1 pi d'anticorps secondaire de chèvre anti-souris-APC par 200 ul de HF (dilution 1: 200). Colorer les échantillons. Ajouter 100 pi de solution de coloration dans chaque puits (à la fois le contrôle de l'anticorps secondaire et les puits anti cTnT colorés). Incuber les cellules dans l'obscurité à 4 ° C pendant 30 min (garder la plaque couverte ou dans l'obscurité après avoir ajouté un anticorps secondaire fluorescent pour éviter photoblanchiment). Centrifuger les cellules à 300 g pendant 2 min. Aspirer le surnageant et ajouter 200 pi de HF par puits. Répétez cette étape de lavage une fois de plus. Transférer les échantillons à 5 ml flux fond rond cytomètre tubes d'analyse et d' effectuer de cytométrie en flux pour le signal dans le canal APC en utilisant les protocoles standards de l'instrument 19.