כינון צירי mitotic הבסיסי בטיפות אמולסיה שסתומים
Summary
The assembly and positioning of the mitotic spindle depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, motor proteins and cross-linkers. Here we present our recently developed methods in which the geometrical confinement of spherical emulsion droplets is used for the bottom-up reconstitution of basic mitotic spindles.
Abstract
Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and cross-linkers. Growing microtubules can generate pushing forces, while depolymerizing microtubules can convert the energy from microtubule shrinkage into pulling forces, when attached, for example, to cortical dynein or chromosomes. In addition, motor proteins and diffusible cross-linkers within the spindle contribute to spindle architecture by connecting and sliding anti-parallel microtubules. In vivo, it has proven difficult to unravel the relative contribution of individual players to the overall balance of forces. Here we present the methods that we recently developed in our efforts to reconstitute basic mitotic spindles bottom-up in vitro. Using microfluidic techniques, centrosomes and tubulin are encapsulated in water-in-oil emulsion droplets, leading to the formation of geometrically confined (double) microtubule asters. By additionally introducing cortically anchored dynein, plus-end directed microtubule motors and diffusible cross-linkers, this system is used to reconstitute spindle-like structures. The methods presented here provide a starting point for reconstitution of more complete mitotic spindles, allowing for a detailed study of the contribution of each individual component, and for obtaining an integrated quantitative view of the force-balance within the mitotic spindle.
Introduction
במהלך מיטוזה, הכרומוזומים של הגנום משוכפל מאורגנים בקו המשווה התא כדי להבטיח חלוקה שווה של כרומטידה אחות מעל לתאי הבת שהוקמה זה עתה. מיצוב ובידול כרומוזום מתווכים על ידי זיקתם microtubules ציר שמקורם שני centrosomes המנוגד. בנוסף להבטיח הפצת כרומוזום נאמנת, את הכיוון של ציר mitotic מכתיב גם את חלוקת תא המטוס 1. אורינטציה מתואמת של חלוקת תא חיונית בשלבים רבים של פיתוח עבור הומאוסטזיס רקמות 2. באופן ספציפי, מיקום ציר mitotic מוסדר יכול לגרום החלוקה הסימטרית של תוכן סלולארי או אפילו לייצר תאי בת בגדלים שונים 2. הרכבת וכיוון ציר mitotic מתחילים ב prophase והוא בניצוחו גומלין מורכב בין פעולה וקוממו כוח-גנרטורים 3,4. הכוחות שנוצרו מורכבים בכוחות משיכה ודחיפה oth. כוחות אלה נובעים הם מאנשי קשר ציר עם קליפת התא, כמו גם מתוך הכישור, והוא יכול להיוצר על ידי דינמיקת microtubule כמו גם על ידי מנועים מולקולריים-linkers צלב (איור 1).
כוחות דוחפים יכול להיווצר כאשר microtubules לגדול נגד מבנים קשיחים כגון קליפת התא. בהתאם הכח להתנגד הכולל שנוצר במערכת, זה יכול לגרום מחדש של ציר mitotic (כוחות נמוכים) או לעורר קריסת microtubule או אסון (כוחות גבוהים) 5-8. כמות הכח שניתן שנוצרה על ידי דחיפה תלויה באורך microtubule, כיוון שאורך הוא הקובע חזק של microtubule-קריסת 9. בנוסף, microtubules שמקורן centrosome אחד יכול לדחוף כנגד centrosome אחרים, מנגנון אשר הוצע לנהוג הפרדה centrosome ב 3,10 prophase מוקדם.
