인간의 태반과 탈락 오르간 문화는 산모 - 태아 인터페이스에서 감염을 연구하는
Summary
기본 인간의 태반 (융모) 및 탈락 기관 배양을 설정하는 간단한 방법을 설명한다. 융모와 탈락 기관 배양은 인간의 모체 – 태아 인터페이스에서 발병 기전을 연구하기위한 귀중한 도구입니다. 통성 세포 내 세균 리스테리아 균에 감염이 증명된다.
Abstract
태반은 종간 해부학 적 변화의 큰 정도를 보여줍니다. 가장 생물학 및 인간 태반의 병태 생리를 이해하기 위해서는, 인간의 세포 및 조직을 이용한 실험을 설계하는 것이 필수적이다. 기관 배양의 장점은 3 차원 구조의 유지 조직과 세포 외 기질이다. 여기에 기술 된 방법의 목적은 인간의 생체 조직 임신성 기관 배양 물을 성공적으로 확립하고 72-96 시간 동안 배양 건강한 유지된다. 이 프로토콜은 운영 스위트에서 신선한 연구 합의 된, 태반과 탈락 표본의 즉각적인 처리를 자세히 설명합니다. 이러한 그렇지 않으면 폐기 될 풍부한 표본이다. 3D 기관 문화를 확립하기 위해 적절한 조직을 선택하는 방법에 대한 형태 학적 세부 사항을 포함하여 이러한 샘플의 멸균 컬렉션 자세한 설명이 제공된다. 태반 융모와 탈락 조직 2-3mm 3 조각으로 microdissected된다몇 일 동안 매트릭스 늘어선 트랜스 웰 필터에 별도로 배치 배양 하였다. 융모와 탈락 기관 배양은 인간 숙주 – 병원균 상호 작용의 연구에 적합하다. 다른 모델 유기체에 비하여, 이러한 인간의 문화 호스트 특이성 변수 패턴을 보여 병원체 감염의 메커니즘을 조사하는 것이 특히 유리하다. 예를 들어, 우리는 임상 적, 통성 세포 내 세균 병원체 리스테리아와 태반과 탈락 기관 배양의 감염을 보여줍니다.
Introduction
모체 – 태아 인터페이스에서의 감염 및 염증은 여성과 어린이의 이환율과 사망률의 주요 원인을 나타냅니다. 병원균이 조직을 감염하는 방법을 이해하는 것은 방지 및 조산 및 태아 사망과 같은 질병을 치료하는 새로운 전략의 발전을 위해 중요하다. 그러나, 산모 – 태아 인터페이스의 높은 종간 변화는 실험 조사를 복잡하게한다. 또한, 대부분의 미생물 병원균은 숙주 특이성이, 이렇게 많은 동물 모델이 완전한 인간 전염병을 요점을 되풀이 할 수 없습니다 보여줍니다. 예, 리스테리아 균 등 다른 호스트 특이성 1의 이상의 중간 레벨을 표시하는 동안 특정 생물 (인플루엔자 균, 살모넬라 typhi, 비브리오 콜레라, 그리고 수많은 다른 사람), 인간 엄격하게 병원성입니다. 호스트 특이성은 식민 2, 보급 3, 면역 회피 (4)을 포함하여, 병원의 여러 측면에서 설명하고있다 </s위로>, 영양 인수 5. 따라서, 최적의 호스트 시스템의 모델을 선택하는 가장 중요하다.
태아 세포와 산모의 혈액으로 구성, 태반이 빠르게 임신 6의 과정을 통해 개발 기관이다. 간단히 말해서, 인간의 태반은 산모의 혈액에서 목욕 태아 "융모"나무와 같은 구조로 구성되어있다. 가스와 영양 교환은 융모 나무의 표면을 줄 trophoblasts라는 전문 태아 세포 층에 걸쳐 발생합니다. 임산부 자궁 점막 라이닝, 비 임신 여성에서 자궁 내막 불리는 fetoplacental 장치를 수용하기 위해 탈락에 구조적 및 기능적으로 변환합니다. 융모 나무는 탈락으로 셀 열을 고정 마이그레이션 extravillous trophoblasts (EVT)에 의해 자궁에 고정된다. 모체 – 태아 인터페이스는, 따라서, 탈락 막과 태반으로 구성되어 있습니다.
