FRET成像的三维水凝胶

1.材料准备通过根据由林Gibson 等 29中所述的方法methacrylating聚乙二醇制备聚乙二醇二甲基（PEGDM，4000兆瓦）。可替代地，PEGDM可以购买。 合成光引发剂，锂苯基-2,4,6- trimethylbenzoylphosphinate（LAP），通过一个两步过程，其中第一二甲基苯基亚与2,4,6-三甲基氯化物经由米歇尔 – 阿尔布佐夫反应，然后将锂盐反应由在2-丁酮中添加溴化锂，按照间岛等人的30创建的。 注：另外，其他光引发剂可以购买，但LAP表现出更好的生物相容性和交联效率31。 官能化的玻璃盖玻片，以使水凝胶的粘合至玻璃，从而防止在成像期间移动。 在化学罩与适当的个人防护装备，利用根据制造商的PC的凝胶和环氧硅烷（3-环氧丙氧基丙基）为TR-凝胶31协议3-（三甲氧基硅）丙基甲基丙烯酸酯。注：另外，预涂幻灯片可以购买。注意，该盖玻片必须比在步骤3.8与PDMS培养皿的孔大。 2.细胞转染在组织培养罩，并使用无菌技术，解冻和板在亚汇合的期望的细胞（50 – 70％），在此牛软骨细胞以15,000细胞/ cm 2在6孔未处理培养皿。注意：任何相关的细胞类型可以被使用，包括锚独立细胞。 允许细胞一天在培养箱中在37℃恢复。后续的步骤之前，除去培养基，用PBS冲洗，每孔加2ml苯酚和无血清培养基。 每个第二天均匀，加入苯酚和无血清培养基中的100微升以及3微升转染试剂到一个蒸压玻璃试管。搭配，轻轻摇动管。孵育在室温下5分钟。限制任何曝光。 加入1微克FRET探针DNA，轻轻摇动。孵育混合物在RT和避光进行30分钟。 注：在这个实验中ICUE1质粒使用（金章博士33提供）。在ICUE1的荧光团青色荧光蛋白（CFP，供体）和黄色荧光蛋白（YFP，受体）。转染试剂的质粒DNA中的比例将需要为不同类型的细胞的最佳转染调整。 分发制备的混合物（〜104微升）逐滴向每个含有细胞加2毫升苯酚和无血清培养基的6孔中。不要吸管向上和向下。轻轻地摇晃板混合。 孵育在37℃下48小时。注：抑制会合转染效率并改变受体的内源表达。 3.制作PDMS压模铸件水凝胶与文化要准备一大杯幻灯片投射的聚二甲基硅氧烷（PDMS）上，用肥皂先清洁玻璃，冲洗用丰富量的水，然后用异丙醇接着风干。 用硅化试剂根据制造商的协议处理的玻璃，以使PDMS可固化后可以容易地剥离。冲洗残留的试剂与甲苯通过集水容器表面。使表面与空气完全晾干后方可或使用热在100℃，以缩短等待时间。 选择的水凝胶高度（ 例如 ，1毫米）和计算的PDMS的1.2倍体积需要覆盖用玻璃载片和水凝胶的高度的尺寸，该厚度的PDMS中的载玻片。注：PDMS不缩水。 混合PDMS试剂盒组分以10：在一烧杯1的比例（重量）。一旦混合均匀，放置室内真空脱气下的烧杯中。相对ieve真空气泡是否开始溢出容器和重复。 注：其他水凝胶的厚度可以被使用，但在增加的背景的成本，如果离心分离（步骤6.2），不使用增加透明度。 包裹铝箔基地周围和玻璃的侧面以包含PDMS。小心倾脱气PDMS所需量到该玻璃由箔包围。测量PDMS高度。请注意，所述PDMS的高度将是在水凝胶的最大高度。如果浇筑时创建任何气泡，再脱气或用压舌板或针弹出他们。 放置在水平表面上的未固化的PDMS在烘箱中于100℃进行2小时，或在室温下保留24小时。 