במודעהdition לדחיקת הכוחות שנוצרו על ידי microtubules גדל, microtubule מסתיים פנייה קליפת התא יכול גם לתווך משיכת כוחות 11. מחקרי ממעבדות מרובות הראו כי הפעילות המבוקרת של גנרטורים כוח קליפת מוח נדרשה עבור המיצוב הסימטרי של צירי mitotic in vivo 1. Essential לכוחות המשייכים אלה הוא dynein ציטופלסמית-מקומי הקורטקס (להלן המכונה "dynein '), חלבון מנוע microtubule מינוס סוף מכוון 8,12,13. לדוגמא, ב ניצני שמרים, אינטראקציות לרוחב של dynein קליפת המוח עם תוצאת סריג microtubule ב microtubule מנוע תלוי הזזה לאורך הקורטקס 14. עם זאת, כוחות משיכה קליפת המוח יכול להיווצר גם על ידי היכולת של dynein ליצור התקשרויות-על קץ depolymerizing microtubules 8. האנרגיה שנוצרה על ידי התכווצות microtubule עלולה להוביל כוחות כי הם בדרך כלל בסדר גודל גבוה (~ 50 PN (אסמכתא 15 </sעד>)) מ הכוחות שנוצרו על ידי חלבוני מנוע יחידים (~ 7-8 pN (נ"צ. 16)). מצורף-על סוף dynein קליפת המוח כדי microtubules depolymerizing מקדמת מיצוב ציר בשמרים ניצני 17 ו- C. elegans 13. בין אם הן כוחות משיכה קליפת המוח מונע depolymerization הזזה microtubule תלויי המנוע יכול לשתף פעולה או שייכות לקבוצה אחת בלבד in vivo הוא ידוע כיום.
בנוסף לכוחות דוחפים microtubule וכוחות משייכים קליפת מוח בתיווך dynein, מיצוב centrosome נשלט מתוך ציר mitotic ידי חלבונים רבים אחרים. מנועי Kinesin-5, למשל, קיימים כפי tetramers שיכול קשר צולב microtubules interpolar antiparallel, וכתוצאה מכך ההדורה של כוחות זזים כלפי חוץ 18-20. בני משפחת מנוע kinesin-5 נדרשים להפרדת centrosome והרכבה ציר דו קוטבית בכל אאוקריוטים למד, למעט ג elegans (הנסקרת תוך התייחסות 21).
יתר על כן,-linkers צלב diffusible משפחת Ase1 / PRC1 ידועים גם למקם חופפים אזורים microtubule של microtubules interpolar in vivo ו במבחנה 22-27. הכוחות שנוצרו על ידי הרחבת מונחת Ase1 של האזור-microtubule החופף הם גדולים מספיק כדי לאזן kinesin-14 כוחות הזזה בתיווך במבחנה 28,29. בתאים, Ase1 / PRC1 נדרש ליצירת יציבה של חופפים אזורים microtubule ב ציר midzone 25-27,30, דבר המצביע על כך הכוחות שנוצרו על ידי-linkers צלב diffusible יכול לתרום באופן משמעותי לארגון כישור. לבסוף, כוחות מן הכרומטין קינטוכור mitotic להשפיע הרכבת ציר mitotic ומיצוב דרך מסלולים שונים 3. מאז רכיבים אלה אינם חלקים מבחני הכינון מחדש המתואר כאן, הם לא יידונו בפירוט.