장기 배양 기술은 여기에 설명L. 포함 위치 및 방법을 임상 적으로 인간의 병원체를 검사하는 데 사용되었습니다 monocytogene들과 톡소 포자충은 태반 장벽 2,7 교차합니다. 이러한 생체 기관 배양은 생체 조직 구조에서 복제 인간 태반에 대한 논란의 여지 생리 학적 관련성이 높은 모델 시스템입니다. 추가 배양 기술은 3D 매트릭스에 포함 된 전체 장기 외식, 장기 조각, 조직 또는 줄기 세포 organoids를 포함한다. 이러한 옵션에 대한 자세한 내용은 포괄적 최근 리뷰 (8)을 참조하십시오. 이 프로토콜은 탈락 막과 태반 융모의 별도의 문화이므로주의 해주십시오. 태반 세포 및 탈락 막 세포 사이의 상호 작용을 연구하는 공동 배양 기술이 바람직 할 수있다. 우리는 영양막 세포 매개 탈락 혈관 재 9-11을 공부하는 연구자들에 의해 사용되는 전술 한 융모-탈락 공동 배양 기술에 관심있는 독자를 참조하십시오.
Protocol
Representative Results
Discussion
근친 교배, 유전자 변형 및 녹아웃 마우스 균주는 견고 메커니즘을 테스트하는 실험 시스템에서 검색 할 수 있습니다. 그러나 핵심 유전 물질의 일반적인 보존에도 불구하고, 마우스 및 인간의 기능 게놈 규제 요소 (23)에서 유의 한 차이를 보여줍니다. 그것은 따라서, 동물 모델에서 그 유망한 임상 시험은 때때로 인간의 환자에서하지 놀라운 효과적으로 요약되지 않습니다. 태반 따라서 인간의 질병 (24)의 연구를위한 동물 모델 적은 이상적인 다음 렌더링 매우 높은 종간의 다양성을 보여줍니다. 인간 및 마우스 면역학 (25)의 주목할만한 차이, 그리고 태반 해부학의 발음 발산 진화를 모두 인정, 실험 조사에 대한 인간의 임신 조직의 생체 장기 문화의 사용을 고려하는 것이 현명하다.
이 프로토콜에 대한 설명, 사진 이미지, 교육 비디오에 연구원 지시ECM 코팅 된 트랜스 웰 조직 배양 삽입에 융모와 탈락 기관 배양을 설정하는 방법. 이 방법의 장점은 특히 3D 매립 행렬 또는 기관 슬라이스 배양 등 다른 방법에 비해 미세 절개 상대적인 단순성 및 기계적지지 트랜스 웰 시스템을 포함한다. 막 지원에 대한 장기 문화의 서스펜션은 모든 조직 표면에서 영양소를 교환 할 수 있습니다과 생존 단기 문화 (융모 문화 96 시간, 탈락 문화에 대한 72 시간) .This 기술은 조직에서 인간 태반 생물학을 공부 수 있습니다 동안 유지 레벨 단층 세포 배양 모델보다 명백하게 더 생물학적으로 중요한.
이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 장기 배양에 적합한 융모와 탈락 피스의 미세 절개한다. 조직의 최적의 조각을 사진으로 보여 주었다 (그림 2A 그림 3a는)에 대한 연구를 지원하기 위해임신 표본의 시각화의 새로운 기능입니다. 이들 세포가 ECM에 이주하고 막에 융모을 고정 도움이 될 것입니다, 그 가지 EVT 열에서 종료 융모 나무를 선택하는 것이 특히 중요하다. 기관 배양 두 가지 유형에 대한 신중하고 서두르지 않는 방식으로 피펫으로 미디어 변경시 조직에 장애를 최소화하는 것이 도움이된다.
