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Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
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免疫与感染

박테리아와 균류에 의해 바이러스에 감염된 세포에 바이오 필름 개시의 결정

Published: July 06, 2016
doi:
10.3791/54162
, , ,
1Department of Microbiology and Immunology,Midwestern University

Summary

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Abstract

곰팡이, 박테리아와 바이러스를 포함 분류학 왕국에서 polymicrobial 상호 작용의 연구는 이전에 마이크로 바이 옴의 바이러스 성 회원이 바이러스에 감염된 숙주 세포와 후속 미생물의 상호 작용에 미치는 영향에 대해 조사되지 않았다. 세균 및 진균과 바이러스의 공동 주거 구강 및 생식기의 점막 표면에 주로 존재한다. 점막 세포, 지속적인 만성 또는 지속적인 잠재 바이러스 감염 특히이 표현 수용체의 상당수에서 바이러스 변경을 통해 마이크로 바이 옴의 구성원에 미치는 영향과 유형을 가질 수있다. 숙주 세포의 막 구조의 변형이 바이오 필름의 형성, 즉 부착하는 첫 번째 단계를 개시하기 위해 상주하고 기회 병원균 후속 부재 변형 기능을 초래할 것이다. 이 연구는 biofil의 시작에 HSV의 효과의 정량 및 육안 검사하는 방법을 설명합니다S. m의 형성 (부착) 구균 및 C. 알비 칸스.

Introduction

인간 마이크로 바이 옴 몸에 지리적 영역을 공유하는 여러 분류 학적 왕국에서 다양한 생물이 포함되어 있습니다. 세포 표면에 준수는 마이크로 바이 옴의 식민지화 과정의 일부입니다 생물막 형성에 필수적인 첫 번째 단계입니다. 마이크로 바이 옴에 포함 된 만성 및 지속적인 감염의 원인 바이러스가 될 수 있습니다. 이 바이러스에 의한 만성 세포 감염이 추정되는 수용체의 가용성에 변화를 일으킬 수 있습니다. 또한 1, 2, 세포 내 병원균에 의한 세포 항목도 차례로 박테리아와 곰팡이를 포함한 다른 마이크로 바이 옴 회원의 첨부 파일을 변경할 수 있습니다 호스트 막 유동성 / 소수성에 영향을 미칠 수 . 인간 숙주의 동일한 지리적 영역에서 – 지역화 공동이 여러 병원체 사이에서 발생할 수있는 상호 작용을 이해하기 위해, 우리는 점막 표면에 존재하는 분류학 왕국의 스펙트럼을 나타내는 병원체의 상호 작용을 연구 할 수 있어야한다.

t ">는 헤르페스는 마이크로 바이 옴의 상임 이사국으로 인간의 100 %에 존재하는 미생물의 가족은 3,4. 또한 그들은 또한 지속적으로 증상의 유무에 모두 흘려 될 수있다. 특히, 단순 포진 바이러스 1 및 단순 헤르페스 바이러스 -2 (HSV-1, HSV-2, 각각)는 oronasopharynx 및 생식기의 마이크로 바이 영구 부재이다. 면역 능력이 개인, 두 HSV-1, HSV-2 원인 gingivostomatitis은 물론 음부 포진 5-8.이 사이트에서 HSV는 만성 지속적 nectins, 헤파 란 황산, 지질 뗏목 및 헤르페스 바이러스 항목 중재자의 표면 발현의 변화 세포 결과로 HSV 9. 항목 흘리기 바이러스 증상 / 종양 괴사 특징으로하는 잠재 감염의 원인 인자 수용체 (HVEM / TNFR) 10-25. 일부 박테리아와 곰팡이, 예를 들면 황색 포도상 구균과 C. albicans에 대한이 잠재적으로 공유 나타냅니다 수용체있는 기회 병원균 동안,또한 oronasopharynx (26, 27)의 점막 마이크로 바이 옴의 구성원으로 상주 할 수 있습니다. oronasopharynx S. 내 구균 및 C. 알비 칸스는 식민지의 두 가지 위치를 차지한다. 자연 치아와 호스트에서 구강 점막은 HSV-1과 C.에서 공유 알비 칸스, 전방 코 콧 구멍은 S.에 의해 점유하는 동안 구균 28. 그러나에도 불구하고 체외 조사 결과 그 S. 구균 입 상피 세포에 부착, 29, 30 S. 정상 조직은 29, 30 존재할 때 구균은 드물게 구강 검체에서 분리된다. 리틀는 임상 연구 결과 그 이상 생식기 공동 식민지의 틈새 시장에 관한 알려져있다 S. 구균은 C.하면서, 생식기 염증, 방전 및 성교통 특징, 에어로빅 질염과 연관된 알비 구강 31-35에서 관찰 된 것과 유사한 점막 병변을 생성한다. 따라서, 구강과 생식기 microbi 이러한 회원하지만의 상호 작용에 관한 알려진 작은 오메 크로스 분류 학적 왕국 숙주 세포 표면 5 준수를 통해 biofilm 형성을 시작하기에 영향을 미치기 능력이있다. 이 프로토콜은 효과적으로 공동 정착 / 감염의 기능적 결과를 결정하는데 적용되었다.

