ライブゼブラフィッシュ胚における有糸分裂とダイナミクスを観察します

有糸分裂は、生体内の増殖、分化、および再生のための重要な細胞プロセスに不可欠です。正確な準備と間期におけるDNAの複製の際に、細胞は分裂するプライミングされます。有糸分裂の第一期、前期は、サイクリンB / Cdk1のの活性化によって開始されます。前期は、染色体にクロマチン材料の凝縮によって特徴付けられます。核膜の内訳は、前期と中期の間の遷移で発生します。前中期では、中心体は、紡錘体形成のための核形成中心は、動原体の添付ファイルの検索で微小管を拡張しながら反対の極に移行し始めます。取り付け時には、変換は微小管の添付ファイルを-終了すると張力は、中期板^1を形成^する染色体を向けます。すべての染色体が正しく接続されている場合、スピンドルアセンブリチェックポイントが満たされ、一緒に姉妹染色を保持コヒーシン環が切断され、および微小管は妹を引っ張って短くされています後期^2,3の間に反対の極にクロマチド。最終段階、終期は、二つの新しい核の周りに核膜のセルと改革の伸長を伴います。細胞質分裂は、2つの新しい娘細胞^4-6の細胞質を分離することにより、分割プロセスを完了します。キー有糸分裂経路（ すなわち、紡錘体形成チェックポイント、中心体の複製、姉妹染色分体の接着など ）の変更は、中期停止、染色体のmissegregation、およびゲノム不安定性^7-10をもたらすことができます。最終的には、有糸分裂を制御する経路における欠陥は、有糸分裂およびライブでの欠陥、脊椎動物、多細胞生物^10-16の可視化を必要と、発達障害やがんを引き起こす可能性があります。

ゼブラフィッシュの胚は透明な組織、マイクロインジェクションの容易さ、および迅速な開発によるライブイメージングのための偉大なモデル生物としての役割を果たす。ゼブラフィッシュを用いて、この原稿の全体的な目標はにありますライブ5D有糸分裂^17（ 図1C）の（寸法X、Y、Z、時間、及び波長）イメージングの方法を記載します。別の有糸分裂経路における欠損変異体ゼブラフィッシュの使用は、このような欠陥の結果を示しています。このプロトコルについては、オーロラBおよびEsco2変異体は、これらの欠陥を説明するために選択しました。オーロラBは、紡錘体形成と微小管の添付ファイルに関わる染色体パッセンジャー複合体（CPC）の一部であるキナーゼです。また、細胞質分裂^18,19内の分裂溝の形成のために必要とされます。ゼブラフィッシュでは、オーロラBの欠乏は畝間誘導、細胞質分裂、および染色体分離²⁰の欠陥につながります。 Esco2は、他の一方で、姉妹染色分体凝集^21,22のために不可欠であるアセチルトランスフェラーゼです。したがって、中期、後期の遷移²³で適切な染色体分離を確保するために、コヒーシンの安定化リングのSMC3部にコヒーシンをアセチル化。ゼブラフィッシュにおけるEsco2の損失をCHにつながりますromosome missegregation、早期の姉妹染色分体の分離、ゲノム不安定性、およびp53依存性および非依存性アポトーシス^24,25。在庫状況により、 オーロラの ^hi1045、および^hi2865変異ゼブラフィッシュをesco2に（以下、それぞれ、aurB ^{メートル/メートル}と呼ばれ、esco2 ^{m / m）の}この手法^25-27を説明するために使用されます。

蛍光タグ付き細胞機構とのカップリング共焦点顕微鏡は、有糸分裂^25,28,29の間にクロマチンと細胞膜動態を可視化する研究を可能にしました。蛍光タグ化ヒストンは、歴史的にクロマチンを可視化するために使用されてきました。ヒストンは、染色体^30を構成^するヌクレオソーム構造を担当している4異なる対（H2A、H2B、H3、およびH4）からなる核タンパク質です。 H2Bは間違いなく中の蛍光タンパク質のための最も使用されるヒストンですがマウスおよび細胞培養、ヒストン2Aの使用、家族Z（H2A.F / Z）はゼブラフィッシュ^31,32で使用するために十分であることが判明しました。コンカナバリンA及びカゼインキナーゼ、例えば、1-γは、細胞膜に局在し、以前にウニとショウジョウバエ^33,34に細胞膜を可視化するのに有効なことが示されています。他の研究では、CAAX蛍光標識タンパク質が細胞膜を標識することが示されており、ゼブラフィッシュ³¹に成功したしました。 CAAXは、farnesyltransferasesやgeranylgeranyltransferasesなどの翻訳後修飾酵素によって認識されるモチーフです。これらの酵素による修飾は、タンパク質は、このように細胞膜^35を標識^する 、膜結合になることが。

ゼブラフィッシュでの使用前に、このプロトコルは、クロマチンと細胞膜を標識するためにH2A.F / ZとCAAXを使用することにしました。この方法の適用は、個々の染色体を観察するために、研究者は、個々の細胞レベルで有糸分裂を監視することができますダイナミクスは、だけでなく、同​​時に組織分化と発達に影響を与える可能性のある複数の細胞分裂を監視します。この記事では、個々の細胞レベルでの有糸分裂の際に染色体の分離のダイナミクスを画像化に焦点を当てます。この原稿の中に、いくつかの有糸分裂を観察する分割時間を計算し、有糸分裂の表現型を解読する能力が示され、説明されます。これらのパラメータを用いて、生理学的に関連するデータを収集することができ、有糸分裂の欠陥の影響を受け、いくつかの疾患状態に適用されます。