이 기술은 최소한의 어려움을 나타낸다. 경우에 따라, 표본 오염을 보여줍니다. 오염은 일반적으로 세균 (가끔 폴리 미생물)이며, 단지 문화 1-2 일 후에 분명해진다. 오염이 관찰되면, 표백제 배양 폐기 적용되어야하고, 조직 배양 인큐베이터 장기적인 문제를 방지하기 위해 살균. 표본 수확 / 처리 중 자궁 내 감염, 수술 중, 또는 장기 배양 유지 보수시 : 여러 가지 오염이 발생할 수있는 방법이 있습니다. 수확 및 처리 단계는 대부분의 시간이다오염에 대 한 장소를 소개합니다. 따라서, 시료가 수집 및 미세 절개 중에 조작되는 시간을 줄이는 것이 중요하다. 이것은 주변의 비 멸균 환경에 시료의 노출을 감소시킬 것이다. 실험 설정에 따라 해부 현미경 멸균 조직 배양 후드의 내부에 위치 할 수있다.
의학적 관련 병원균 L. 감염 후 기관 배양의 조직 병리학 적 분석 모노 사이토는, 프로토콜의 하나의 가능한 응용 프로그램으로 여기에 표시됩니다. 병원균에 대한 인간의 호스트 응답에 감염 수익률 새로운 통찰력 후 모두 세균과 숙주 면역 세포의 면역 형광 현지화. 탈락 기관 배양은 쥐의 탈락 식세포 방어 기능 (26, 27)의 결함을 보여주는 흥미로운 보고서를 포함하는 생체 마우스 감염에서 생성 된 데이터를 검사 할 수있는 보완적인 생체 실험 기술이 될 수 있습니다. 또한, 인간의 조직배양은 L. 여러 동질 계통 이루어지는 경쟁 접종로 혼합 전략 감염에 사용될 수있다 모노 사이토. 기관 배양의 경쟁 감염은 인간 숙주 내에서 병원성 인자의 관련성을 테스트하기위한 중요한 방법이다. 이 방법의 한 가지 제약 조건은 단기 문화 (융모 문화 96 시간, 탈락 문화에 대한 72 시간)으로 제한된다 조직의 생존이다. 이것은 L. 빠른 속도로 성장하는 미생물 감염에 이상적입니다 모노 사이토,하지만 더 이상 문화 확립하고 조직을 통해 확산하는 데 시간이 더 걸릴 병원균에 대한 필요가있다.
임신 합병증의 글로벌 부담을 줄이기 위해, 연구는 인간의 모체 – 태아 인터페이스의 병태 생리를 이해에 초점을해야합니다. 세균, 곰팡이, 임신 및 태아 감염의 합병증을 파괴 원인이 태아에 어머니로부터 교차 바이러스 성 병원체. 실험실 애니의 생체 감염 제어MALS는 일반적으로 병원균이 식민지 및 기관 (28) 사이의 전송 방법을 해결하기위한 황금 표준으로 간주됩니다. 태반 해부학 포유류 종에 걸쳐 현저하게 변화하기 때문에, 연구 전략으로 인체 조직을 포함하는 가장 중요하다. 인간 융모와 탈락 기관 배양 호스트 병원체 상호 작용을 조사하기 관련성이 높은 모델 시스템입니다. 이 중요한 아직 제대로 이해 기관을 연구하기 위해 연구자는 여기에 설명 된 바와 같이 기관 배양 전략을 사용하여, 그렇지 않으면 폐기 인간의 태반과 탈락 표본의 풍요 로움을 이용할 수 있습니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We are grateful to Cristina Faralla and David Lowe for helpful discussions. We acknowledge Mark Weinstein and San Francisco General Hospital Pathology Department for expert advice. This work was supported by National Institute of Health grants R01AI084928 and Burroughs Wellcome Fund 41259 to A.I.B; G.A.R. was supported by F32AI108195, Society for Pediatric Pathology Young Investigator Research grant, and University of California Partnerships for Faculty Diversity President’s Post-doctoral Fellowship.
