تخليق البروتين Bioconjugates<em> عبر</em> سيستين-maleimide الكيمياء
Summary
تفاصيل هذا البروتوكول الخطوات الهامة اللازمة لbioconjugation من السيستين التي تحتوي على البروتين لmaleimide، بما في ذلك تنقية الكاشف، ظروف التفاعل، وتنقية bioconjugate وتوصيف bioconjugate.
Abstract
The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine – maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.
Introduction
Bioconjugation ينطوي على ربط تساهمي جزيء حيوي واحد مع آخر أو مع جزيء اصطناعي مثل صبغة، المخدرات أو البوليمر. وتستخدم أساليب bioconjugation البروتين الآن على نطاق واسع في العديد من المجموعات البحثية والكيمياء، والبيولوجيا، وتكنولوجيا النانو مع تطبيقات تتراوح بين الفلورسنت صبغ العلامات 1،2، مما يجعل من البروتين (الضد) -prodrugs 3 (تقارن الأجسام المضادة المخدرات – ADCS) توليف البروتين dimers 4،5 ، وصولا إلى السيارات الهجينة البروتين البوليمر الذاتي تجميع 6،7 المستخدمة في النانوي 8 و أنظمة الكيمياء 9.
خصوصية الكيمياء المستخدمة لbioconjugation، في حين لا تنتقد دائما، هو من أهمية قصوى بالنسبة bioconjugates البروتين الأكثر وظيفية، حتى لا تتداخل مع موقع نشط من البروتين الهدف. يحتاج رد فعل bioconjugation المثالي لتحقيق عدة معايير، بما في ذلك: أ) استهداف مواقع نادرة أو فريدة من نوعها على البروتين من الفائدة،ب) أن يكون انتقائيا نحو تحقيق هذا الهدف، ج) المضي قدما في ظل ظروف غير تغيير طبيعة لتجنب البروتين تتكشف والرابع) تكون ذات العائد المرتفع مثل البروتين المستهدف عادة ما يتوافر فقط في تركيز شبه millimolar. وmaleimide – السيستين مايكل بالإضافة يقترب من تحقيق كل هذه المعايير، ولديها لهذا السبب ادعى طويلة وضعا خاصا في مجال bioconjugate الكيمياء 10. هذا هو لأنني) العديد من البروتينات التي تحتوي على السيستين واحد فقط بقايا على سطحها يمكن راثيا هناك، ثانيا) في الرقم الهيدروجيني الصحيحة رد فعل انتقائي للغاية نحو السيستين، ج) وهي تنطلق بسلاسة في المخازن المائية والرابع) فهي سريعة جدا مع معدل ثابت الدرجة الثانية من maleimides للبروتينات التي تحتوي على السيستين ذكرت أن تتجاوز 5000 م -1 ثانية -1 في بعض الحالات 11. قدمت البروتين من الفائدة يمكن أن يتسامح مع كمية صغيرة (≈ 5-10٪) من عضوية المشارك المذيبات 12، أي ما يقرب صبغ functionalized maleimide، صlymer، السطح أو بروتين آخر يمكن ربط البروتينات. وبالإضافة إلى ذلك، maleimides هم أكثر تحديدا لcysteines على البروتينات من iodoacetamides، والتي هي أكثر عرضة للتفاعل مع محب للنواة أخرى في درجة الحموضة المرتفعة. وأكثر استقرارا من الإقتران القائم على ثاني كبريتيد التي تحتاج إلى أن تبقى في درجة الحموضة الحمضية لمنع الصرف ثاني كبريتيد 13.
نحن هنا نورد بروتوكول عام لتصريف جزيئات functionalized maleimide إلى البروتين تحتوي على بقايا السيستين واحدة باستخدام تفاعل بين رو (II) حامل اللون المستندة إلى والبروتين الأكسدة السيتوكروم ج كمثال على ذلك. هذا البروتوكول هو ينطبق أيضا على معظم البروتينات الأخرى التي تحتوي على الوصول بقايا السيستين السطحية والمستهدفة functionalized maleimide المقابلة، سواء كان بروتين آخر، صبغة الفلورسنت، وحامل اللون أو البوليمر الاصطناعية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تنقية المواد الأولية قبل bioconjugation أمر في غاية الأهمية. البروتينات التي تم الحصول عليها من مصادر المؤتلف التجارية غالبا ما تحتوي على الإسوية أخرى من البروتين من الفائدة، والتي يمكن أن يكون مختلفا الكيمياء السطحية والقابلية للتفاعل. على سبيل المثال، في bioconjugation وصفها، …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Australian Research Council (ARC) for ARC Future Fellowship (FT120100101) and ARC Centre of Excellence CE140100036) grants to P.T. and the Mark Wainwright Analytical Centre at UNSW for access to mass spectrometry and NMR facilities.
