סריג הדמיה ב הידרוג תלת ממדי
Summary
הדמיה תהודה העברת אנרגיה פורסטר (סריג) הוא כלי רב עוצמה עבור מחקרים בביולוגיה של התא בזמן אמת. הנה שיטת תאי הדמית סריג ב פיסיולוגי תלת ממדי (3D) microenvironments הידרוג'ל באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence הקונבנציונלי מוצגת. מניתוח עבור בדיקות ratiometric סריג המניב יחסי ליניארי על פני טווח ההפעלה מתואר.
Abstract
הדמיה של העברת אנרגיה תהודה פורסטר (סריג) הוא כלי רב עוצמה לבחינת ביולוגיה של התא בזמן אמת. מחקרים ניצול סריג נפוץ להעסיק דו מימדי (2D) תרבות, אשר אינו לחקות את microenvironment הסלולר תלת ממדי (3D). שיטה לבצע הדמיה רווה פליטת סריג באמצעות מיקרוסקופ קונבנציונלי widefield epifluorescence של תאים בתוך סביבת הידרוג'ל 3D מוצגת. הנה שיטה לניתוח עבור בדיקות סריג ratiometric מניב יחסי ליניארי על פני טווח הפעלת בדיקה מתוארת. מדידת רמות monophosphate אדנוזין מחזורית התאית (cAMP) מודגמת chondrocytes תחת גירוי forskolin באמצעות בדיקה עבור EPAC1 הפעלה (ICUE1) ואת היכולת לזהות הבדלי cAMP איתות תלוי בסוג החומר הידרוג'ל, בזאת הידרוג photocrosslinking (ג'ל PC, פוליאתילן גליקול dimethacrylate) וכן הידרוג'ל thermoresponsive (TR-ג'ל). בהשוואה לשיטות 2D סריג,שיטה זו דורשת עבודה נוספת קטנה. מעבדות כבר ניצול הדמיה סריג ב 2D יכול בקלות לאמץ שיטה זו לבצע מחקרים הסלולר בתוך microenvironment 3D. זה יכול להיות מיושם נוסף הקרנת סמי תפוקה גבוהה ב microtissues 3D המהונדס. בנוסף, זה תואם עם צורות אחרות של הדמית סריג, כגון מדידת אנאיזוטרופיה והדמית חי קרינה (FLIM), ועם פלטפורמות מיקרוסקופיה מתקדמות באמצעות confocal, פעם, או תאורה מווסתת.
Introduction
איתות הסלולר הוא גם מורכב תוצאתיים עבור בתחומים רבים, כולל פרמקולוגיה, הנדסת רקמות, ורפואה רגנרטיבית. כלים מחקריים שימושיים נדרשים כדי לקדם את ההבנה שלנו של ביולוגיה של התא לפתח חומרים אופטימלי לשחזור רקמות. הדמית תהודת העברת אנרגית פורסטר (סריג) היא כלי חיוני המאפשר ניתוח של הפעלת קולטן, קונפורמציה מולקולרית, ואינטראקציות מולקולריות (למשל., חלבון / DNA complexation) בתאים חיים. סריג הוא סוג של העברת אנרגיה הלא מקרין בין fluorophores 1. יש לו יעיל כי הוא ביחס הפוך הכח שישית של המרחק בין fluorophore תורם fluorophore acceptor. לשם כך היא יכולה לספק מידע על המרחק הפיסי בין שתי מולקולות שונות או בין אזורים של מולקולה אחת על בקנה מידה ננומטרי (בדרך כלל 1 – 10 ננומטר) 2. Fluorophores התורם acceptor עשוי להיות מ שונהסוגי olecule (סריג הטרו), שבו יש לתורם פליטת האנרגיה הגבוהה יותר (אורך גל קצר יותר), או מאותו הסוג (הומו-סריג). הדמית סריג יכולה להתבצע על תאים קבועים או לחיות, אבל באופן כללי תאים קבועים משמשים הדמיה של אינטראקציות מולקולריות ברזולוציה מרחבית גבוהה כאשר מערכות confocal במהירות גבוהה אינן זמינות. תאי חיים משמשים כדי לחקור אינטראקציות ותהליכים מעוכבים או הוחלפו על ידי קיבוע, כגון תאיים בזמן אמת איתות בתגובה 3.
מחקרי תא חיים מעסיקות סריג שימוש הדמיה דו ממדים (2D) תרבויות הסלולר בין שאר בשל פשטות רקע נמוך (לא פליטה מחוץ תאי מטוס). עם זאת, תרבויות 2D גם לשנות תהליכים תאיים רבים לעומת במיקרו-סביבה של פיזיולוגי תלת ממדי (3D) תרבות 4,5. לדוגמה, תא יליד תא ותא לאינטראקציות מטריקס הם שינו באופן דרסטי בתרבות 2D המוביל EASily נצפה שינויים במורפולוגיה תא קוטבי 6. Microdomains ממברנה (למשל., Caveolae ודוברות שומנים בדם) ואיתות קולטן מוסדר במידה רבה על ידי סביבת התרבות, בין שאר משום שהם לאגד רכיבי cytoskeletal 7,8 ואת מבנה צורת cytoskeletal תא מוסדרים במידה רבה על ידי סביבת התרבות מרחבית 9. Mechanotransduction אינה מושפעת רק על ידי מטריקס 3D, אלא על ידי תנאי הטעינה משני המורכבים יותר הולידה בסביבות 3D בהשוואה לתרבויות 2D 10. לבסוף, את החדירות של מטריצות 3D היא פחות מדיום התרבות, בכלל עם ירידת דיפוזיה מוגברת עקדת תא מולקולות איתות בהשוואה לתרבויות 2D. עם תרבויות 3D אחד הוא מסוגל ליצור וצפה microenvironment דומה יותר הפיזיולוגי ביחס דבק, כימי, רמזים מכאניים. תא אינטראקציות תא ניתן לקדם את מאפייני ההדבקה ניתן לשלוט wה- i מבנה, רכב, והאדריכלות (דפוסים) של חומר 3D 11-13. התכונות המכאניות של החומר ניתן להתאים גם על ידי 14,15 הרכב והמבנה. Culturing תאים הידרוג ולכן היתרי סריג מחקרים על תאים ראשוניים שאחרת דה להבדיל או שינוי פנוטיפ באמצעות טכניקות קונבנציונליות, למשל., תאי סחוס במפרק. לפיכך, שיטה נדרשה כדי לאפשר מבחני סריג בתרבויות 3D לחיות.