Materials
| Sterilization pouches | Fisher Scientific | 01-812-54 | For autoclaving individual dissecting tools |
| Fine mesh strainer | Cuisinart (Amazon.com) | NA | Wrap completely in aluminum foil and autoclave prior to tissue collection. |
| Carboy with spigot | Fisher Scientific | 03-007-647 | For large volume preparation of Wash buffer. |
| Ice packs | Nortech labs | GB8818 | These do not have to be purchased, rather they can be recycled/reused from any routine laboratory shipment that includes them in the packaging. |
| 70% Ethanol | VWR | V1001 | 70% solution made by adding dH20 to 190 or 200 proof research grade alcohol. |
| 10% Bleach | Waxie Sanitary Supply | CLO 30966 | 10% solution made by adding dH20. |
| Light Box | Litebox Lumina (dickblick.com) | 55305-2009 | Note replacement bulbs also purchased on Blick (55305.0100) |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-43 | 4in, 1×2 0.5mm, Slight Curve |
| Micro dissecting forceps | Stoelting | 52102-06 | 4in, Straight Fine, Sharp |
| Micro dissecting vannas spring scissors | Stoelting | 52130-01P | McPherson-Vannas Spring Scissors, 8.5cm, 0.33 Tip, Slight Curve |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | MZ16 or M60 | We have had success with the listed models. External gooseneck flexible light sources are helpful but not necessary. |
| 50 mL conical tubes | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS4558 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 10010023 | We purchase from our university Tissue Culture Core facility, alternate options such as this are available. |
| 10X Phosphate Buffered Saline | Teknova | P0195 | For preparation of Wash buffer we use 10X PBS |
| DMEM/F-12 nutrient mixture (Ham's) with GlutaMAX | Gibco (Life Technologies) | 10565-018 | We purchase this specific media formulation, containing 2.438 g/L sodium bicarbonate, 55 mg/L sodium pyruvate, and 4.5 g/L glucose |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710072 | 1000X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15140-122 | 100X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| Amphotericin B | Gibco (ThermoFisher Scientific) | 15290-018 | 500X stock. Recommend to prepare and store aliquots at -20 °C to avoid freeze/thaw. |
| progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | A 1 mM stock solution is made by reconstituting 15.7 mg progesterone powder in 15.7 mL Ethanol and adding 34.3 mL PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| 17β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | A 10 μM stock solution is made by reconstituting 13.5 mg estradiol powder in 10 mL ethanol and adding 40 mL PBS. Solution is sterile filtered, aliquoted, and stored at -20 °C. |
| Bottle-top vaccum filter (0.22 μm) | Sigma-Aldrich (Corning) | CLS430769 | For sterile filtration of Collection media after preparation |
| 6-well tissue culture plate | BD Falcon | 353224 | Polystyrene, Tissue culture treated |
| 6-well transwells | Millipore | PICM03050 | Insert – 30mm diameter, 0.4μm pore size hydrophilic PTFE membrane |
| Extracellular Matrix (for example, Matrigel Matrix) | BD Biosciences | 354234 | We have utilized Matrigel Matrix in our studies. It is a solid at room temperature and at -20 °C. Avoid repeat freeze/thawing. Thaw bottle to viscous solution at 4 °C, and prepare ~300μL aliquotsin the cold room with chilled pipette tips. Store aliquots at -20 °C. |
| Paraformaldehyde, 16% w/v aqueous solution | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation, a fresh preparation of 4% paraformaldehyde is made by diluting this stock in PBS. |
| Tissue culture incubator, maintained at 37 °C, 5% CO2, 3% oxygen (optional for villous organ cultures) | For some experiments, hypoxia may be preferred. This can be established multiple ways, including addition of exogenous nitrogen via gas cylinder, Tygon tubing, and a regulator. | ||
| Bench top centrifuge |
References
- Pan, X., Yang, Y., Zhang, J. R. Molecular basis of host specificity in human pathogenic bacteria. Emerging microbes & infections. 3, e23 (2014).
- Robbins, J. R., Skrzypczynska, K. M., Zeldovich, V. B., Kapidzic, M., Bakardjiev, A. I. Placental syncytiotrophoblast constitutes a major barrier to vertical transmission of Listeria monocytogenes. PLoS pathogens. 6, e1000732 (2010).
- Zhang, J. R., et al. The polymeric immunoglobulin receptor translocates pneumococci across human nasopharyngeal epithelial cells. Cell. 102, 827-837 (2000).
