遗传和生物化学方法<em>在体内</em>和<em>体外</em>蛋白齐聚评估：兰尼碱受体案例研究

1.酵母双杂交 酵母转化 准备下列媒体和缓冲区： 通过将20克/升胨，10克/升酵母提取物，2％w / v的葡萄糖（高压灭菌后加入）和20g / L琼脂制备酵母完整酵母提取物 – 蛋​​白胨 – 葡萄糖（YPD）培养基（对于板只） ;通过高压灭菌消毒并在实验当天用新鲜。 准备酵母最小的合成定义（SD）中混合6.7克/酵母氮基L的，​​1.6克/升降补充缺乏亮氨酸和色氨酸，2％W（缺乏亮氨酸和色氨酸，以保持两个诱饵和目标质粒选择压力） / v的葡萄糖（高压灭菌后加入）和20g / L琼脂（对于板只）;通过高压灭菌消毒并在实验当天用新鲜。 制备50％w / v的PEG（聚乙二醇）3350;通过0.2微米的过滤器，并存储在RT消毒。 准备100毫米的Tris / 10毫米EDTA（TE 10倍），调整pH值至7.5，灭菌通过0.2微米的过滤器和储存在室温。 制备的1M乙酸锂（10×醋酸锂）;将pH调节至7.5，用CH 3 COOH，通过0.2微米的过滤器，并存储在RT消毒。 划线冷冻甘油股票少量到YPD板重振Y2H株（如 Y190）。在30℃下孵育直至酵母菌落达到〜2毫米的直径（通常为3 – 5天，这取决于酵母菌株）。 接种0.5毫升YPD的（在1.5ml管）与一个单一的，大的（2 – 3毫米直径）菌落。涡大力为〜2分钟驱散任何团块。 转移细胞悬液至含有50ml YPD培养基的500ml烧瓶中。在30℃下为16孵育 – 18小时以250rpm对于酵母摇动达到静止期。 转移4 -过夜培养5毫升入200ml YPD中（在1升锥形瓶中），以在600nm（OD 600产生的光密度，测定使用0.2分光光度计） – 0.3（200毫升将足以为20变换）。 在30℃下孵育以250rpm振荡培养直至细胞在对数中期， 即 ，外径600 = 0.5 – 0.6（通常在2 – 3小时）。 收获酵母经离心（在50ml试管）在1500 xg离心在RT 5分钟。弃去上清液，在5毫升无菌H 2 O和游泳池的悬浮颗粒每一起。 重新离心机以1,500×g离心在RT 5分钟并弃上清。悬浮颗粒酵母1毫升新鲜配制，无菌1X醋酸锂/ TE的。 注：准备1小时内使用主管酵母细胞。 通过添加对单个变换200纳克质粒DNA，或0.5制备质粒样品（在1.5ml试管） – 1每种质粒DNA用于共转化的微克，以及100微克鲱鱼睾丸载体DNA（煮沸20分钟并冷却上使用冰前夕）。 注：加入的阳性对照， 例如 ，酵母。共转化PVA3（编码GAL4的DNA-BD融合与p53蛋白）和PTD1（编码与SV40大T抗原GAL4 AD融合）。 添加新鲜制备的，主管酵母悬浮液（步骤1.1.8）的100微升和600微升的1倍醋酸锂/聚乙二醇溶液（8毫升库存PEG 3350 1 ml储备的TE中，加入1ml的库存醋酸锂的），和涡旋〜30秒。孵育在30℃下进行30分钟并以200rpm振荡。 添加80微升二甲亚砜（10％体积/体积终浓度）并轻轻地倒转混合。在混合的同时在42℃水浴中15分钟热冲击，每2 – 3分钟。 冰浴细胞悬浮液2分钟并离心在14,000rpm xg离心15秒在RT恢复酵母。 在100微升TE 1X的悬浮细胞沉淀和板适当的最小SD培养基平板上选择生长（培养基缺乏亮氨酸和色氨酸，以保持两个诱饵和目标质粒选择压力）。 孵育板向上面朝下，在30°C，直到菌落〜2毫米直径（一般为4 – 5天）。板可在4℃下2 – 3周;更长的存储使甘油股票并储存在-80℃。 注意：验证诱饵和目标蛋白质在酵母中表达的免疫印迹17，并且它们不具有自主报告基因活化酵母（如在第1.3节描述的β-Gal的测定）时分别表示。 