פיגומים הידרוג'ל הם אידיאליים עבור מחקרים המבוססים 3D סריג כי הם יכולים להיעשות אופטיים שקופים ומותאמים לשלוט microenvironment ולספק רמזים הסלולר. הידרוג עשוי פולימרים טבעיים שמש תרבית תאים במשך עשרות שנים, כוללים ג'לטין הפיברין 16. שליטה רבה יותר על המיקרו-סביבה הסלולר ניתן להשיג עם שינוי כימי של פולימרים אלו ועם השימוש בפולימרים סינתטיים 17,18. hydrogel נוקשות מכנית וחדירות יכול להיות נשלט על ידי שינוי המבנה פולימריות שלהם ואת רשת גודל (פולימר וצפיפות crosslink) 19,20. יתר על כן, ניתן לבצע הידרוג ביו, באמצעות שילוב של גורמי גדילה הליגנדים הסלולר. בגלל האפשרויות הללו, ההתפתחות הידרוג עבור biosensing, אספקת סמים, ויישומי הנדסת רקמות היא אזור מאוד פעיל של מחקר 21. הדפסה של הידרוג 3D גם עוברת פיתוח עבור ייצור של רקמות מיקרו -organs 15. לפיכך, סריג הדמיה של תאים הידרוג הוא לא רק שימושי כאמצעי משוער התנהגות הסלולר פיזיולוגי, אלא גם ככלי ללמוד לייעל צמיחה רקמות מהונדסות.
בדיקות סריג ratiometric בינארי הן מאוד שימושיות בלימוד איתות הסלולר יכולות להיות מנוצלות בתרבויות הידרוג'ל. לקבלת רשימה חלקית של פלורסנט שפורסמו סריג בדיקות, ראה באתר Consortium נדידת תאים <sup> 22. סוג בדיקה הנפוץ ביותר מכיל שני fluorophores שונים הקשורים או מקושרים על ידי אלמנט הכרה (ים) (אזור רגיש אנליטי). אזורים אלה לעבור שינוי קונפורמציה, עמותה או התנערות על זיהוי של אנליטי (למשל., עקדת יון או מולקולה, מחשוף האנזימטית של האזור), שמשנה את המרחק בין fluorophores ולכן גודל הסריג (לחיוב או לשלילה) 23. סימן פחות סוג בדיקה נפוץ עדיין שימושי מסתמך על שינוי אנליטי רגיש חפיפה ספקטרלית של שני fluorophores, אשר משנה גודל סריג. "Single-שרשרת" בדיקות ratiometric לנצל זוג fluorophore צמוד על מולקולה בודדת. "Dual-שרשרת" בדיקות לנצל זוגות fluorophore על מולקולות נפרדות, אך הביטוי שלהם ניתן בשילוב באותם קלטת ביטוי 24. בשונה ממחקרים עם ביטוי fluorophore היחיד (למשל., חלבוני היתוך ניאון), מחקרים עם ratiometricבדיקות סריג אינם דורשים transfection כפול לשלוט ליעילות transfection או כדאיות התא. בדיקות ratiometric סריג הם רגישים יחסית יעילות transfection כאשר הביעו מעל סף מינימום (ריכוז רגיש) 23,25. הם אינם רגישים לתנודות מקור עירור וגורם סביבה תאית אחרים (למשל., PH, יונים) כל עוד שני fluorophores מגיב באופן דומה. בנוסף, התגובה שלהם אינה כפופה עיכוב תעתיק, בניגוד פלורסנט אמרגן-כתב bioluminescent בונה 26,27.
בדיקות ratiometric סריג הן בקלות מועסקת לעתים קרובות במערכות מיקרוסקופ קונבנציונליות widefield epifluorescence. מיקרוסקופי widefield עדיפים על פני מערכות confocal סריקת קו הדמית תא חייה בגלל חשש עלות מערכת, הלבנת fluorophore, ואת כיבושה שינויי אות עם רזולוציה של זמן מספיק. בנוסף, אנאלי תא בודדיסיס על אוכלוסייה גדולה של תאים אפשרי עם לכידת במה ותמונה ממונעת מעל שדות מרובים של נוף. מיקרוסקופיה widefield דורשת ניתוח מבוסס עוצמת האותות החלליים הטרו-הסריג. למרות ניתוח עוצם אינו דורש חומרה מורכבת כמו שיטות סריג אחרות, יותר עבודה שלאחר רכישה יש צורך לתקן את ההשפעות של התנהגויות fluorophore ותצורות מערכת מיקרוסקופ / הדמיה 28. עוצמת פליטת בשבי של fluorophore היא פונקציה של אנרגית העירור, Fluorophore תשואה קוונטית, ואת המסנן המשולב מצלמה / רגישות ספקטרלית גלאי ליניאריות 2. אלה עשויים להיות שונים עבור התורם acceptor ידרוש כיול עבור ניתוח כמותי. בנוסף, הדמיה של פליטת acceptor מושפעת חפיפה ספקטרלית של fluorophores (עירור של acceptor ידי אור עירור התורם לדמם דרך של פליטת התורם לתוך ספקטרום פליטה acceptor) 2.4; Single-שרשרת "בדיקות הן פנימי מנורמל כי fluorophores שלהם הם equimolar ב הננומטרי, בעוד fluorophores של" כפול שרשרת "חלליות יכולה להתקיים בבית stoichiometries שונים ברחבי תא 25,28 אם fluorophores של." שרשרת אחת " בדיקות הן של בהירות דומה (פונקציה של מקדם הכחדה ואת תשואת קוונטים), את ההשפעות של רגישות גלאי שאינו ליניארי הן תיקון קטן ורק עבור הקרינה רקע ואת רגישות תשואה / גלאי קוונטים המצמידים נדרשת 23. לפיכך "חד שרשרת" בדיקות ratiometric סריג מיושמות ביותר בקלות במיקרוסקופ widefield 24.
מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה לבצע הדמיה סריג של תאים חיים בתרבויות הידרוג'ל 3D באמצעות מיקרוסקופ epifluorescent widefield קונבנציונאלי. זה יכול לאמץ בקלות על ידי מעבדות כבר בביצוע ניסויי סריג ב 2D, כמו גם מעבדות מעוניינות היתראיתות הסלולר microtissues. כאן אנו מדגימים את השיטה עם מדידה מבוססת הדמית סריג של monophosphate אדנוזין המחזורי (cAMP) רמות chondrocytes חי בתוך photocrosslinking (PC-ג'ל, dimethacrylate פוליאתילן גליקול) ו thermoresponsive (TR-ג'ל, Matrigel) הידרוג. בדיקת סריג ratiometric נוצל מבוסס על EPAC1 (ICUE1) כדי לזהות רמות cAMP בתגובת forskolin, אגוניסט כימי cyclase adenylyl אשר מזרז את ההמרה של ה- ATP ל cAMP. מחנה הוא אחד השליחים השניים העיקריים בתיווך איתות קולטן המצומד לחלבון G וזה מפעיל גורמים שונים, כוללים חלבוני חליפין במורד זרם מופעלים ישירות על ידי cAMP (EPACs). Fluorophores מתרחק על cAMP מחייב את תחום EPAC וכתוצאה מכך ירידת הסריג. המתואר כאן הוא הכנת החומרים הידרוג'ל, transfection התא עם החללית ICUE1, והטבעה של התאים הידרוג 3D. הליך ניסוי 3D הסריג ועל ניתוח התמונה הכרחילשם הערכת פעילות חללית לכל תא מוסברת. כמו כן נדונו ולמגבלות של ניתוח הסריג ב 2 ד ו 3D באמצעות מיקרוסקופ widefield. הטכניקה המוצגת כאן היא שיפור לעומת השיטות 2D הקיימים מאז שהוא מאפשר ניתוח בהקשר פיזיולוגי יותר ודורש תיקון תמונה פחות וכיול. שירות גדול טמון בעובדה כי חומרים שקופים רבים ניתן להשתמש בם תוך העדפות תא transfection יכולות להישמר.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו ממחישה כיצד הדמיה סריג ניתן להשתמש כדי לנתח איתות הסלולר ב הידרוג 3D. בעוד מחקרים קודמים הוכיחו הדמית סריג של תאים שנזרעו על מצעים הידרוג'ל 35-37, של אינטראקציות תאיות עם הידרוג 38, ושל מולקולות לכודות בתוך הידרוג 39-41, זהו הפרסום הראשון לתאר ניתוח תאי מבוסס הדמית הסריג של תאים המוטבעים בתוך הידרוג 3D. העבודה פותרת מספר בעיות ביישום כאשר תרגום הדמית סריג מ 2D ל 3D. ראשית, מטרות צמצם מספריות גבוהות נדרשות עבור הדמית הסריג לאסוף אות פליטה מספיק, אבל הם מגבילים את עומק השדה. התאים כאן מותר להתיישב מעט באמצעות צנטריפוגה כדי להגדיל את מספר תאי מטוס מוקד ליד הזכוכית כדי לפצות על זה. שנית, פיגומי הידרוג'ל 3D עשויים לסטות פני שדה הראייה במהלך הדמיה אשר מסבכת ניתוח. הידרוג כאן מודבקים אל coverslip כך שהם נשארים קבועים לאורך כל הניסוי. בחירה שלישית, של יצירות הידרוג'ל מתאימות 3D סריג חיונית כי הידרוג'ל עלול לעכב הדמיה של התאים. הנה הידרוג שקוף של ג'ל PC ו- TR-ג'ל משמש. עם זאת, איסוף התאים עם צנטריפוגה מטוס מוקד ליד coverslip יכול לשמש תאים התמונה ב הידרוג עם גבוה הבחירה diffraction.The של הידרוג'ל תלוי בתנאי microenvironment כי חייב להיות מדומה, אשר ניתן למצוא סקירה על הידרוג'ל 42 . רביעית, חישוב חלופי מועסק כאן ליחס סריג של החללית ICUE1 שרשרת אחת (כלומר, E QE = QE / cAem) כדי למזער את מספר הערוצים תמונה הנדרש לניתוח ובכך למזער photobleaching. יחס הסריג הממוצע לכל תא מחושב כממוצע של היחסים לפיקסל בתוך תא למזער הערכה נמוכה מדי של יחס הסריג בפועל. לבסוף, ניתוח ratiometric ליניארי ואמצעיכדי לחשב את החלק היחסי המופעל של בדיקות בינארי שרשרת אחת מתואר.
