基本的有丝分裂纺锤体的重组在球形乳液液滴

1.微流控芯片的制备注：对于主轴组件的自下而上的研究中，使用球形水包油乳液液滴。这些是由磷脂和表面活性剂的单层从周围油相分离的水的微滴。这些乳液液滴的微流体聚二甲基硅氧烷（PDMS）芯片内产生的。在通道的几何形状和流速的变化可以用于调节液滴尺寸。在这里所描述的微流体设计，与一个直径约为15微米的生成液滴以模仿哺乳动物有丝分裂细胞的几何约束。 光掩模设计和模具制造设计包含三个入口通道31光罩。入口通道1连接到水相，其中包含液滴的内容（见第3节“的重构基本微管紫苑”）。入口通道2连接到油相（参见第2.1节“脂/油PHASE准备“）。使用进口通道3之前的观察（可选）（ 图2A-B稀释乳化液滴额外的脂质/油相）。 注：所有入口通道后跟一个防尘过滤器（2微米频道的迷宫），以捕集粉尘，PDMS粒子和（蛋白质）聚集体，并防止它们阻断微流体通道（ 图2d）。通道75微米宽，并在12.5微米宽结，其中乳液的液滴会形成（ 图2c）的脂质/油相和水相满足。 订购并得到薄膜基材上印刷的光掩膜，具有负极性（光掩模将暗带透明设计结构）。 模具制造制造通过旋涂SU-8 3025光致抗蚀剂模具上使用旋涂机（以500rpm，10秒，随后1800转，45秒）在一个干净的房间环境中的4英寸硅晶片。 暴露SU-8涂层通过光掩模的硅晶片。根据制造商的说明来创建40微米厚的〜频道发展晶片。 制作微流控芯片在使用塑料抹刀舟状容器混合10份的PDMS预聚物与1份固化剂（总〜40克）。含在真空室内约30分钟船状容器的地方的PDMS。以除去气泡。包裹铝箔周围的模具，以形成具有约1cm的直立边缘的杯。 倒入PDMS（〜总体积的75％）到模具，留下在真空室内为另一个〜30分钟。 （以除去气泡），并在烘箱中在100℃下固化1小时。 旋涂剩下的PDMS到玻片上（在200rpm 5秒接着30秒在4,000rpm下），随后固化在100℃下1小时。使用压缩空气/ N 2 -flow，预清洗是没有必要的载玻片上的灰尘。 注：涂覆的PDMS载玻片可以为麦克风被用于既rofluidic芯片和流动池的生产（参见2.2）。 轻轻剥去PDMS关闭使用刀片的模具和冲头的孔（0.5毫米入口，0.75毫米出口）.Corona-处理微流体芯片和使用实验室电晕表面处理机为几秒钟的PDMS涂覆载玻片。 放置在微流体芯片上的载玻片（通道朝下）和烤芯片O / N在100℃下（ 图3a）。存储微流控芯片用于在无尘环境几个月。 2.微流控设置注：水包油使用的是微流体设置和上述的微流体芯片产生的乳液液滴。脂质/油相的组合物可以根据实验要求而变化。油增溶脂质将形成在水 – 油界面朝向里面的水的极性头部基团的单层。为了靶蛋白（ 如动力蛋白），以液滴的边界，（生物素基PE）可以加入少量的生物素-磷脂的脂质。这使得生物素化动力蛋白的招募（参见4.1节“动力蛋白靶向滴皮层”），通过链亲和素介导的多聚化。液滴通过加入表面活性剂的稳定化，并存储在PDMS涂覆流动池。 脂质/油相制备方法混合氯仿溶解1,2- dioleoyl- -sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（DOPS）和生物素基PE脂质在4：在使用玻璃吸管的玻璃管1的摩尔比（广泛前冲洗，用氯仿吸管使用）。制备总共〜250微克脂类，导致〜0.5毫克/毫升的脂质浓度。 仔细擦干用N 2 -flow并随后在真空室内〜1小时的脂质混合物。溶解在矿物油和2.5％表面活性剂的干燥脂质0.5毫克/毫升（使〜500微升）。 将在脂质/油样超声浴并超声处理30分钟。在40千赫至完全溶解脂质。 流动池准备旋涂的PDMS（也见1.3节）装到盖玻璃（以200rpm 5秒接着30秒在4,000rpm下）和载玻片（在100rpm 5秒接着30秒1500转），以沉积均匀层PDMS的。 注：为了获得最佳的成像质量，确保使用盖玻片厚度的显微镜物镜相匹配。在这种情况下：1.5（〜0.17毫米）。 固化涂覆的PDMS盖玻璃和玻璃载玻片在100℃的烘箱中1小时。由紧密间隔使流动细胞（〜2mm）的实验室密封膜的薄片（〜3毫米宽）上涂布的PDMS – 玻璃 – 幻灯片。当存储在无尘的环境中，还没有被使用的信道可以在其它时间使用。 通过熔化实验室密封膜〜1分钟覆盖流动细胞与PDMS涂覆的盖玻片和密封。在100℃时，按轻轻（ 图3c）。与Valap（ 图3c）关闭实验室密封膜-玻璃-边界。