Imaging Gelöscht Embryonale und postnatale Hearts bei Einzelzell-Auflösung

Cardiac Morphogenese ist eine sequenzielle Ereignis, das die räumlich – zeitliche Organisation von vier verschiedenen Arten von Herzvorläuferzellen in verschiedene Sektoren des Herzens erforderlich ist , und erfordert auch mehrere Genregulationsnetzwerken diesen Prozess zu dirigieren die funktionelle Herz ^1,2 zu bilden. Cardiac Spezifikation, Differenzierung, Strukturierung und Kammer Reifung werden von kardiogenem Transkriptionsfaktoren ³ geregelt. Genetische Mutation oder posttranskriptionalen Aberration dieser Faktoren in Herzvorläuferzellen in entweder embryonale Letalität oder angeborene Herzfehler (CHD) ⁴ führen könnte. Die Studie von Herzmorphogenese erfordert ein Verständnis der inhärenten strukturellen Details in drei Dimensionen (3D) und einzelne Linie Herzvorläufer markierte Zelle während der Herzentwicklung verfolgt wird das Verständnis der Herzmorphogenese fördern. Eine Reihe von hochauflösenden Abschnitt basierte Tomographieverfahren wurden in th entwickelte vergangenen Jahrzehnten zu Bild Organstruktur ^5,6; Allerdings erfordern diese Verfahren teuer, spezialisierte Instrumente, umfangreiche Arbeit, und es fehlt ihnen detaillierte strukturelle Organisation auf Einzelzellauflösung in das endgültige Volumen rekonstruiert Bild ^7,8.

3D volumetrischen Bildgebung auf Einzelzellebene stellt ein Mittel Vorläuferzelldifferenzierung und Zellverhalten in vivo ⁷ zu untersuchen. Allerdings bleibt Gewebe Lichtstreuung das primäre Hindernis Zellen und Strukturen in 3D tief im Inneren des intakten Herzens Bildgebung. Lipide sind eine Hauptquelle der Lichtstreuung, und die Entfernung von Lipiden und / oder Einstellung des Brechungsindexunterschied zwischen Lipiden und deren Umgebung sind mögliche Ansätze zur Erhöhung der Gewebetransparenz ^8. In den letzten Jahren wurde eine Reihe von Gewebeclearingverfahren entwickelt, das Gewebe Opazität und Lichtstreuung zu reduzieren, wie BABB (Benzylalkohol und Benzyl benzoate-Gemisch) und DBE (Tetrahydrofuran und Dibenzylether); aber bei diesen Verfahren, Fluoreszenzlöschung bleibt ein Problem ^8-10. Die Lösungsmittelbasis hydrophile Methoden, wie SeeDB (Fructose / Thioglycerin) und 3DISCO (Dichlormethan / Dibenzylether), erhalten Fluoreszenzsignale, aber machen nicht das ganze Organ transparent ^7,8,11. Im Vergleich dazu macht die CLARITY Gewebe-Clearing – Verfahren der Organ transparent, aber es erfordert eine spezialisierte Elektrophoreseautomat Lipide zu entfernen ^8,12, ebenso wie PACT (passive Klarheit Technik), die auch Hydrogel ^7,13 Einbettung erfordert. Detaillierte Informationen zu allen verfügbaren Gewebe-Clearing – Verfahren, siehe Tabelle 1 in Richardson und Lichtman et al. ^7.

Im Jahr 2011 Hama et al. Serendipitously eine hydrophile Mischung 'Sca le' (Harnstoff, Glycerin und Triton X-100 – Gemisch) entdeckt , das macht das Gehirn der Maus und Embryo durchsichent während vollständig fluoreszierende Signale von markierten Klone ¹⁴ zu erhalten. Dies ermöglicht die Abbildung des intakten Gehirn in einer Tiefe von mehreren Millimetern und großen Rekonstruktion von neuronalen Populationen und Vorsprünge an einer subzellulären Auflösung. Susaki et al. weiter verbessert Sca le von Aminoalkoholen und entwickelte die "CUBIC" ( eine klare, uneingeschränkte Bildgebung des Gehirns Cocktails und Computeranalyse) Gewebe Clearing – Verfahren, das Phospholipid Solubilisierung reduziert Klärzeit erhöht und erlaubt für den Mehrfarbenfluoreszenzabbildung ⁸ hinzugefügt wird . In der vorliegenden Studie, die Vorteile der le Sca nehmen und CUBIC Gewebe Clearing Techniken und hochauflösende 3D – optischen Schneidens, einzelne Klone innerhalb des Herzens während der Herzentwicklung wurden unter Verwendung von Rosa26Cre ^ERT2 verfolgt ^15, R26R-Confetti ^16, & alpha; MHC-Cre ^17, cTnT-Cre ^18, </strong> NFATc1-Cre ¹⁹ und Rosa26-mTmG (mTmG) ²⁰ Mauslinien. Die Kombination der whole mount – Färbung (WMS) Verfahren weiterhin für die Färbung von anderen Proteinen in markierten Klone und für die Untersuchung ihres Verhaltens in einem 3D – Volumen Kontext erlaubt zuvor ^21,22 mit Gewebe Verrechnungsverfahren entwickelt. Die Kombination von Gewebe Clearing- und WMS ermöglicht ein besseres Verständnis der Rolle der verschiedenen Gene und Proteine ​​während der Herzentwicklung und der Ätiologie von angeborenen Herzfehlern. Dieses Protokoll kann angewandt werden, um andere Vorläuferzelldifferenzierung, Zellverhalten zu untersuchen und organ Morphogenese Ereignisse während der Entwicklung.