ישנם כמה היבטים קריטיים של ביצוע ניסויי סריג מוצלחים באמצעות מיקרוסקופ widefield. עם כל כבוד לחומרה, המצלמה חייבת להיות רגישה מספיק כדי לפתור שינויים לאות קטנים, משאיר מצלמות CMOS מדעיות חדשות ועיבוד ממוחשב הכפלת אלקטרונים טובים CCDs מתאים יותר קונבנציונלי. כדי טוב ביותר לנתח את הפריסה המרחבית של יחס הסריג, המצלמה חייבת לכל הפחות להחזיק פעמים את הרזולוציה המרחבית של פונקצית התפשטות נקודת המטרה (קריטריון נייקוויסט). זה עושה מערכות תצוגה כפולה פחות מתאימות למשימה. גורם משמעותי יותר הוא לבחור רכישה בשיעור חשיפה ותמונה מתאימה עבור זוג הסריג הנתון כדי למזער photobleaching של fluorophores. רכישה בשיעור ירד מומלץ ככל מגדיל את משך ניסוי. שימוש גלגלים מסננים מהירים מגביר את קצב רכישה ומספר FOVs לניתוח בעוד להימנעing את והרשמת תמונה עם תצוגה כפולה וקוביות מסנן צריח. שדה תאורת הומוגניות מסבך תיקון עבור קרינת רקע נובעת autofluorescence מדגם ורעש מערכת מצלמה. הידרוג חלק, במיוחד אלה המכילים חלבונים collagenous הם מאוד autofluorescent 43,44. יחסי הסריג הם זלזלו ללא צורך בתיקון ברקע. כאן אנחנו מעסיקים שיטת תיקון רקע פשוט המסתמכת על מגרש התאורה השטוח יחסית אשר יכול להיות מוגדר לעתים קרובות עם תאורת עלית קרינה על מרכז התמונה (האיור 3B, שלב 7.2). שיטה זו ולכן מגביל תאים לעניין את אלו בתוך שדה הארה זו. תיקון הרקע המתואר כאן אינו לוקח בחשבון autofluorescence הסלולר של אורכי הגל לקריאה מתוך החללית בינארי. במקרה כזה, תאים ללא תווית (לא transfection בדיקה) צריכים להיות צלמו באותם התנאים והרקע מופחתים. זרקix של תאים שכותרתו ללא תווית ניתן להשתמש והתאים ללא התווית נבחרו לארח את ההחזר על ההשקעה ברקע. שיטות חלופיות המספקות לניתוח תא לאורך כל מגרש התמונה כולה כוללות שימוש במסכת הצללה, ROIs רקע מרובה, או דגימות זהות ללא תאי פרוטוקול זמין על פי בקשה.
ספציפית הדמית 3D סריג, בתגובת בדיקה רגישה מאוד חדיר הידרוג'ל אל אנליטי (איור 6). לכן באותו האזורים הידרוג'ל מושווים פני טיפולים ניסיוניים, רצויה בנקודת סימטריה גיאומטרית כמו למשל בסמוך למרכז הפיגום כפי שמוצג כאן. לחלופין, תאי microfluidic / מתקני הגידול עשוי להיות מועסק על מנת במהירות אחידה perfuse הידרוג עם פתרון אנליטי 45. אות סריג לא תזוהה (יחס האות לרעש נמוכה מדי) כאשר של autofluorescence הידרוג'ל הוא גבוה מדי; הידרוג מדלל או בדיקה אחרת (fluorophores השונה) אמור לשמש.עם כל כבוד הדמית 3D סריג ב הידרוג photocrosslinked, שימוש חשיפת הקרנת מינימום אורכי גל מחוץ ספקטרום העירור של fluorophores הבדיקה מומלץ. LAP ניתן להשתמש עם מקור האור הנראה ב 405 ננומטר כדי לצמצם עוד יותר נזק לתאים פוטנציאל 31,46. עם זאת, LAP משתמש עם 365 הקרנת ננומטר מומלץ כי זה ממזער הלבנת חללית. 365 ננומטר שוכן בקצה הזנב של ספקטרום עירור תורם CFP, ואילו 405 ננומטר עומד עירור השיא. לחלופין, הביטוי החללי יורשה להתאושש במשך יום אחד. שימוש בדיקות בינארי ממזער בעיות של רגישות להבדלים ברמות ביטוי ב דיפוזיה מולקולרית של fluorophores תורם acceptor. בדיקות ללא בינארי ניתן להשתמש, אבל עם SE במקום הדמיה QE ותיקון נוסף לדמם דרך ספקטרלי של ספקטרום עירור ופליטה (ראה להלן). יתר על כן, הזמינות המסחרית הנמוכה ואת המורכבות בעיצוב בדיקות סריגעשוי להיות מכשול. הגורם הקריטי ביותר עבור ניסויים מוצלחים נשאר תיקון ראוי וניתוח של אותות הקרינה.
חישוב חלופי של יחס סריג מנוצל מכמה סיבות נוספות מלבד ומזעור photobleaching. עבור בדיקות חד שרשרת בינארי, היחס מדווח כלל היא פליטת acceptor תחת עירור תורם (פליטה רגישה, SE) כדי פליטת תורם תחת עירור תורם (פליטת רווה, QE), כלומר, סריג יחס = SE / QE 25,47,48. SE / QE היא יחסית שאינו ליניארי לשינויי סריג יעיל 21,22,47. כלומר, היחס יש יחסים שאינו ליניארי אקספוננציאלית ליעילות סריג הטבועה של החללית (EI) (Donius, AE, Taboas, פורסם העבודה JM. (2015)), עם ליניארי ביותר יחס Ei פחות כ 15%. SE / QE יהיה גם לזלזל השבריר של בדיקות מופעלות (FAP, כלומר, חלק של בדיקות מחייב אנליטי). Therefoמחדש, ניתוח של SE / QE דורש מחקר תגובת שיווי משקל מנה מסורבלת עקומה. למרבה המזל, את היחס של SE או QE כדי פליטת acceptor תחת עירור acceptor (AEM) הם ליניאריים ביחס Ei ואת FAP, כלומר, יחסי סריג SE / AEM ו QE / AEM. SE / AEM משמש לעתים קרובות עבור בדיקות בינארי ורק דורש כיול נקודת סיום (ללא פעילות חללית ופעילות בדיקה מלאה), אבל איתות הסלולר הבזליים מקשה. כדי לבטל את הצורך בכיול נקודות קצה, SE ניתן לתקן (CSE) עבור חפיפה ספקטרלית של ספקטרום תורם acceptor עירור ופליטה (דרך לדמם ספקטרלי) ועבור תשואת הקוונטים והרגיש ספקטרלי (QS) של fluorophores הבדיקה המשולב מיקרוסקופ מערכת הדמיה. יחס SE סריג התיקן המבוסס על מנוע חיפוש מותאם אישית מגדיר את יעילות הסריג הנצפית של החלליות בתוך כל פיקסל של תמונה, כלומר, E SE = CSE / AEM. תוכנה מסחרית ללא תשלום זמינה כדי לתקן SE עבור השפעות אלוהקורא נקרא לעבודת חן Periasamy 2006 הסבר מפורט של שיטות 50. עם זאת, חישוב E SE דורש לכידה של שלושה ערוצים תמונה לכל נקודת זמן (SE, QE, AEM). לכן, בעבודה זו אנו גם מפעילים יחס סריג חלופי E QE = 1 – QE / cAem, מחייב חטיפת שני רק ערוצי תמונה (QE ו AEM). חישוב E QE מערוצים אלה רק דורש תיקון AEM עבור QS (cAem = AEM x QS). QS = Dem / AEM מוערך בקלות באמצעות שתי תמונות מן המדגם כיול אחד, שבו Dem הוא פליטת התורם תחת עירור התורם עם השיער המחומצן acceptor. FAP בכל רגע יכול להיות מחושב על ידי השוואת E SE או E QE אל Ei של החללית.