商店流动细胞用于在无尘环境几个月。 PDMS杯准备对于长期成像，使PDMS杯，通过在PDMS的切片冲切4毫米直径的孔（〜3mm厚） 电晕处理的PDMS片和PDMS涂覆玻璃盖，并将其放置在彼此的顶部。烤杯PDMS O / N（100°C）（ 图5a）。 乳化液滴形成监视器上倒光明场显微镜液滴形成。压力控制器连接到使用的PEEK管中的微流体芯片（直径：510微米（外侧）与125微米（内侧））（ 图3a）。填充微流控芯片完全脂质/油相从进口2。 推出基于MRB80水相（见第3节“基本的重构微管紫苑4）从入口1控制液滴尺寸通过改变脂质/油相和水相的压力来创建的液滴〜15微米的直径（ 图3b）。 注意：使用该设置中，使用〜800毫巴的脂质/油相和〜200毫巴的水相以产生所需尺寸的液滴。 获得所需的微滴大小和所需的量后（每个样品10微升），收集来自出口通道和负载液滴进入流动池（完全填充流动池）。 关闭小心使用Valap流动池的端部（不完全封闭流细胞可导致液滴广泛的运动，使得难以图象它们）。另外，防止气泡这导致液滴运动的形成。 用异丙醇广泛冲洗的PEEK管使用前和使用后防止样品的交叉污染和堵塞。 3.重建基本翠菊微管注：液滴内容可以根据实验要求而变化。所有缓冲MRB80基于（80毫摩尔PIPES，1mM的EGTA，4mM的MgCl 2的（pH为6.8）），以及所有的样品都在冰上制备。一般情况下，微滴总是包含中心体，微管聚合，除氧剂系统和阻断剂所需的组件（参见3.1节）。微管力发电机和所需的辅助因子和靶向因子如果需要，可以包括（见章节4.1和4.2）。 在乳滴翠菊形成常规设置（ 图3d） 在-80℃的准备葡萄糖氧化酶（200毫米DTT和10毫克/毫升的过氧化氢酶20毫克/毫升的葡萄糖氧化酶）混合事先并存储在小分装。 制备含有κ酪蛋白，牛血清白蛋白（BSA）一个“阻塞混合”，吐温20和荧光葡聚糖（作为中立标记）（ 见表1）提前，并存储在小aliquoTS在-80℃。防止反复冻融。确保所有组件都新鲜烹制。 净化在小分装在-150℃下Moudjou 等 32店作为描述的人类淋巴细胞KE37细胞中心体。 在室温下解冻中心体，并在37°C孵育〜20分钟。在使用前要确保正确的微管核。 注：此实验过程中促进微管核。 在平均时间，准备“测定混合物”，含有微管蛋白（荧光和“暗”），鸟苷三磷酸（GTP），氧清除剂系统（葡萄糖，葡萄糖氧化酶，过氧化氢酶和1,4-二硫苏糖醇（DTT）），分子力发电机（ 例如微管电动机/交联剂），三磷酸腺苷（ATP）和ATP再生体系（磷酸烯醇丙酮酸（PEP），丙酮酸激酶（PK）和乳酸脱氢酶（LDH））在冰上（ 见表2）。 预冷却冰上airfuge转子。降速样品中的冷却airfuge转子（30磅为3分钟）。新增预热中心体（优化中心体的量的目标为含有1-2中心体的液滴）。 采用组合结构，以便使用2.3节所述的方法乳化液滴。 零件 股权集中度 最终浓度（在测定） 卷 评论 葡聚糖647nm 75μM 3.75林M（0.6微米） 5微升 κ酪蛋白 20毫克/毫升 12.5毫克/毫升（2毫克/毫升） 62.5微升吐温-20 5％ 0.375％（0.06％） </TD> 7.5微升 BSA 200毫克/毫升 12毫克/毫升（1.9毫克/毫升） 6微升 MRB80 19微升 100微升决赛储存在2微升等份 表 1：“阻断混合'的成分阻断混合成分，主轴状结构的水包油乳液液滴的重建所需。为了描述，见正文第3节“基本的重构微管紫苑”。有关材料的详细信息，请参阅“ 材料表 。 零件 股票concentratioñ 终浓度 卷 评论 混合阻塞 1.6微升微管蛋白 500μM 30μM 0.6微升微管蛋白五百六十一分之四百八十八 50μM 3μM 0.6微升 GTP 50毫米 5毫米 1.0微升动力蛋白，TMR 178纳米 30纳米 1.7微升链霉 5毫克/毫升 200纳米 0.4微升对于皮质动力蛋白只驱动蛋白5 1.6毫米 80纳米 0.5微升 ATP 25毫米 1毫米 0.4微升对于仅电机 PEP 0.5M的 25.6毫米 0.5微升对于仅电机 PK / LDH 800 U / 1100ū 23 U / 32ū 0.3微升对于仅电机 ASE1-GFP 400纳米 80纳米 2.0微升葡萄糖 2.5M的 50毫米 0.3微升最后一步葡萄糖氧化酶 50X 1.0倍 0.3微升最后一步 MRB80 X 9微升决赛 表 2：'测定混合物'的成分。 </strong>测定混合物，主轴状结构的水包油乳液液滴的重建所需的成分。为了描述，见正文第3节“基本的重构微管紫苑”。有关材料的详细信息，请参阅材料表 。 4.引入主轴大会因素注意：在这里所描述的测定中，绿色荧光蛋白（GFP）-tagged S的截短版本用酵母动力蛋白是人为地氨基末端谷胱甘肽S-转移酶（GST）的手段二聚-tag 33。该蛋白质是通过包含该蛋白的两个拷贝的IgG结合结构域的亲和标签进行纯化。此处所使用的变体与四甲基罗丹明（TMR）标记物标记到羧基末端和N-末端的SNAP-标记用于生物素化的纯化的蛋白质。对于结构的详细信息，请参见Roth 等人31。净化详情，请参阅录制K-Peterson 等。33。 GFP-生物素动力蛋白-TMR可以通过链接动力蛋白对生物素基PE脂质（ 图3e）生物素-链霉抗复合物的形成来定位到液滴皮质。 动力蛋白靶向液滴的Cortex 包括绿色荧光蛋白-生物素-动力蛋白-TMR到“测定混合物'（ 见表2）为30nM的终液滴浓度。包括链入“测定混合物'（ 见表2），在200纳米的最终液滴浓度。 注：动力蛋白依赖于ATP水解为微管逐步运动。因此，包括ATP和一个ATP再生系统（含有PEP和PK / LDH）到“测定混合物'（ 见表2）。 注：重组全长S.酵母 GFP-Cut7（驱动蛋白-5）好心的迭实验室（中心分子生物工程，德累斯顿工业大学，德国德累斯顿）提供的，见。重组全-Length组氨酸标记S.裂殖酵母的GFP-ASE1惠赠从松斯实验室（瓦格宁根大学，瓦格宁根，荷兰）提供，并添加到“测定混合”在浓度为80纳米。 5.成像注：在实验过程中，微管生长可通过改变温度进行控制。在选择的摄像条件下，权衡有高质量的成像和监测长时间时段主轴组件的能力之间进行。比较不同条件下的主轴形成的动力学，具有不同含量的液滴可以混合，并在同一流道成像。 基本图像设置图像中的温度控制的环境中使用一个封闭的腔室。可视化后〜30分钟，在26℃个别微管。而成像，通过提高温度高达约30℃促进微管生长。 注：在S下面ettings特定于我们的显微镜装置，可与不同的系统和不同的操作软件而异。此处所述的所有试验都成像与旋转盘共聚焦头倒立机动系统上，并使用图像处理软件，如安道尔的iQ 3.1操作。获得了100倍的油浸物镜和EMCCD相机的所有图像。 设置激励激光器488，561和641纳米至大约〜10％的强度。进入“收购”面板，点击“AOTF”选项卡和幻灯片激光强度为10％。点击“记录”保存设置。 对于z -projections，采取与1微米的间隔（约20张/液滴）堆栈。进入主“摄像头”面板中，单击“编辑Z'，并设置'Z一步”为1.0，点击“下一步”保存设置。 通过点击“相机”选项卡上的“收购”面板中设置最大线性EM增益和EM增益条滑动到300设置曝光次，以在同一个标​​签200毫秒。点击“记录”保存设置。 实时成像对于实时成像，使用软件控制使ž-projections每2分钟。 1-2小时的通过减少曝光时间来〜100毫秒的持续时间。 （如在5.1.4中描述），并增加Ž-intervals至2μm（如在5.1.3节）。设置时间序列中主要的“摄像头”面板中，单击“重复T'，并设置为2分钟。间隔为120分钟的总时间。 对于实时测定，使用PDMS杯代替常规流动池，以确保液滴尽可能不动。 2条件联合成像产生使用微流体液滴和储存在冰上将PDMS涂覆载玻片的顶部。这可以防止微管成核，直到第二组液滴已经形成。产生第二组液滴之前，冲洗的PEEK管中，用微流控芯片MRB80并完全重新填满用脂质/油相的微流体芯片。 生成具有和不以便用不同颜色的液滴区分荧光葡聚糖（或使用葡聚糖具有不同波长的荧光团）的液滴。生产第二批液滴后，轻轻吹打混合液滴和加载到一个单一的流动池/ PDMS杯。 图像分析。 通过分析斐济（开源软件可在线）34图像。 “hyperstacks' – – '栈hyperstack”现场试验，使用“图像”转换成堆栈hyperstacks。设置的z切片和时限的正确数目。 为了使Z-预测，选择“图像” – “栈” – “Z-工程”。选择“最大强度”的预测。 对于三维重建，首先要到“图像” – “属性”，并设置与像素heigth，像素深度和FR的适当的像素AME区间。点击“确定”。选择“图像” – “栈” – “三维工程”，选中“插值”复选框，然后单击“确定”。