菌落电梯滤纸β-Gal的含量 准备以下缓冲区： 制备含有100mM 的 Na 2 HPO 4，Z缓冲器40毫的NaH 2 PO 4，10mM的氯化钾，1mM的MgSO 4上;将pH调节至7.4。通过高压灭菌和储存在室温下消毒。 通过将制备的X-gal缓冲5-溴-4-氯-3-吲哚基β-D-吡喃半乳糖苷在-20℃20毫克/毫升的N，N-二甲基甲酰胺和存储在黑暗中。准备Z缓存/ X-Gal的解决方案。使缓冲区通过混合的X-gal在0.33毫克/毫升和β巯基乙醇0.27％体积/体积的Z缓冲器使用前。每个采样使用2.5毫升。 加入2.5倍毫升一个干净的100毫米的钢板和地点纤维素滤纸内新鲜配制的Z缓存/ X-Gal的解决方案。 将新的滤纸上的板的表面上与待测定的酵母菌落。轻轻揉搓滤纸上钳板，并留下〜5分钟菌落附着。 注：并行处理阳性对照， 即 ，酵母共转化PVA3和PTD1。 提起滤纸和淹没它（用钳子）到液氮30秒池（液氮应小心处理;总是穿厚厚的手套和护目镜）。让我们在RT冷冻滤纸解冻〜2分钟。 放置在100毫米的钢板内的预先浸泡的滤纸顶部滤纸（菌落面朝上），并且在30℃下孵育。 定期检查（每〜30分钟）为蓝色菌落的外观。酵母Y190共转化与阳性对照质粒（PVA3 + PTD1）将变成在60分钟（未发表的观测值）为蓝色。 注：弱诱饵：靶相互作用可能需要几个小时，产生了积极的蓝色信号（避免长时间的潜伏期（> 8小时），可能会给假阳性结果）。为获得最佳效果，可以使用新鲜的共转化的菌落， 即 ，在30℃下生长4 – 5天，〜2毫米的直径。 液体培养β-Gal的含量 准备以下缓冲区： 制备含有100mM 的 Na 2 HPO 4，Z缓冲器40毫的NaH 2 PO 4，10mM的氯化钾，1mM的MgSO 4上;将pH调节至7.4，在室温下通过高压灭菌和储存消毒。 的1M 的 Na 2 CO 3;储存在室温。 准备Z缓存/β巯基乙醇。使通过添加β巯基乙醇0.27％对使用缓冲之前/V IN Z缓存;每个采样使用700微升。准备Z缓存/ ONPG解决方案。使前缓冲器通过混合ONPG（邻 – 硝基苯基β-D-吡喃半乳糖苷），在4毫克/毫升和β巯基乙醇0.27％在Z缓冲器体积/体积使用;每个采样使用160微升。 使用单菌落接种5毫升最小的SD培养基（缺乏亮氨酸和色氨酸，以保持在两个诱饵和目标质粒的选择压力），并在30℃下为16孵育 – 18小时以250rpm摇动。 注：测定五个单独的菌落共转化使用相同的诱饵和目标质粒。 传输足够的过夜培养物在10ml新鲜的SD培养基中，以产生的OD 600 = 0.2 – 0.3。在30℃下孵育以250rpm振荡培养直至细胞在对数中期（OD 600 = 0.5 – 0.6）。 转移0.5毫升酵母培养到1.5毫升管和离心机在14,000rpm xg离心2分钟，在室温。收获时，CE记录确切的OD 600LLS。悬浮颗粒在Z缓存100μl的;这将导致在5倍浓度的因子。 在液氮地方管约1分钟（液氮应小心处理;总是穿厚厚的手套和护目镜），然后在37℃水浴3分钟解冻。重复此冻融循环两次，以确保细胞被破开。 设置用100μlZ缓冲器的管坯。 添加Z缓冲器/β巯基乙醇700微升和160微升Z缓冲器/ ONPG到样品和空白管;开始在30℃培养箱定时器和地点。 定期检查黄色发展。加入400微升，1M的Na 2 CO 3的停止显色，并记录经过的时间（分钟）。酵母Y190共转化与阳性对照质粒（PVA3 + PTD1）将在60分钟内变为黄色.. 注：弱诱饵：靶相互作用可能需要几个小时，产生了积极的黄色信号，为获得最佳重sults，使用新鲜的共转化的菌落， 即 ，在30℃下进行4生长- 5天，〜2毫米的直径。 离心在14,000rpm xg离心5分钟，在室温以沉淀细胞碎片，将上清液转移到一个干净的试管中。 使用分光光度计，测量在相对 ​​于空白（值应为0.02之间- 1.0）样品的420纳米（A 420）的吸收。 