בסופו של דבר, בחירת יחס סריג (E SE = CSE / AEM לעומת E QE = QE / cAem) צריך להתבסס על שיקול מהסוג החללי לבין הערוצים עם האות הטוב ביותר. הואpproaches כוללת תיקון רעש רקע של תמונות לכל מסגרת כמתואר לעיל לחשבון לשינויים autofluorescence לאורך זמן. הם מניחים ללא חפיפה של אור עירור AEM לספקטרום עירור Dem, אשר לעיתים קרובות את התיק בשל לחקור תצורת מסנן עיצוב ומיקרוסקופ. בדיקות חד שרשרת יכולות להשתמש גם ובחירה מבוססת על האות החללית הטובה ביותר (בהירות) לרעש מצלמה כדי אות רקע על SE וערוצי QE. עבור חללית ICUE1 תנאי ניסוי משמשים כאן (סוגי תאים ו הידרוג'ל), יש SE אות חזקה יותר QE. בדיקות Dual-שרשרת דורשות שימוש E SE בשל חלוקה הלא equimolar של fluorophores תורם acceptor. עבור בדיקות כי ירידת הסריג על מחייב אנליטי כגון ICUE1, סריג יעילות ניתן "הפוך" להציג שינוי איתות חיובי על כבילת אנליטי כפי שאנו עושים כאן, עם E SE = 1 – CSE / AEM או E QE = QE / (AEM x QS).
ניתוח של הדואר FAP רגישה תיקון תקין של יחסי סריג וכדי אומדן Ei. ניתן להעריך עם מדגם זהה כיול המשמש QS ו נקודת קצה קונבנציונאלי סריג assay יעילות כמו Ei = 1- (QE / Dem) (תמונה QE ואחריו photobleaching acceptor ותמונה Dem) 28, אך יש לנקוט זהירות כדי למזער הלבנה מקרית של התורם. אנו מתארים גירסה שונה שבו האומדן של Dem מבוסס על AEM המותאמת QS מוחלף, כלומר, Ei = 1 – (QE / (AEM x QS)). לחילופין, Ei = CSE / AEM ניתן להשתמש. הערכת Ei בתאים חיים דורשת שכל הבדיקות שתסייענה מלא סריג. זה קשה להשיג בפועל עבור בדיקות, כגון ICUE1 כי ירידת סריג על כבילת אנליטי. חישוב המבוסס חוץ גופית של Ei באמצעות lysates התא אנליטי מטוהרים הוא הכי טוב, אבל מחוץ להיקף עבודה זו. כאן אנו ממליצים להשתמש 2 ', 5'-Dideoxyadenosine להקטין cAMP בתאים. עם זאת, קרוב משפחה FAP עשוי bדואר מחושב תוך שימוש באומדן Ei נגזר מרמת הבסיס של איתות. מסיבות אלה, רוב המחקרים מדווחים לעתים קרובות יחס סריג (כפי שנעשה כאן) או קרוב משפחה FAP מבוסס על כיול נקודת הסיום, שבו הבסיס איתות לפני הוספת אגוניסט הוא החסם התחתון ואת האות לאחר הוספת אגוניסט השני כי מרווה האיתות היא העליונה כָּרוּך. Forskolin לעתים קרובות משמש אגוניסט מלא להרוות אות cAMP. לחלופין, אנלוגי cAMP ניתן להשתמש כגון 8-Bromoadenosine 3 ', monophosphate 5'-מחזורי. בקרות חיוביות בשימוש על סיום הלימודים לזהות שינויים אפשריים מסלול האיתות בין טיפולים ניסיוניים מומלצות.
