Observando mitótico Division e Dinâmica em um embrião de peixe-zebra ao vivo

A mitose é essencial um processo celular fundamental para o crescimento, a diferenciação e regeneração de um organismo vivo. Após a preparação exacta e a replicação de ADN na interfase, a célula é preparado para dividir. A primeira fase da mitose, profase, é iniciada por activação de ciclina B / Cdk1. Prophase é caracterizada por condensação de material cromatina em cromossomas. repartição envelope nuclear ocorre na zona de transição entre a profase e prometáfase. Em prometáfase, centrossomas, o centro de nucleação para a formação do fuso, começam a migrar para os pólos opostos enquanto estende microtúbulos em busca de apego kinetochore. Após a fixação, as conversões ao fim-on fixação dos microtúbulos e forças de tensão orientar os cromossomos que formam uma placa metafásica ^1. Se todos os cromossomos estão ligados corretamente, o ponto de verificação de montagem do fuso é satisfeito, anéis coesina segurando as cromátides irmãs em conjunto são clivados, e microtúbulos encurtar a puxar irmãchromatids para pólos opostos durante anaphase ^2,3. A fase final, telofase, envolve o alongamento da célula e reformação do envelope nuclear em torno dos dois novos núcleos. A citocinese completa o processo de divisão, separando o citoplasma das duas células filhas novas ^4-6. Alteração das vias principais de mitose (ou seja, ponto de verificação de montagem do fuso, a duplicação centrossoma, irmã chromatid coesão, etc.) Pode resultar em prisão metaphase, segregação errada dos cromossomas e instabilidade genômica ^7-10. Em última análise, os defeitos nas vias mitose controle pode causar distúrbios do desenvolvimento e câncer, necessitando de visualização de mitose e seus defeitos em um, animal vertebrado, organismo multicelular vivo ^10-16.

embriões de peixe-zebra servir como um grande organismo modelo para imagens ao vivo devido ao tecido transparente, facilidade de microinjeção, e desenvolvimento rápido. Usando peixes-zebra, o objetivo geral deste artigo é o dedescrevem um método de 5D vivo (dimensões X, Y, Z, tempo, e comprimento de onda) imagiologia de mitose ¹⁷ (Figura 1C). O uso de peixe-zebra mutante defeituoso em diferentes vias mitóticas demonstram a consequência de tais defeitos. Para este protocolo, Aurora B e ESCO2 mutantes foram escolhidos para ilustrar esses defeitos. Aurora B é uma cinase que é parte do complexo do cromossoma de passageiros (CPC) envolvida na formação do fuso e do acessório de microtúbulos. Ele também é necessário para a formação de clivagem sulco na citocinese ^18,19. Em peixe-zebra, a deficiência de Aurora B leva a defeitos de indução sulco, citocinese, e segregação cromossomo ^20. ESCO2, por outro lado, é uma acetiltransferase que é essencial para a irmã cromatídeos coesão ^21,22. Ele acetila cohesin na parte SMC3 do anel estabilizando assim cohesin para garantir a segregação cromossômica adequada na transição metaphase-anaphase ^23. Perda de ESCO2 no peixe-zebra leva ao chsegregação errada romosome, irmã separação prematura chromatid, instabilidade genômica e dependente de p53 e apoptose independente ^24,25. Devido à disponibilidade, auroraB ^{hi1045 e hi2865} ESCO2 peixe-zebra mutante (doravante referida como aurB ^{m / m} e ESCO2 ^{m / m,} respectivamente) será usada para ilustrar esta técnica ^25-27.

Acoplamento microscopia confocal com maquinaria da célula fluorescente marcado com permitiu visualizar os investigadores a cromatina e a dinâmica da membrana celular durante a mitose ^25,28,29. histonas fluorescentes etiquetadas têm sido historicamente usado para visualizar cromatina. As histonas são proteínas nucleares compostas por quatro pares diferentes (H2A, H2B, H3, e H4), que são responsáveis ​​pela estrutura do nucleossoma que compõe ³⁰ cromossomas. Enquanto H2B é indiscutivelmente a histona mais utilizado para proteínas fluorescentes emrato e a cultura de células, a utilização de Histona 2A, Z Família (H2A.F / Z) revelou-se bem para o uso em peixes-zebra ^31,32. Concanavalina A e de caseína-quinase 1-gama por exemplo, localizar na membrana celular e que tenham sido previamente mostrado eficaz em visualizar a membrana celular em Drosophila e ouriços-do-mar ^33,34. Outros estudos têm mostrado que a proteína fluorescente marcado com CAAX rotula a membrana celular e foi bem sucedido em peixes-zebra ^31. CAAX é um motivo que é reconhecida por enzimas modificadoras de pós-traducionais tais como farnesyltransferases e geranylgeranyltransferases. Modificações por estas enzimas proteínas causar a tornar-se associada a membrana, rotulagem, assim, a membrana da célula ^35.

Devido ao uso prévio no peixe-zebra, este protocolo escolheu usar H2A.F / Z e CAAX para rotular cromatina e da membrana celular. A aplicação do presente método permitirá que o investigador para monitorar a mitose ao nível da célula individual ao observar cromossomadinâmica, como monitorar bem como, simultaneamente múltiplas divisões celulares que podem afetar a diferenciação e desenvolvimento do tecido. Este artigo irá se concentrar em imagiologia a dinâmica da segregação dos cromossomos durante a mitose no nível da célula individual. Dentro deste manuscrito, a capacidade de observar várias divisões mitóticas, calcular o tempo de divisão, e decifrar os fenótipos mitóticas serão ilustradas e discutidas. Ao usar estes parâmetros, fisiologicamente relevantes de dados pode ser recolhido e aplicado a vários estados de doenças afectadas por defeitos mitóticas.