jove_content "> תאוריות שונות קיימים על איך הרכיבים והכוחות המולקולריים השונים המתוארים לעיל פעולת הרכבה ומיצוב ציר, אבל אנחנו עדיין רחוקים מהבנה כמותית. בנוסף ניסויים בתאים חיים, בניסויים במבחנה עם רכיבים מטוהרים לספק עצמה מסלול כדי לעזור להשיג מטרה זו. כאן אנו מציגים מדריך ויזואלי גרסה מותאמת המורחבת של השיטות שפורסמו לאחרונה (Roth et al. 31), שבו צירים בסיסיים מחדש בטיפות אמולסיה מים ב-שמן, מתחיל עם מספר מינימאלי של רכיבים. שימוש בטכניקות microfluidic, טיפות כדור נוצרים עם גדלים כי הם דומים לתאי mitotic. בתוך טיפות אלה, centrosomes ו טובולין מטוהרים ניתן לשלב כדי ללמוד דינמיקת אסטר microtubule, לכפות דור ואינטראקציות-אסטר Aster. By החדרת קליפת המוח (כגון dynein) והבין-קוטבית (כגון kinesin-5 / Ase1) כוח-גנרטורים, אנחנולשקם מבני ציר דמוי ויותר מורכבים שמתחילים להידמות מצב vivo.Protocol
Representative Results
Discussion
השיטות שתוארו כאן מאמצים אחרונים נוכחיים כדי לשקם צירי mitotic בסיסיים בטיפות אמולסיה מים ב-שמן. לימוד ציר הרכבה בגבולות גיאומטריים מספק יתרונות רבים. מנגנוני משוב חשובים קיימים בין microtubules של ציר mitotic והאילוצים הגיאומטריים שבו הם התאספו. Microtubules יכול ליצור דחף כוחות כאשר הם גדלים לתוך גבולות גיאומטריים, אשר עלול לגרום תזוזת ציר mitotic. בנוסף, גדל לתוך מכשול פיזי יכול לגרום אסונות microtubule. כמו כן, הרכבת ציר בתוך גיאומטריה מוקפת יכולה להוביל דלדול הדרגתי של רכיבים בודדים, כגון טובולין, אשר בתורו משפיע ישירות על צמיחת microtubule שיעור 36. כל אלה הם הגורמים החיוניים של הרכבת ציר, אשר ניתן ללמוד באמצעות המבחנים המתוארים כאן.
מבחני המתוארים רגישים מאוד differe ריכוז קטןnces של רכיבי רביב. זהו המקרה עבור טובולין, שבו הבדלי ריכוז קטין יכולים לגרום גם איטית מדי או מהירה מדי צמיחת microtubule. במקרה זה, שיעורי צמיחת microtubule לעתים קרובות יכולים עדיין להיות מתוקנים על ידי התאמת הטמפרטורה במהלך הדקות הראשונות ~ 30 של הניסוי. הרכבה ציר mitotic ומיצוב הוא גם מאוד רגיש לשינויים בריכוז (קליפת המוח) גנרטורים כוח. זה עשוי להיות תלוי ריכוז, טוהר פעילות הרכיבים המטוהרים צריך להיות טיטרציה בזהירות לכל חלבון מטוהרים חדש.
בנוסף, פשרות מסוימות צריכות להיעשות במסגרות הדמיה, בהתאם לאופי של assay. בתחילה, רמות גבוהות של הדימרים טובולין פלורסנט מסיסים להקשות microtubules פרט תמונה. כפי microtubules מתארך טובולין מסיס ייגמר לאט, יחס אות לרעש הופך בהדרגה גבוהה ומאפשר ההדמיה של individumicrotubules al. בניגוד setups עם מערכות פתוחות, כליאת הגיאומטריות מונעת חליפין של מולקולות ניאון ורכיבי מערכת נבלות חמצן בתוך מאגר בתפזורת, וכתוצאה מכך ההלבנה משמעותית. במיוחד לניטור ציר הרכבה ומיצוב לאורך זמן, היא נדרשת תמונה עם לעוצמות אור נמוכות, אפילו בנוכחות של מערכת נבלות חמצן חזקה.
שיטות אלה מאפשרות הכינון מחדש מלמטה למעלה מבני ציר דמויים פשוטים במבחנה. בנוסף למרכיבים הציגו כאן, גורמים רבים אחרים תוארו להשפיע היווצרות ציר דו קוטבית, מיצוב, נטייה, עיצוב, וכו '3. מערכת זו ניתן להרחיב עוד יותר כדי לחקור את השפעות הפרט בשילוב של גנרטורים כוח נוספים. תורמים חשובים היווצרות ציר שנעדרים כיום ממערכת זו הם הכרומוזומים mitotic. הכרומטין mitotic הוכחהיווצרות ציר ישיר על ידי (1) chromokinesins כי ניתן להפיק מה שמכונה 'כוחות-פליטה קוטב' 3, (2) היווצרות של שיפוע RanGTP ידי RCC1 RanGEF הנכנס הכרומטין 38, (3) קינטוכור כי יכול לקיים אינטראקציה עם (depolymerizing microtubules) 39 ו (4) הכרומטין עצמו, שיכול לתפקד כמו קפיץ מכני-בין microtubules מנוגדים 40.