חישוב תגובת האיתות הממוצעת לכל תא דורש שיקול של מספר גורמים. ראשית, יחס הסריג הממוצע יחושב כממוצע של היחסים על כל פיקסל בתוך תא, כלומר, (Σ (QE/cAem)) / (מספר הפיקסלים), במקום raטיו של QE הממוצע AEM בתא, כלומר, (ΣQE) / (ΣcAem). למרות שהאחרון אינו מחייב מיסוך להיזהר כמו רעש רקע נמוך, זה חמור מזלזל יחס סריג הממוצע האמיתי. עם זאת, יחסי פיקסל נקבעו שיש לחשב נקודה צופה ו מיסוך בינארי הזהיר של שטח התא להגדיר את ROIs ולהימנע הכללת יחסים מזויפים המופקים רעשי רקע מחוץ לתא. אזור כל התא חייב להיות לכמת כדי למנוע תוצאות הטיית על צורת התא. המיסוך ייתכן שיהיה צורך להגדיר מחדש לאורך זמן בהתאם לשינויים בצורת התא הגירה. לחלופין, גדול ROIs מאשר התא עשוי לשמש אם קריטריוני הדרה מוגדרים להסיר יחסי פיקסל QE ו AEM אותות לרדת מתחת רמות הסלולר הם רמות רקע קרובות. פרט שיטות ניתוח תאר את הצעדים הבסיסיים המשמשים בעבודה זו לניתוח סריג ללא תוכנה / plugins מיוחד. יצרני מיקרוסקופ וספקים אחרים למכור התוספת על מודולים עבור תוכנת מיקרוסקופ שלהם, אשר תומכת ratiometric אוטומטי סריג ניתוח. כמו כן, תוכנת ImageJ ברשות הציבור יש כמה תוספים זמינים חלקיקים וניתוח סריג, כגון RiFRET. שנית, היחס סריג הממוצע פיקסל מבוססת מזלזלת היחס הממוצע האמיתי של המבנה התאי 3D כי תמונת 2D משמש. אותות 2D מצהירים ממוצע לאורך ציר ה- z. חישוב הפריסה המרחבית 3D של יחסי סריג בתאים חיים אינו אפשרי ללא הדמיה 3D במהירות גבוהה (למשל., באמצעות ספינינג מיקרוסקופיה דיסק confocal). זוהי בעיה עבור שתי תרבויות 2D and 3D, אבל יש השפעה גדולה יותר ב 3D כמו יותר של המבנה התאי קיים מתוך מטוס. זהו מקור לדאגה רבה עבור בדיקות כי למקם מבנים הסלולר, כגון PM-ICUE החללית EPAC1 קרום הפלזמה. ראה ואח Spiering. 2013 הצעות לתקן תופעות עובי תא על חישובי יחס 24. ניתוח של חלוקת AEM יכול לשמשלזהות אם חללית מצטברת באזורים של מטוס תא הדמיה המותאם. זה גם יעזור לפרש את הפריסה המרחבית של יחסי סריג ולבער תוצאות מזויפות, למשל., זיהוי רווית בדיקה (כלומר, אזור AEM נמוך יצטרך ריכוז חללית נמוך עשוי להפגין רוויה חללית ויחס סריג גבוה). רמות שלישיות, מחקר סריג שונה עשויות להצביע על הבדל ביעילות transfection, לחקור ביטוי, או איתות הבזליים בין קבוצות ניסוי. "ניתוח יחסית" (שלב 10.1.1) מסייע להסיר סחף יחס הסריג לאורך זמן אם הוא קיים. הוא מאפשר השוואות של הגודל היחסי של תגובות בין דגימות, אך מעכב בהשוואת הזמן כמובן תגובה למדגם ההפניה (עלילת שליטה היא קו ישר). "Absolute ניתוח" (שלב 10.1.2) מאפשר השוואה של שיעור ההיענות ברחבי דגימות, אך סלי השוואה של עוצמת תגובה כי כל שורה תשתנה ידי dissimקבוע ilar. מחקרים מרבים להשתמש רגרסיה ליניארית על קו הבסיס לתקן סחף יחס הסריג לאורך זמן.
השיטה 3D סריג תיאר היא דרך יעילה ומעשית לפברק ולבצע הדמיה זמן לשגות של הידרוג 3D עמוס התא, אשר יכול להיות מיושם על בדיקות אחרות שיטות הדמיה. מערכת סריג אחרת מלבד בדיקות בינארי שרשרת אחת תדרוש תיקון מורכב יותר של אותות מבוססים בעצמה, כפי שפורטה לעיל. לחלופין, הדמית חי קרינה של סריג (FLIM-סריג) ניתן להשתמש כדי לחשב סריג יעיל באמצעות שינוי בחי פליטה של התורם החללי. בניגוד מבוסס עוצמת סריג, FLIM סריג הוא רגיש לרעשי רקע, לדמם דרך ספקטרלי, יעילות קוונטית, ואת רגישות ספקטרלית גלאי 2. עם זאת, מערכות FLIM יקרות, מורכבות, ונדירות, ולעבוד בצורה טובה ביותר עם fluorophores עם ריקבון מעריך יחיד ואין FLIM ניגר 49. השיטה המתוארת עשויה לשמש גם עם מומחדש פלטפורמות מיקרוסקופ מתקדמות (למשל., סריג TIRF, אנאיזוטרופיה קרינה, סריג קורלציה רפאים). ע"פ שיטה זו הדמיה 3D עם confocal במהירות גבוהה מיקרוסקופיה multiphoton יקל ניתוח התפלגות המשנה הסלולר של בתגובה איתות להגביר את הדיוק של איתות ניתוח. שיטת 3D סריג זה יאפשר מחקרים בביולוגיה של התא מתקדמים microenvironments הסלולר 3D מדומה. ככזה, הוא יכול בקלות להיות מיושם פרמקולוגיה וצרכי הרפואה רגנרטיבית, כולל לימוד איתות אינטר וסינון בתגובת תרופת microtissues הידרוג'ל המבוסס המהונדס.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים על התמיכה הכספית של בית הספר לרפואת שיניים באוניברסיטת פיטסבורג, ה- National Institutes of Health בפרס K01 AR062598, ו DE030740 P30 מענק. המחברים גם להודות לד"ר ג'ין ג'אנג עבור פלסמיד ICUE1, וויין Rasband לפיתוח ImageJ ומיכאל Cammer עבור מאקרו ImageJ.