Materials
| sodium dihydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 71496 | |
| sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71691 | |
| sodium chloride | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| cytochrome c, from saccaromyces cerevisiae | Sigma-Aldrich | C2436 | |
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| TSKgel SP-5PW | Sigma-Aldrich | Tosoh SP-5PW, 07161 | 3.3 mL strong cation exchange column |
| Amicon Ultra-15 | Merck-Millipore | UFC900308 | 3.5 kDa spin filter |
| Slide-A-Lyzer mini dialysis units | Thermo Scientific | 66333 | 3.5 kDa dialysis cassetes |
| Ru(II) bisterpyridine maleimide | Lab made | see ref (14) | |
| acetonitrile | Sigma-Aldrich | A3396 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma-Aldrich | 03609 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 93284 | |
| imidazole | Sigma-Aldrich | 56749 | |
| nickel acetate | Sigma-Aldrich | 244066 | |
| AcroSep IMAC Hypercell column | Pall | via VWR: 569-1008 | 1 mL IMAC column |
| 0.2 micron cellulose membrane filter | Whatman | Z697958 | 47 mm filter for buffers |
| 0.2 micron PVDF membrane filter | Merck-Millipore | SLGV013SL | syringe filters for proteins |
| hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 84426 | extremely corrosive! Use caution |
| caffeic acid | Sigma-Aldrich | 60018 | MALDI matrix |
| trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 91707 | extremely corrosive! Use caution |
| SimplyBlue SafeStain | Thermo Scientific | LC6060 | Coomassie blue solution |
| NuPAGE Novex 12% Bis-Tris Gel | Thermo Scientific | NP0342BOX | precast protein gels |
| SeeBlue Plus2 Pre-stained Protein Standard | Thermo Scientific | LC5925 | premade protein ladder |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Thermo Scientific | NP0008 | premade gel sample buffer |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | Thermo Scientific | NP0004 | premade gel reducing agent |
| NuPAGE MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Scientific | NP0002 | premade gel running buffer |
| Voyager DE STR MALDI reflectron TOF MS | Applied Biosystems | ||
| Acta FPLC | GE | Fast Protein Liquid Chromatography | |
| Cary 50 Bio Spectrophotometer | Varian-Agilent | UV-Vis | |
| Milli-Q ultrapure water dispenser | Merck-Millipore | ultrapure water | |
| Low volume UV-Vis Cuvette | Hellma | 105-201-15-40 | 100 microliter cuvette |
References
- Griffin, B. A., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Specific covalent labeling of recombinant protein molecules inside live cells. Science. 281, 269-272 (1998).
- Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. Bioorthogonal chemistry: Fishing for selectivity in a sea of functionality. Angew. Chem. Int. Ed. 48, 6974-6998 (2009).
- Lyon, R. P., Meyer, D. L., Setter, J. R., Senter, P. D. Conjugation of anticancer drugs through endogenous monoclonal antibody cysteine residues. Meth. Enzymol. 502, 123-138 (2012).
- Natarajan, A., Xiong, C. Y., Albrecht, H., DeNardo, G. L., DeNardo, S. J. Characterization of site-specific ScFv PEGylation for tumor-targeting pharmaceuticals. Bioconjug. Chem. 16, 113-121 (2005).
- Hvasanov, D., et al. One-Pot Synthesis of High Molecular Weight Synthetic Heteroprotein Dimers Driven by Charge Complementarity Electrostatic Interactions. J. Org. Chem. 79, 9594-9602 (2014).
- Thordarson, P., Le Droumaguet, B., Velonia, K. Well-defined protein-polymer conjugates–synthesis and potential applications. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 243-254 (2006).
- Lutz, J. F., Börner, H. G. Modern trends in polymer bioconjugates design. Prog. Polym. Sci. 33, 1-39 (2008).
- Nicolas, J., Mura, S., Brambilla, D., Mackiewicz, N., Couvreur, P. Design, functionalization strategies and biomedical applications of targeted biodegradable/biocompatible polymer-based nanocarriers for drug delivery. Chem. Soc. Rev. 42, 1147-1235 (2013).
- Wong, C. K., et al. Polymersomes Prepared from Thermoresponsive Fluorescent Protein-Polymer Bioconjugates: Capture of and Report on Drug and Protein Payloads. Angew. Chem. Int. Ed. , 5317-5322 (2015).
- Hermanson, G. T. . Bioconjugate Techniques. , (2013).
- Li, J., Xu, Q., Cortes, D. M., Perozo, E., Laskey, A., Karlin, A. Reactions of cysteines substituted in the amphipathic N-terminal tail of a bacterial potassium channel with hydrophilic and hydrophobic maleimides. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (18), 11605-11610 (2002).
- Peterson, J. R., Smith, T. A., Thordarson, P. Synthesis and room temperature photo-induced electron transfer in biologically active bis(terpyridine)ruthenium(II)-cytochrome c bioconjugates and the effect of solvents on the bioconjugation of cytochrome c. Org. Biomol. Chem. 8, 151-162 (2010).
- Borges, C. R., Sherma, N. D. Techniques for the Analysis of Cysteine Sulfhydryls and Oxidative Protein Folding. Antioxid. Redox Signal. (3), 1-21 (2014).
- Peterson, J. R., Thordarson, P. Optimising the purification of terpyridine-cytochrome c bioconjugates. Chiang Mai J. Sci. 36 (2), 236-246 (2009).
- Hvasanov, D., Mason, A. F., Goldstein, D. C., Bhadbhade, M., Thordarson, P. Optimising the synthesis, polymer membrane encapsulation and photoreduction performance of Ru(II)- and Ir(III)-bis(terpyridine) cytochrome c bioconjugates. Org. Biomol. Chem. 11 (28), 4602-4612 (2013).
- Signor, L., Boeri Erba, E. Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa. J. Vis. Exp. , e50635 (2013).
- Foucher, M., Verdière, J., Lederer, F., Slonimski, P. P. On the presence of a non-trimethylated iso-1 cytochrome c in a wild-type strain of Saccharomyces cerevisiae). Eur. J. Biochem. 31, 139-143 (1972).
- Müller, M., Azzi, A. Selective labeling of beef heart cytochrome oxidase subunit III with eosin-5-maleimide. FEBS Lett. 184 (1), 110-114 (1985).
- Shen, B. Q., et al. Conjugation site modulates the in vivo stability and therapeutic activity of antibody-drug conjugates. Nat. Biotechnol. 30 (2), 184-189 (2012).