לבסוף, המערכת המתוארת כיום מספקת שליטה של זמן ומרחב מוגבלת על הפעילות ולוקליזציה של כוח-גנרטורים הציג. בתאים, גורמי הרכבת ציר רבים למקם את התאים ספציפיים או פעילים תוך זמן-חלון מוגבל. דוגמה בולטת היא הפעילות של dynein, אשר מועשר במיוחד בצד האחורי של ג elegans העובר בשלב אחד התא לקדם מיצוב ציר אסימטרי חלוקת התא. במערכת זו, אנו בוחנים בימים אלה אפשרות מחקה t כזהבאמצעות שיטות של פעילות emporal אסימטרי שהושאל טכניקות אופטו-גנטית. בנוסף, כפי שקורה עבור ג elegans לעובר ותאים עם דופן תא נוקשה, תאים רבים אינם לעגל כלפי מעלה ב מיטוזה. צורת הכליאה הגיאומטרית תהיה השפעה מהותית על הכוחות הפועלים על הציר 41. לכן יהיה חשוב כדי לשקם ציר הרכבה ומיצוב טיפות הלא כדורית כמו גם, באופן פוטנציאלי באמצעות מערכות microfluidic מורכבים יותר, המאפשרים בעיצוב ואחסון של אמולסיה טיפות 42,43. לבסוף, ברקמות, תאים תאים ותא-המצע איתות מצורף לספק רמזים חיצוניים כי ניתן לתרגם אוריינטציה ציר מכוונת, כפי שנצפה לעתים קרובות בתאי אפיתל ותאי גזע. כל היבטים מצומצמים אלה לא נלקחו בחשבון במחקר הנוכחי זה עשוי לספק האתגרים בעתיד לבנות כלפי יותר in vivo-כמו reconstitutions של שנאספו בנוסף ציר mitoticly ומיצוב.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We like to thank the members of the Dogterom lab for valuable discussions. We acknowledge Stefan Diez and Marcel Janson for reagents, and Samara Reck-Peterson for help with the purification of dynein. This work was supported by funding from the European Research Council (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).
Materials
| 1. Preparation of microfluidic chips | |||
| Photomask (Photomask on film substrate) | Selba S.A. Switzerland | ||
| SU-8 3025 | MicroChem | ||
| Silicon wafer (4 inch silicon wafer p/Boron <1-0-0> 10-20 Ω-cm, 500-550μm, SSP, w/2 flats) | WRS Materials | 4P0SSP-005 | |
| Spin coater | Polos | SPIN150I | |
| PDMS pre-polymer RVT615 A+B | Lubribond | 9481 | |
| Corona treater | Electro-technic products | BD-20ACV | |
| 2. Microfluidic setup | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine) | Avanti Polar Lipids | 840035 | |
| Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(biotinyl)) | Avanti Polar Lipids | 870285 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | |
| Glass pipets | |||
| Glass tubes | |||
| Vacuum pump | Laboport | KNF | |
| Vacuum chamber | Kartell | Polypropylene Vacuum Desiccator | |
| Mineral oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Surfactant (Span80) | Sigma-Aldrich | 85548 | |
| Sonicator | Branson | M2800H | |
| Coverslips | 24x60mm, thickness 1.5 | ||
| Glass-slides | 26x76mm | ||
| Puncher | Harris Uni-Core | 135840/135841/135843 | |
| Laboratory sealing film | Parafilm | ||
| Valap (Vaseline, lanolin, paraffin wax melted at equal concentrations) | Home made | ||
| Brightfield Microscope | Leica | PMIRB | Any inverted brightfield would suffice |
| Pressure controler | Fluigent | MFCS-FLEX-4C-1000 | |
| PEEK Tubing | Cluzeau Info. Labo, France | ||
| Microfluidics vials (Tubes Micrew 0.5 ml and 1 ml) | VWR, The Netherlands | ||
| 3. Reconstituting spindle formation and positioning | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dextran-647nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Anionic, Fixable) | Life Technologies | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | ||
| BSA – Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Glucose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glucose-oxidase (Glucose oxidase from Aspergillus niger) | Sigma-Aldrich | G6125 | |
| DTT (DL-dithioltheitol) | Sigma-Aldrich | 646563 | |
