グラフト反応性免疫を阻害する調節性マクロファージの機能的特徴付け

このプロトコルは、心臓同種移植片から単離された組織浸潤マクロファージの機能を、T細胞応答を調節するそれらの能力に従って研究するためのインビトロ技術を記載する。文献に広く記載されているように、フローサイトメトリーと組み合わせた蛍光細胞追跡色素は、インビトロおよびインビボでの特定の細胞型の抑制機能を研究する強力なツールである。我々のプロトコルは、インビトロでリンパ球増殖をモニターするためのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）法に従う。

CFSE標識細胞が分裂すると、その子孫はカルボキシフルオレセイン標識分子の半分の数を獲得する⁶ 。フローサイトメトリーによる細胞蛍光の対応する減少を用いて、T細胞免疫応答を調節するための抑制性マクロファージの能力をモニターして、細胞分裂を評価することができる。 CFSEはフルオレセインベースの色素であるため、それはbr多色フローサイトメトリーに適用できるようにする。過剰なスペクトルの重複および抗体陽性細胞、特にCFSE7のような可視タンパク質色素を認識できないことを避けるために、表現型決定のための蛍光色素の適切な選択もまた重要である。

放射性標識チミジン（TdR） ⁸を使用するチミジン取り込みアッセイのような、細胞増殖を測定する別の技術よりも蛍光色素を用いることの多くの利点がある。このアッセイは、有糸分裂細胞分裂中に染色体DNAの新しい鎖に組み込まれるトリチウム化チミジン（ ³ H-TdR）を利用する。細胞分裂の程度を決定するために、細胞から回収されたDNA中の放射能を測定するために、シンチレーションベータカウンターが使用されるので、このアッセイに関連する安全性の懸念は放射性同位体の使用である。方法論的には、トリチウム化チミジン尻細胞の数が少なく、染色後に分析が遅れるなど、重要な臨床検査室の制約条件を満たすほど柔軟ではありません。これとは対照的に、CFSE染色は、細胞増殖を防止し、CD69、HLA-DRおよびCD25などの重要な活性化マーカーを妨害することが示されている。したがって、それぞれの方法論の利点と限界を理解することは、特に、異なる細胞タイプを追跡するために複数の色素が使用される多色検査では、正確で再現性のある結果を得るために重要です。