Protocol

1. HSV 균주 및 취급 참고 : 재조합 비 확산 HSV-1 (KOS) gL86과 HSV-2 (KOS) 333gJ을 – V. Twiari (36, 37)에 의해 제공되었다 사용되는 베타 – 갈 락토시다 아제 리포터 활동. 1에서 -80 ° C에서 단일 많이 매장에서 바이러스를 사용하여 둘 베코의 변형 이글의 중간 20 % 소 태아 혈청 (FBS)와 (DMEM)의 1의 비율로 사용 할 때까지 우유를 탈지. 바이러스 많이 저장하기 전에 입출력 -nitr…

Representative Results

이 보고서에 설명 된 시스템에서 얻을 수있는 데이터의 안정성의 수준은 그림 2 AF (38)에 표시됩니다. 이 시스템의 사용을 통해 바이러스로 감염된 세포와의 상호 접착에 미치는 효과 포도상 진균 작용의 조절을 묘사 할 수있다. polymicrobial 상호 작용은 동일한 세포에서 발생되는지 여부를 결정하기 위해도 3 및도 4에 도시 된 ?…

Discussion

현재 어떤 정보는 원핵 생물 진핵 세포 및 바이러스 성 즉, 다수의 분류 학적 영역을, 교차 호스트 마이크로 바이 옴의 준 상임 이사국에 영구적 인 사이의 복잡한 상호 작용에 사용할 수 없습니다. 그러므로 우리는 S.으로 생물막 개시를 연구하기 위해 체외 모델 시스템에서 새로운 개발 구균 및 C. HSV-1 또는 HSV-2에 알비 칸스는 헬라 229 (헬라) 세포 <su…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This project was supported by Midwestern University, IL Office of Research and Sponsored Programs (ORSP) and Midwestern University College of Dental Medicine-Illinois (CDMI).

Materials

C.albicans
BBL Sabouraud Dextrose BD 211584
Fungisel Agar Dot Scientific 7205A
S.aureus
Mannitol Salt Agar Troy Biologicals 7143B
Sheep blood agar Troy Biologicals 221239
Hela cells
1xDMEM (Dubelcco's Modified Eagle Medium, with 4.5 g/L glucose and L-glutamine, without sodium pyruvate Corning 10-017-CM
Gentamicin 50mg/ml Sigma 1397 50µg/ml final concentration in the complete DMEM
Trypsin EDTA (0.05% Trypsin, 0.53M EDTA)Solution 1X Corning 25-052-CI
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11150 10% final concentration in the complete DMEM
Other medium and reagents
ONPG Thermo Scientific 34055
Ultra-Pure X gal Invitrogen 15520-018
1x HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) Corning 20-021-CV
1XPBS Dot Scientific 30042-500
RIPA Lysis Life Technologies 89901
Staining
Methanol Fisher Scientific A433P-4
HSV 1&2, specific for gD ViroStat 196
DAPI SIGMA D8417-5MG
Gram Crystal Violet Troy Biologicals 212527
Supplies
Petri dish 100X15 Dot Scientific 229693 
Petri dish 150X15 Kord Valmark 2902
96-Well plates Evergreen Scientific 222-8030-01F
24-well plates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Culture tubes 100×13 Thomas Scientific 9187L61
Cover slip circles, 12mm Deckglaser CB00120RA1
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References

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BiofilmViral InfectionOpportunistic PathogensStaphylococcus AureusCandida AlbicansHSVCMVAdenovirusHeLa CellsC. AlbicansGerm TubeYeast FormAdherenceAttachmentMicrobiomeMultiplicity Of InfectionReporter VirusParaformaldehyde GlutaraldehydeDMEMTrypsinHBSSOD 600

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Plotkin, B. J., Sigar, I. M., Tiwari, V., Halkyard, S. Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi. J. Vis. Exp. (113), e54162, doi:10.3791/54162 (2016).
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