Materials
| Polydimethylsiloxane (PDMS) [Sylgard 184 Elastomer Kit] | Fisher Scientific (Ellsworth Adhesives) | NC0162601 | Reagents |
| Polyethylene glycol dimethacrylate (PEGDM) | Prepared according to Lin-Gibson with PEG from Sigma Aldrich | 95904 | Reagents |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma Aldrich | M6514 | Reagents |
| 3-glycidoxypropyltrimethoxysilane | Sigma Aldrich | 440167 | Reagents |
| Dimethyl Phenylphosphonite | Sigma Aldrich | 149470-5g | Reagents |
| 2,4,6-trimethylbenzoyl Chloride | Fisher Scientific | AC244280100 | Reagents |
| 2-Butanone | Fisher Scientific | AC149670010 | Reagents |
| Lithium Bromide | Fisher Scientific | AC199871000 | Reagents |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 190764 | Reagents |
| Sigmacote (siliconizing reagent) | Sigma Aldrich | SL2 | Reagents |
| Toluene | Fisher Scientific | AC36441-0010 | Reagents |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Hyclone | SH3025601 | Reagents |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (phenol- and serum-free medium) | Life Technologies | 11058-021 | Reagents |
| FuGENE HD Transfection Reagent (transfection reagent) | Promega | E2311 | Reagents |
| Cellstripper (cell dissociation solution) | Corning | 25-056-CI | Reagents |
| Growth Factor Reduced Matrigel, Phenol Free | Corning | 356231 | Reagents |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Reagents |
| Pipette Tips (10,200,1000 μl) | Fisher Scientific | 02-707-474, 02-707-478, 02-707-480 | Disposable lab equipment |
| Powder Free Examination Gloves | Fisher Scientific | 19-149-863B | Disposable lab equipment |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | Disposable lab equipment |
| Biopsy punch (3 mm) | Miltex | 3332 | Disposable lab equipment |
| Glass coverslips | Fisher Scientific | 12-544C | Disposable lab equipment |
| Precoated glass coverslips (epoxysilane) | Arrayit | CCSL | Disposable lab equipment |
| Glass slide | Fisher Scientific | 12550D | Disposable lab equipment |
| Sterile vials (15 mL, 50 ml conical) | Fisher Scientific | 14-959-70C, 14-959-49A | Disposable lab equipment |
| Cell culture dish (6-well) | Falcon | 351146 | Disposable lab equipment |
| Epifluorescent Microscope with motorized stage | Nikon | MEA53100 (Eclipse TiE Inverted) | Large/non-disposable lab equipment |
| Adjustable Specimen Holder for XY Stage | Nikon | 77011393 | Non-disposable lab equipment |
| 60x (1.3 NA) objective (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda) | Nikon | MRD01605 | Non-disposable lab equipment |
| CFP/YFP light source and excitation / emission filter holders (Lambda light source & wheel, Lambda emission filter system) | Nikon (Sutter Instrument reseller) | 77016231, 77016088 | Non-disposable lab equipment |
| CYF/YFP filter set | Nikon (Chroma Technology Corp) | 77014928 | Non-disposable lab equipment |
| Camera (ORCA Flash 4.0 v1) | Nikon (Hamamatsu reseller) | 77054076 | Non-disposable lab-equipment |
| NIS-Elements 40.20.02 microscope software) | Nikon | MQS31100 | Non-disposable lab equipment |
| Prism (spreadsheet and graphing software) | GraphPad Software, Inc | Version 6 | Non-disposable lab equipment |
| OmniCure S1000 UV Spot Curing Lamp System with 365nm filter or other light source (λ=365 or 405) | OmniCure | S1000 | Large/non-disposable lab equipment |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | DP-100 | Non-disposable lab equipment |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | Reichert Bright-Line 1475 | Non-disposable lab equipment |
| Vacuum desiccator chamber/degasser | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Tissue Culture Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Chemical Fume Hood | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Oven | Any | Large/non-disposable lab equipment | |
| Spatula | Any | Non-disposable lab equipment | |
| Beaker | Any | Non-disposable lab equipment | |
| Incubator | Any | Large/non-disposable lab equipment |
References
- Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. Curr. Opin. Chem. Biol. 10 (5), 409-416 (2006).
- Wallrabe, H., Periasamy, A. Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy. Curr. Opin. Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).
- Lohse, M. J., Nuber, S., Hoffmann, C. Fluorescence/bioluminescence resonance energy transfer techniques to study G-protein-coupled receptor activation and signaling. Pharmacol Rev. 64 (2), 299-336 (2012).
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).
- Mseka, T., Bamburg, J. R., Cramer, L. P. ADF/cofilin family proteins control formation of oriented actin-filament bundles in the cell body to trigger fibroblast polarization. J. Cell Sci. 120 (24), 4332-4344 (2007).
- Holowka, D., Sheets, E. D., Baird, B. Interactions between Fc(epsilon)RI and lipid raft components are regulated by the actin cytoskeleton. J. Cell Sci. 113 (Pt 6), 1009-1019 (2000).
- Alenghat, F. J., Ingber, D. E. Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins. Sci Signaling. (119), (2002).
- Guilak, F., et al. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell stem cell. 5 (1), 17-26 (2009).
- Polacheck, W. J., Li, R., Uzel, S. G., Kamm, R. D. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 13 (12), 2252-2267 (2013).
- Burdick, J. A., Anseth, K. S. Photoencapsulation of osteoblasts in injectable RGD-modified PEG hydrogels for bone tissue engineering. Biomaterials. 23 (22), 4315-4323 (2002).
- Benoit, D. S. W., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells. Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).
- Tsang, V. L., et al. Fabrication of 3D hepatic tissues by additive photopatterning of cellular hydrogels. FASEB J. 21 (3), 790-801 (2007).
- Zhu, J., Marchant, R. E. Design properties of hydrogel tissue-engineering scaffolds. Expert Rev. Med. Devices. 8 (5), 607-626 (2011).
- Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33 (26), 6020-6041 (2012).
- Kumbar, S. G., Laurencin, C. T., Deng, M. . Natural and Synthetic Biomedical Polymers. , (2014).
- Kirschner, C. M., Anseth, K. S. Hydrogels in Healthcare: From Static to Dynamic Material Microenvironments. Acta Mater. 61 (3), 931-944 (2013).
- Guvendiren, M., Burdick, J. A. Engineering synthetic hydrogel microenvironments to instruct stem cells. Curr Opin Biotechnol. 24 (5), 841-846 (2013).
- Gulrez, S. K. H., Al-Assaf, S., Phillips, G. O., Capri, A. . Progress in Molecular and Environmental Bioengineering – From Analysis and Modeling to Technology Applications, Ch. 5. , 117-149 (2011).
