La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación<em> Coxiella burnetii</em> Durante siRNA silenciamiento

Coxiella burnetii es un patógeno intracelular único que causa la fiebre Q infección humana zoonótica. Esta enfermedad está asociada con un amplio espectro de manifestaciones clínicas que se extienden desde la seroconversión asintomática a la infección crónica que amenaza la vida que a menudo se manifiesta como endocarditis años después de la exposición ^1. La infección humana se produce principalmente a través de la inhalación de aerosoles contaminados con rumiantes el principal reservorio de la infección, en particular, las vacas lecheras, ovejas y cabras. Aunque la infección por Coxiella en estos animales suele ser subclínica, la infección puede desencadenar aborto y la carga bacteriana considerable dentro del fluido de parto y la placenta puede contaminar el medio ambiente local ^1. Un ejemplo de la enorme carga de dicha contaminación puede tener sobre la salud pública y la industria de la agricultura se observó recientemente en el brote de fiebre Q que se produjo en los Países Bajos ^2. Entre 2007 y2010, más de 4.000 casos humanos de fiebre Q fueron diagnosticados y este brote se vinculó a la contaminación significativa de granjas de cabras ^3. Además, Coxiella es un arma biológica potencial, según la clasificación de los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades, debido a la estabilidad ambiental de las bacterias y de baja dosis infecciosa necesaria para causar morbilidad y mortalidad ⁴ grave.

Coxiella existe en dos fases: Fase I organismos, aislados de fuentes naturales, son extremadamente virulenta y Fase II son organismos altamente atenuados in vivo. Por ejemplo, después de varios pasajes en vitro de Coxiella burnetii Nine Mile Fase I organismos, se producen las bacterias de fase II que contiene una deleción cromosómica irreversible que resulta en lipopolisacárido truncada (LPS) ^5. Esta cepa, C. burnetii NMII, es fenotípicamente similar a la Fase I en modelos de cultivo de tejidos y proporciona un modo más segurol para los investigadores estudiar la patogénesis Coxiella en laboratorios ^5. En los últimos años varios avances han avanzado rápidamente en el campo de la genética Coxiella. En particular, el desarrollo de los medios axénicos (acidifica medio cisteína citrato – ACCM-2) ha permitido el crecimiento de células libres de Coxiella en tanto líquidos como sólidos en medios de ^6,7. Esto dio lugar a mejoras directas de herramientas genéticas disponibles para Coxiella incluyendo un sistema de expresión génica inducible, vectores lanzadera y sistemas de transposón azar ^8-11. Más recientemente, dos métodos para la inactivación génica dirigida también se han desarrollado, allanando el camino para el examen de los candidatos de genes de virulencia específicos ^12.

Después de la internalización por los macrófagos alveolares, Coxiella replica en un número elevado dentro de un compartimiento unido a la membrana denominado el Coxiella- contiene vacuolas (CCV). El CCV requiere el tráfico endocítica anfitrión THendosomas tempranos y tardíos en bruto hasta que madura en un orgánulo lisosoma derivados ^13. A lo largo de este proceso, el CCV adquiere factores del huésped que, o bien aparecen de forma transitoria o permanecen asociados con la vacuola, incluyendo, pero no limitado a, Rab5, Rab7, CD63 y el indicador LAMP-1 ^13-15. La replicación de Coxiella dentro de las células huésped es totalmente dependiente de un tipo de sistema completamente funcional Dot / ICM IVB secreción (T4SS) ^8,16,17. Este sistema de secreción es una estructura multi-proteína ancestralmente relacionada con los sistemas de conjugación y se extiende por ambas membranas bacterianas y vacuolar para entregar proteínas bacterianas, denominado efectores, en el citoplasma de acogida ^18. El Coxiella T4SS es funcionalmente muy similar a la del sistema de secreción bien caracterizado Tipo IVB Dot / Icm de Legionella pneumophila ^19,20. Curiosamente, la activación de la translocación efector T4SS y posterior no se produce hasta Coxiella alcanza el lisosoma derivado de ácidoorgánulo, aproximadamente 8 horas después de la infección ^17,21. Hasta la fecha, más de 130 efectores Dot / ICM se han identificado ^9,17,22-24. Muchos de estos efectores probablemente juegan un papel importante durante la replicación de Coxiella dentro de las células huésped; Sin embargo, sólo unos pocos efectores se han caracterizado funcionalmente ^25-29.

En este estudio utilizamos un ensayo de translocación basado en la fluorescencia que se basa en la escisión del sustrato CCF2-AM FRET (en lo sucesivo, el sustrato BlaM) a través de la actividad de β-lactamasa en el citoplasma de la célula huésped (Figura 1). El gen de interés se fusiona con TEM-1 β-lactamasa (BlaM) en un plásmido reportero que proporciona la expresión constitutiva. El sustrato BlaM se compone de dos fluoróforos (cumarina y fluoresceína) que forman un par de FRET. La excitación de los resultados de la cumarina en FRET de la fluoresceína y la emisión de fluorescencia verde en la ausencia de la translocación efector; sin embargo, si el Blaproteína de fusión M-efector se transloca al citoplasma de acogida, la resultante β-lactamasa escinde actividad del anillo β-lactámico del sustrato Blam, la separación de la producción de la emisión de fluorescencia azul después de la excitación par de FRET. Este ensayo de translocación se ha probado como un enfoque para identificar las proteínas efectoras de una gama de diferentes bacterias intracelulares y extracelulares, incluyendo C. burnetii, L. pneumophila, L. longbeachae, Chlamydia trachomatis, E. enteropatógena coli, Salmonella y Brucella ^17,30-35.

Para determinar el papel de los factores del huésped específicas sobre Coxiella translocación efector utilizamos un método bien establecido para el silenciamiento de genes conocido como interferencia de ARN, en particular los pequeños ARN de interferencia (siRNA). Originalmente identificado en Caenorhabditis elegans, la interferencia de ARN es un proceso celular endógeno conservada utilizado para DEFE innataNSE contra los virus, así como la regulación de genes ^36,37. Después de la unión de la secuencia específica de siRNA, la degradación de mRNA se produce a través de RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN) que resulta en el silenciamiento de genes específico o desmontables ^38. En este estudio, siRNA se utiliza para apuntar dos proteínas del huésped, y Rab5a Rab7A, que son importantes reguladores de la vía endocítica. El impacto de silenciar Rab5a y Rab7A sobre la traslocación efector se determinó usando C. burnetii pBlaM-CBU0077. CBU0077 fue seleccionado como se ha demostrado previamente para ser trasladadas por el sistema de secreción Dot / ICM de Coxiella ^17.

Utilizando tanto siRNA silenciamiento de los genes y el ensayo de translocación fluorescencebased descrito aquí, estamos empezando a establecer una función de los factores del huésped en la translocación de las proteínas efectoras por Coxiella. Este enfoque se puede aplicar a una amplia gama de bacterias intracelulares y extracelulares que poseen secretio similaresn sistemas responsables de la translocación de las proteínas efectoras.