| Catalase (Catalase form bovine liver) | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Tubulin (Tubulin from bovine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| Tubulin-488/561 (HiLyte-488/Rhodamine-labeled tubulin from porcine brain) | Cytoskeleton Inc. | ||
| GTP (Guanosine-'5-triphosphate, sodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| κ-casein (κ-casein from bovine serum milk) | Sigma-Aldrich | C0406 | |
| Airfuge (Air-driven ultracentrifuge) | Beckman-Coulter | CLS | |
| 4. Introducing spindle-assembly factors | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neutravidin | Sigma-Aldrich | A2666 | |
| ATP (Adenosine-'5-triphosphate, disodium salt hydrate) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| PEP (Phospho(enol)pyruvic acid monosodium salt hydrate ≥ 97% (enzymatic)) | Sigma-Aldrich | P0564 | |
| PK/LDH -(Pyruvate kinase/lactic dehydrogenase enzymes from rabbit muscle) | Sigma-Aldrich | P0294 |
References
- Kotak, S., Gonczy, P. Mechanisms of spindle positioning: cortical force generators in the limelight. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 741-748 (2013).
- Williams, S. E., Fuchs, E. Oriented divisions, fate decisions. Curr Opin Cell Biol. 25 (6), 749-758 (2013).
- Tanenbaum, M. E., Medema, R. H. Mechanisms of centrosome separation and bipolar spindle assembly. Dev Cell. 19, 797-806 (2010).
- Civelekoglu-Scholey, G., Scholey, J. M. Mitotic force generators and chromosome segregation. Cell Mol Life Sci. 67 (13), 2231-2250 (2010).
- Faivre-Moskalenko, C., Dogterom, M. Dynamics of microtubule asters in microfabricated chambers: the role of catastrophes. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (26), 16788-16793 (2002).
- Janson, M. E., de Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. J Cell Biol. 161 (6), 1029-1034 (2003).
- Laan, L., Husson, J., Munteanu, E. L., Kerssemakers, J. W., Dogterom, M. Force-generation and dynamic instability of microtubule bundles. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (26), 8920-8925 (2008).
- Laan, L., et al. Cortical dynein controls microtubule dynamics to generate pulling forces that position microtubule asters. Cell. 148 (3), 502-514 (2012).
- Dogterom, M., Yurke, B. Measurement of the force-velocity relation for growing microtubules. Science. 278 (5339), 856-860 (1997).
- Cytrynbaum, E. N., Scholey, J. M., Mogilner, A. A force balance model of early spindle pole separation in Drosophila embryos. Biophys J. 84 (2 Pt 1), 757-769 (2003).
- Kozlowski, C., Srayko, M., Nedelec, F. Cortical microtubule contacts position the spindle in C. elegans embryos. Cell. 129 (3), 499-510 (2007).
- Carminati, J. L., Stearns, T. Microtubules orient the mitotic spindle in yeast through dynein-dependent interactions with the cell cortex. J Cell Biol. 138 (3), 629-641 (1997).
- Nguyen-Ngoc, T., Afshar, K., Gonczy, P. Coupling of cortical dynein and G alpha proteins mediates spindle positioning in Caenorhabditis elegans. Nat Cell Biol. 9 (11), 1294-1302 (2007).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Grishchuk, E. L., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I., McIntosh, J. R. Force production by disassembling microtubules. Nature. 438 (7066), 384-388 (2005).
- Toba, S., Watanabe, T. M., Yamaguchi-Okimoto, L., Toyoshima, Y. Y., Higuchi, H. Overlapping hand-over-hand mechanism of single molecular motility of cytoplasmic dynein. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (15), 5741-5745 (2006).