- Iza, M., Stoianovici, G., Viora, L., Grossiord, J. L., Couarraze, G. Hydrogels of poly(ethylene glycol): mechanical characterization and release of a model drug. J. Controlled Release. 52 (1-2), 41-51 (1998).
- Deligkaris, K., Tadele, T. S., Olthuis, W., van den Berg, A. Hydrogel-based devices for biomedical applications. Sens. Actuators, B. 147 (2), 765-774 (2010).
- Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
- Yuan, L., Lin, W., Zheng, K., Zhu, S. FRET-Based Small-Molecule Fluorescent Probes: Rational Design and Bioimaging Applications. Acc. Chem. Res. 46 (7), 1462-1473 (2013).
- Spiering, D., Bravo-Cordero, J. J., Moshfegh, Y., Miskolci, V., Hodgson, L. Quantitative ratiometric imaging of FRET-biosensors in living cells. Methods Cell Biol. 114, 593-609 (2013).
- Kikuchi, K., Nagamune, I. E. Ch 42, Nano/Micro Biotechnology. Advances in Biochemical Engineering Biotechnology. 119, 63-78 (2010).
- Van Dyk, T. K., et al. Rapid and sensitive pollutant detection by induction of heat shock gene-bioluminescence gene fusions. Appl Environ Microbiol. 60 (5), 1414-1420 (1994).
- Park, M., Tsai, S. L., Chen, W. Microbial biosensors: engineered microorganisms as the sensing machinery. Sensors. 13 (5), 5777-5795 (2013).
- Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
- Lin-Gibson, S., et al. Synthesis and characterization of PEG dimethacrylates and their hydrogels. Biomacromolecules. 5 (4), 1280-1287 (2004).
- Majima, T., Schnabel, W., Weber, W. Phenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylphosphinates as Water-Soluble Photoinitiators – Generation and Reactivity of O=P(C6h5)(O-) Radical-Anions. Makromol Chem. 192 (10), 2307-2315 (1991).
- Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. Electrophoresis. 31 (1), 2-16 (2010).
- DiPilato, L. M., Cheng, X., Zhang, J. Fluorescent indicators of cAMP and Epac activation reveal differential dynamics of cAMP signaling within discrete subcellular compartments. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (47), 16513-16518 (2004).
- Occhetta, P., et al. Fabrication of 3D cell-laden hydrogel microstructures through photo-mold patterning. Biofabrication. 5 (3), 035002 (2013).
- Kubow, K. E., et al. Crosslinking of cell-derived 3D scaffolds up-regulates the stretching and unfolding of new extracellular matrix assembled by reseeded cells. Integr. Biol. 1 (11-12), 635-648 (2009).
- Legant, W. R., Chen, C. S., Vogel, V. Force-induced fibronectin assembly and matrix remodeling in a 3D microtissue model of tissue morphogenesis. Integr. Biol. 4 (10), 1164-1174 (2012).
- Cameron, A. R., Frith, J. E., Gomez, G. A., Yap, A. S., Cooper-White, J. J. The effect of time-dependent deformation of viscoelastic hydrogels on myogenic induction and Rac1 activity in mesenchymal stem cells. Biomaterials. 35 (6), 1857-1868 (2014).
- Kong, H. J., Polte, T. R., Alsberg, E., Mooney, D. J. FRET measurements of cell-traction forces and nano-scale clustering of adhesion ligands varied by substrate stiffness. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (12), 4300-4305 (2005).
- Poehler, E., et al. Microchamber arrays with an integrated long luminescence lifetime pH sensor. Anal. Biochem. , 1-9 (2015).
- Son, K. J., Shin, D. S., Kwa, T., Gao, Y., Revzin, A. Micropatterned Sensing Hydrogels Integrated with Reconfigurable Microfluidics for Detecting Protease Release from Cells. Anal. Chem. 85 (24), 11893-11901 (2013).
- Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human Neutrophil Elastase Responsive Delivery from Poly(ethylene glycol) Hydrogels. Biomacromolecules. 10 (6), 1484-1489 (2009).
- Grieshaber, S. E., Jha, A. K., Farran, A. J. E., Jia, X., Burdick, J. A., Mauck, R. L. . Biomaterials for Tissue Engineering Applications: A Review of the Past and Future Trends, Ch 2. , 9-46 (2011).
- Chiu, Y. C., Brey, E., Pérez-Luna, V. A Study of the Intrinsic Autofluorescence of Poly (ethylene glycol)-co (L -Lactic acid) Diacrylate. J. Fluoresc. 22 (3), 907-913 (2012).
- Dewitt, D. D., Kaszuba, S. N., Thompson, D. M., Stegemann, J. P. Collagen I-Matrigel Scaffolds for Enhanced Schwann Cell Survival and Control of Three-Dimensional Cell Morphology. Tissue Eng., Part A. 15 (10), 2785-2793 (2009).
- Taboas, J. M., Tuan, R. S., Hudson, S. D. Bioreactor device, and method and system for fabricating tissues in the bioreactor device. United States patent. , (2014).
- Fedorovich, N. E., et al. The effect of photopolymerization on stem cells embedded in hydrogels. Biomaterials. 30 (3), 344-353 (2009).
- Vandame, P., et al. Optimization of ERK activity biosensors for both ratiometric and lifetime FRET measurements. Sensors. 14 (1), 1140-1154 (2013).
- Ponsioen, B., et al. Detecting cAMP-induced Epac activation by fluorescence resonance energy transfer: Epac as a novel cAMP indicator. EMBO Rep. 5 (12), 1176-1180 (2004).
- Klarenbeek, J. B., Goedhart, J., Hink, M. A., Gadella, T. W., Jalink, K. A mTurquoise-based cAMP sensor for both FLIM and ratiometric read-out has improved dynamic range. PLoS ONE. 6 (4), e19170 (2011).
- Chen, Y., Periasamy, A. Intensity range based quantitative FRET data analysis to localize protein molecules in live cell nuclei. J. Fluoresc. 16 (1), 95-104 (2006).