计算β半乳糖苷酶单位，定义为水解ONPG的1微摩尔至邻硝基苯酚和每细胞分钟D-半乳糖的量1单位，按下列公式计算： =β半乳糖苷酶单位其中：T：孵化的时间（以分钟为单位）;比照：从步骤1.4.8， 即集中系数，CF = 5; OD 600：收集细胞时。 2.在哺乳动物细胞系蛋白质表达<st荣>哺乳动物细胞转染准备下列媒体和缓冲区： 通过用4.5克/升葡萄糖，10％体积/体积的胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺的DMEM混合制备生长培养基;通过0.2微米的过滤器和储存在4℃下灭菌。 通过混合280毫摩尔NaCl，10毫氯化钾，制备2×HEPES-缓冲盐水（2×HBS）1.5毫的 Na 2 HPO 4，12mM的葡萄糖，50毫摩尔的Hepes;将pH调节至7.05，通过0.2微米的过滤器，并储存在-20℃下灭菌。通过0.2微米的过滤器和储存在-20°C准备2.5M的氯化钙2，灭菌。 转染前一天，种子1 – 2×10 6个 HEK293细胞在100毫米培养皿中，以便60-70％汇合翌日。培养16 – 18 5％的CO 2的潮湿培养箱中于37℃小时。 在转染的当天，除去旧的介质和进料的细胞用10毫升新鲜生长培养基中。 注意：抗生素从培养基转染期间省略，因为它们可能会增加细胞死亡。 稀释24微克质粒DNA（用于共转染时，两种质粒的等摩尔比），在600微升总体积60微升的2.5M 的 CaCl 2 1.5ml试管内（用无菌去离子水2 O制成）;旋涡混匀。 注：对于转染效率最高，质粒DNA应该是最高的纯度， 即 ，有一个绝对260 / ABS 280比= 1.8〜。 添加质粒DNA /钙溶液滴到含有600微升2×HBS的同时不断大力通过涡旋混合50毫升管中。孵育20分钟，在RT至允许形成磷酸钙/质粒DNA复合物。 在20分钟温育后，涡旋简要后和明智的添加溶液滴到细胞上以覆盖100毫米的培养皿的整个表面面积。 孵育所述细胞在37℃在5％CO <sUB> 2。 〜6小时后更换生长培养基，并放回孵化器。 收获离心所述细胞24小时转染后在1000 xg离心在RT 3分钟，并弃去上清液。细胞沉淀可直到需要被储存在-80℃。 注：通常表达峰24 – 72小时后转染。 同质化的细胞 准备以下缓冲区： 通过混合150毫米氯化钠，20毫米的Tris准备联合IP同质化的缓冲区;将pH调节至7.4，并在4​​℃下储存。 制备通过混合5毫摩尔的Hepes，0.3M蔗糖交联匀浆缓冲液;将pH调节至7.4，并在4​​℃下储存（在使用前过滤器，以除去任何颗粒）。在使用前蛋白酶抑制剂补充。 加入250微升的玻璃珠（425 – 600微米）1.5 ml的管中，并用500μl匀浆缓冲液中洗涤。一个简短的离心颗粒玻璃珠脉冲（1000 XG 5秒），去除上清。重复此清洗步骤一次。 重悬细胞沉淀（从步骤2.1.8）于500μl冰冷均质化缓冲液中，将细胞悬液转移到含有珠的玻璃管。 通过细针连接于1ml注射器20代（23克，0.6×30mm的）匀浆在冰上的细胞。与管帽封闭，刺穿通过它与针，并通过玻璃珠剧烈分散的细胞悬浮液。 离心机在4℃下1500×g离心10分钟以除去细胞核和不间断的细胞，弃去沉淀。保存较后核部分上清，直接进行合作，IP或交联为宜。 3. 在体外生化方法 共免疫沉淀 准备以下缓冲区： 准备联合IP同质化缓冲区s中描述2.2.1.1挠度。通过混合的20mM Tris，150 mM氯化钠，0.5％制备的IP缓冲液（重量/体积）CHAPS，2mM的二硫苏糖醇（可选;可以包括二硫苏糖醇，以减少可能形成因空气氧化蛋白质聚集）;将pH调节至7.4，并在4​​℃下储存。 准备2％W /在合作同质化IP缓冲v CHAPS;存放于4℃。 