观察有丝分裂和动力学在现场斑马鱼胚胎

有丝分裂为生长，分化和再生在活生物体中的关键的细胞过程是必不可少的。在准确的准备和在间DNA的复制，使细胞被起动来划分。有丝分裂，前期，第一阶段是由细胞周期蛋白B / CDK1的活化启动。前期的特征在于染色材料的缩合到染色体。核膜破裂发生在前期和前中期之间的过渡。在早中期，中心体，主轴形成成核中心，开始迁移到对立的两极，而在寻找着丝点附件延伸的微管。一旦附件转换到最终的微管附着和张力定位形成中期板¹染色体。如果所有染色体正确连接时，纺锤体装配检验点满足，黏着​​环抱着姐妹染色单体一起被切开，微管缩短拉妹妹染色单体到对立的两极后期^2,3时。最后阶段，末期，涉及围绕两个新的核核膜的细胞和改革的延伸。胞质分裂完成通过分离两个新的子细胞^4-6的细胞质分裂过程。关键有丝分裂途径（ 即纺锤体装配检验点，中心体复制，姐妹染色单体凝聚力等 ）的改变可能会导致中期逮捕，染色体missegregation和基因组不稳定性^7-10。最终，在通路控制有丝分裂的缺陷会导致发育障碍和癌症，有丝分裂的迫使可视化和其在现场，脊椎动物，多细胞生物体^10-16缺陷。

斑马鱼的胚胎作为实时成像一个伟大的模式生物，由于透明组织，易于注射的，快速发展。使用斑马鱼，这份手稿的总体目标是描述的活5D有丝分裂^17（ 图1C）的（尺寸的X，Y，Z，时间和波长）成像的方法。利用斑马鱼突变体在不同有丝分裂的途径有缺陷的论证这种缺陷的结果。对于这个协议，极光B和Esco2突变体被选择来说明这些缺陷。极光B是一种激酶是参与纺锤体形成和微管附着的染色体乘客复合物（CPC）的一部分。它也需要在胞质^18,19分裂沟的形成。在斑马鱼中，极光B缺乏导致皱纹的诱导，细胞分裂和染色体分离²⁰的缺陷。 Esco2，另一方面，是一种乙酰这对姐妹染色单体凝聚力^21,22是必不可少的。它乙酰化上从而稳定黏结，以确保正确的染色体分离的中期-后期过渡²³环的SMC3部黏着。在斑马鱼Esco2的丧失导致为chromosome missegregation，过早姐妹染色单体分离，基因组不稳定和p53依赖性和独立的凋亡^24,25。由于可用性，auroraB ^{hi1045 和} esco2 ^hi2865突变斑马鱼（以下简称为aurB ^{M / M}和esco2 ^米/分 ，分别地）将被用来说明此技术^25-27。

用荧光标记的细胞的机械耦合共焦显微镜使研究人员有丝分裂^25,28,29中可视化染色和细胞膜动力学。荧光标记的组蛋白在历史上被用于可视化的染色质。组蛋白是四种不同的对（H2A，H2B，H3和H4）是负责该构成染色体³⁰中的核小体结构组成的核蛋白质。尽管H2B可以说是在荧光蛋白中最常用的组蛋白小鼠和细胞培养，用组蛋白2A的，家庭Z（H2A.F / Z）已在斑马鱼^31,32使用证明很好。伴刀豆球蛋白A和酪蛋白激酶1-γ，例如，定位于细胞膜和先前已显示有效的可视化细胞膜在海胆和果蝇^33,34。其它研究已经表明，CAAX荧光标记蛋白标记的细胞膜并成功地斑马鱼^31。 CAAX是受翻译后修饰的酶如farnesyltransferases和geranylgeranyltransferases识别的基序。由这些酶修饰导致蛋白质成为膜相关，从而标记的细胞膜^35。

由于在斑马鱼的先前使用，该协议选择使用H2A.F / Z和CAAX标记染色质和细胞膜。这种方法的应用将允许研究者在单个细胞水平监测的有丝分裂，观察个人染色体动力学，以及同时监测可能影响组织的分化和发育的多个细胞分裂。本文将着眼于在单个单元格级别的有丝分裂过程中染色体成像分离的动态。在这个手稿，观察几个有丝分裂，分裂计算时间和破译的有丝分裂表型的能力进行说明和讨论。通过使用这些参数，生理学相关的数据可以被收集并施加到受有丝分裂的缺陷数的疾病状态。