- Ngampasutadol, J., et al. Human C4b-binding protein selectively interacts with Neisseria gonorrhoeae and results in species-specific infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102, 17142-17147 (2005).
- Pishchany, G., et al. Specificity for human hemoglobin enhances Staphylococcus aureus infection. Cell host & microbe. 8, 544-550 (2010).
- Benirschke, K., Kaufmann, P., Baergen, R. N. . Pathology of the Human Placenta. , (2012).
- Robbins, J. R., Zeldovich, V. B., Poukchanski, A., Boothroyd, J. C., Bakardjiev, A. I. Tissue barriers of the human placenta to infection with Toxoplasma gondii. Infection and immunity. 80, 418-428 (2012).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature reviews. Molecular cell biology. 15, 647-664 (2014).
- Hazan, A. D., et al. Vascular-leukocyte interactions: mechanisms of human decidual spiral artery remodeling in vitro. The American journal of pathology. 177, 1017-1030 (2010).
- Dunk, C., et al. A novel in vitro model of trophoblast-mediated decidual blood vessel remodeling. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 83, 1821-1828 (2003).
- Hunkapiller, N. M., Fisher, S. J. Chapter 12. Placental remodeling of the uterine vasculature. Methods in enzymology. 445, 281-302 (2008).
- Miller, J. M., et al. Guidelines for safe work practices in human and animal medical diagnostic laboratories. Recommendations of a CDC-convened, Biosafety Blue Ribbon Panel. MMWR Surveill Summ. 61 Suppl, 1-102 (2012).
- Lash, G. E., et al. Low oxygen concentrations inhibit trophoblast cell invasion from early gestation placental explants via alterations in levels of the urokinase plasminogen activator system. Biol Reprod. 74, 403-409 (2006).
- Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring bacterial load and immune responses in mice infected with Listeria monocytogenes. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
- Palmer, M. E., Watson, A. L., Burton, G. J. Morphological analysis of degeneration and regeneration of syncytiotrophoblast in first trimester placental villi during organ culture. Hum Reprod. 12, 379-382 (1997).
- Elsinghorst, E. A. Measurement of invasion by gentamicin resistance. Methods in enzymology. 236, 405-420 (1994).
- Kucherenko, M. M., et al. Paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila adult muscles. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
- Croy, B. A., Yamada, A. T., DeMayo, F. J., Adamson, S. L. . The Guide to Investigation of Mouse Pregnancy, 1st Edition. , (2014).
- JoVE Science Education Database. General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy. JoVE. , (2016).
- Troy, T. C., Arabzadeh, A., Enikanolaiye, A., Lariviere, N., Turksen, K. Immunohistochemistry on paraffin sections of mouse epidermis using fluorescent antibodies. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2008).
- Chi, V., Chandy, K. G. Immunohistochemistry: paraffin sections using the Vectastain ABC kit from vector labs. Journal of visualized experiments : JoVE. , e308 (2007).
- Zeldovich, V. B., Bakardjiev, A. I. Host defense and tolerance: unique challenges in the placenta. PLoS pathogens. 8, e1002804 (2012).
- Yue, F., et al. A comparative encyclopedia of DNA elements in the mouse genome. Nature. 515, 355-364 (2014).
- Robbins, J. R., Bakardjiev, A. I. Pathogens and the placental fortress. Current opinion in microbiology. 15, 36-43 (2012).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172, 2731-2738 (2004).
- Redline, R. W., Shea, C. M., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Defective anti-listerial responses in deciduoma of pseudopregnant mice. The American journal of pathology. 133, 485-497 (1988).
- Redline, R. W., McKay, D. B., Vazquez, M. A., Papaioannou, V. E., Lu, C. Y. Macrophage functions are regulated by the substratum of murine decidual stromal cells. The Journal of clinical investigation. 85, 1951-1958 (1990).
- Bakardjiev, A. I., Theriot, J. A., Portnoy, D. A. Listeria monocytogenes traffics from maternal organs to the placenta and back. PLoS pathogens. 2, e66 (2006).