通过混合60毫摩尔Tris，2％w / v的SDS，10％体积/体积的甘油，5mM的EDTA，0.01％w / v的溴酚蓝，2％体积/体积β巯基乙醇（可选）制备蛋白 – 样缓冲液;调节在室温pH为6.8和存储。 从汇合百毫米培养皿均质化细胞（〜如HEK293，与使用血球的计数8×10 6个细胞），如第2.2节中描述。 溶解在4℃下以恒定混合有0.5％CHAPS为≥2小时后核亚细胞级分（使用2％股票）和温育。离心机以20,000×g离心10分钟，在4℃以沉淀不溶马泰人弃沉淀。保存上清称为细胞裂解液。 注：洗涤剂和除去不溶性物质的夹杂物是绝对必要的，以减少非特异性结合。中间体洗涤剂， 例如 ，CHAPS或Triton X-100以0.2的浓度- 1％，是最常用的。 准备两个独立1.5毫升管，并添加约20微升（取决于IgG的结合能力）6毫克/毫升蛋白A或蛋白G琼脂糖（或琼脂糖）珠。用200微升IP缓冲液清洗。 注：选择取决于用于提高免疫沉淀抗体的动物物种的相应的Ig结合树脂。蛋白G相比，蛋白A免疫球蛋白结合亚型的范围更广。 离心1500 xg离心回收珠子在4℃下2分钟。重复洗具IP缓冲一次，然后在200微升IP缓冲区的悬浮颗粒。 添加免疫沉淀抗体或非免疫的IgG 1微克（5毫微克/微升）（以服务于两个单独的蛋白A / G含有管作为阴性对照）。孵育在4℃下以恒定混合≥2小时。 注：始终处理与使用非免疫IgG的相同的动物物种的免疫沉淀抗体升高阴性对照。 在4℃下以1500 xg离心离心回收珠子2分钟并小心地丢弃通过吸液上清。 转移200μl的细胞裂解物（来自步骤3.1.3）的成每两个管与抗体和蛋白A / G珠粒。孵育≥2小时，在4℃下持续混合，以允许抗原 – 抗体结合。 恢复珠，并用200微升IP缓冲洗净;在混合孵育10分钟，在4℃。回收珠子和洗两次以上（避免多次洗涤这将减少特定和非特异性两者结合）。小心丢弃吹打上清。 添加30μl的蛋白加载缓冲液以洗脱immunoprecipitated蛋白质。离心机在4℃下1500×g离心2分钟，弃去珠子和保存含有洗脱共同的IP样品上清液。 来验证成功的X蛋白沉淀，加载到用特异于蛋白质X的抗体进行免疫印迹17来分析在SDS-PAGE凝胶的共IP样品少量（1/10，3微升）中包括的等分试样细胞裂解液验证您的样品中X蛋白的表达。 为了测试共沉淀的蛋白Y的存在，加载在一个单独的SDS-PAGE凝胶的共IP样品的其余部分（9/10 个 ，27微升）以通过与特定的蛋白质Y.抗体进行免疫印迹17进行分析包括细胞裂解物，以验证您的样品中蛋白质表达Ÿ一等分。 化学交联 准备以下缓冲区： 如在节2.2.1.1中所述的交联匀浆缓冲液。 准备5倍p通过混合300毫摩尔Tris，10％w / v的SDS，50％体积/体积的甘油，25毫摩尔EDTA，0.05％w / v的溴酚蓝，10％体积/体积β巯基乙醇（可选）rotein加载缓冲器;调节在室温pH为6.8和存储;在温暖使用前50℃。 从汇合百毫米培养皿均质化细胞（〜如HEK293，与使用血球的计数8×10 6个细胞），如第2.2节中描述。 注意：蔗糖（在0.3M）用于创建一个等渗缓冲。盐， 例如 ，120 – 150毫摩尔NaCl或KCl可代替使用，这取决于所感兴趣的寡聚蛋白复合物。 离心后核子亚细胞级分以20,000 xg离心10分钟，在4℃以沉淀蛋白质的聚集体，并保​​存上清液。以每20微升（通常是蛋白质的〜20微克）八等分成独立0.5毫升管。 添加0.0025％体积/体积戊二醛所有样品并启动定时器。让每八个样品与glutarald反应在RT ehyde为：0，2，5，10，15，20，30，60分钟。 注：戊二醛具有与游离胺反应两个醛基。避免使用pH缓冲剂或其它物质与伯氨基，因为它们将猝灭戊二醛反应。 停止戊二醛反应在含有2％体积/体积的肼在指定的时间，并添加5×蛋白加样缓冲液的5微升，使蛋白质变性。 继续进行SDS-PAGE和免疫印迹17。