- Ten Hoopen, R., et al. Mechanism for astral microtubule capture by cortical Bud6p priming spindle polarity in S. cerevisiae. Curr Biol. 22 (12), 1075-1083 (2012).
- Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
- van den Wildenberg, S. M., et al. The homotetrameric kinesin-5 KLP61F preferentially crosslinks microtubules into antiparallel orientations. Curr Biol. 18 (23), 1860-1864 (2008).
- Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. J Cell Biol. 182 (3), 421-428 (2008).
- Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 255-259 (2010).
- Schuyler, S. C., Liu, J. Y., Pellman, D. The molecular function of Ase1p: evidence for a MAP-dependent midzone-specific spindle matrix. Microtubule-associated proteins. J Cell Biol. 160 (4), 517-528 (2003).
- Loiodice, I., et al. Ase1p organizes antiparallel microtubule arrays during interphase and mitosis in fission yeast. Mol Biol Cell. 16 (4), 1756-1768 (2005).
- Kapitein, L. C., et al. Microtubule-driven multimerization recruits ase1p onto overlapping microtubules. Curr Biol. 18 (21), 1713-1717 (2008).
- Janson, M. E., et al. Crosslinkers and motors organize dynamic microtubules to form stable bipolar arrays in fission yeast. Cell. 128 (2), 357-368 (2007).
- Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
- Mollinari, C., et al. PRC1 is a microtubule binding and bundling protein essential to maintain the mitotic spindle midzone. J Cell Biol. 157 (7), 1175-1186 (2002).
- Braun, M., et al. Adaptive braking by Ase1 prevents overlapping microtubules from sliding completely apart. Nat Cell Biol. 13 (10), 1259-1264 (2011).
- Lansky, Z., et al. Diffusible crosslinkers generate directed forces in microtubule networks. Cell. 160 (6), 1159-1168 (2015).
- Yamashita, A., Sato, M., Fujita, A., Yamamoto, M., Toda, T. The roles of fission yeast ase1 in mitotic cell division, meiotic nuclear oscillation, and cytokinesis checkpoint signaling. Mol Biol Cell. 16 (3), 1378-1395 (2005).
- Roth, S., Laan, L., Dogterom, M. Reconstitution of cortical Dynein function. Methods Enzymol. 540, 205-230 (2014).
- Moudjou, M., Bornens, M., Celis, J. E. Method of centrosome isolation from cultured animal cells. Cell Biology: A laboratory handbook. 2, 111-119 (1998).
- Reck-Peterson, S. L., et al. Single-molecule analysis of dynein processivity and stepping behavior. Cell. 126 (2), 335-348 (2006).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Lancaster, O. M., et al. Mitotic rounding alters cell geometry to ensure efficient bipolar spindle formation. Dev Cell. 25 (3), 270-283 (2013).
- Good, M. C., Vahey, M. D., Skandarajah, A., Fletcher, D. A., Heald, R. Cytoplasmic volume modulates spindle size during embryogenesis. Science. 342 (6160), 856-860 (2013).
- Green, N. M. Avidin and streptavidin. Methods Enzymol. 184, 51-67 (1990).
- Moore, W., Zhang, C., Clarke, P. R. Targeting of RCC1 to chromosomes is required for proper mitotic spindle assembly in human cells. Curr Biol. 12 (16), 1442-1447 (2002).
- Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
- Lawrimore, J., et al. DNA loops generate intracentromere tension in mitosis. J Cell Biol. 210 (4), 553-564 (2015).
- Minc, N., Burgess, D., Chang, F. Influence of cell geometry on division-plane positioning. Cell. 144 (3), 414-426 (2011).
- Taberner, N., et al. In vitro systems for the study of microtubule-based cell polarity in fission yeast. Methods Cell Biol. 128, 1-22 (2015).
- Boukellal, H., Selimovic, S., Jia, Y., Cristobal, G., Fraden, S. Simple robust storage of drops and fluids in a microfluidic device. Lab Chip. 9 (2), 331-338 (2009).