一旦固化小心地从表面去除PDMS。切出的凝胶所需的形状（ 例如 ，3毫米的圆柱形冲）。 注：光交联将产生稍窄PC胶缸比由于模具直径由分子中的氧的PDMS反应淬火。 消毒打了个PDMS。对于短期实验，浸没在70％的乙醇的PDMS 1小时。 由无菌的PDMS基底的厚度相匹配的显微镜物镜校正的无菌玻璃盖玻片嵌合组装模具。抛开在第6步使用。 制造使用上述方法（具有比水凝胶以及更宽，更高），以含有水凝胶和介质更大的PDMS菜。容纳中等音量比水凝胶浸泡水凝胶，并尽量减少分析物稀释至少10倍以上。 4.水凝胶前体溶液的制备在组织培养罩，并用无菌技术，立即加入细胞前准备水​​凝胶前体解决方案，适用于研究。从聚合物前体制备的PC-凝胶如下。 混合PEGDM粉末到磷酸盐缓冲的盐水（PBS，pH7.2）中在10％（重量/体积）。 为0.005的终浓度添加光引发剂（ 例如，LAP） – 0.01％（重量/体积），并通过移液混合。从灯罩用铝箔或屏蔽的溶液，作为LAP对光敏感。 注意：在这里使用的TR-凝胶减少的生长因子的细胞外基质如由制造商提供。 5.水凝胶解决方案细胞悬浮在组织培养罩，并使用无菌技术，吸从孔的介质。 加入PBS的孔中，然后取出彻底的冲洗附着细胞单层。 使用每细胞解离溶液为25cm 2 2至3ml培养底物解离的细胞。轻轻摇动，然后在37℃孵育10 – 20分钟或直到分离。坚决挖掘菜如有必要，打跑细胞。 注：备用细胞分离解决方案可与选择仅限于那些没有我通过裂解的兴趣受体MPACT所分析的信号传导途径。 将细胞脱离后，加2ml苯酚和无血清培养基中，悬浮细胞，并计数细胞与血球。注：经化学定义的无血清培养基（ 例如 ，补充有胰岛素，转铁蛋白和硒）也可使用。 等分根据该信元类型到无菌小瓶中并沉淀（ 例如，每小瓶2.0×10 6个细胞）的细胞所需的号码。 除去上清液，添加水凝胶前体的所需体积并通过移液悬浮细胞。使用前体的体积可视化水凝胶的z轴时作为折叠，将产生2×10 5个细胞/ cm 2在xy平面（ 例如 1.0毫升，每小瓶含2×10 6个细胞1mm厚的水凝胶/ ml）中。注意不要产生气泡。 迅速转移到下一步骤，以限制对细胞活力34的负面影响</ SUP>。 6.水凝胶制剂在组织培养罩，并使用无菌技术，将含细胞的水凝胶的前体添加到在步骤3中制备的铸造模具（ 例如 ，每3毫米直径×1mm的高模7.1微升）。创建一个额外的水凝胶，根据​​所描述的相同的方法，以用于显微镜成像系统的校准和探头校准（如果固有探针效率是未知的）。 离心机制备的水凝胶前体凝胶化之前/交联通过限制细胞到单个焦平面并减少平面外的信号，以优化成像含细胞（ 图1）。调整离心时间和力的前体（400克4分钟）的细胞类型和粘度。 凝胶或交联解决方案为PC-凝胶的水凝胶，照射用UV-A光源（λ= 365纳米），用于曝光时间等于所述含细胞的前体为3.2J ​​/ cm 2的每毫米厚度photocrosslink。 注：在计算使用1毫米的最小厚度。暴露应该倒在1-5分范围内。用最小的曝光时间。避免过度照射细胞，因为这会降低活力和漂白CFP供体。然而，不推荐使用的曝光时间60小于是因为高强度辐射导致自由基的自猝灭和差细胞活力。 对于TR-凝胶的水凝胶，将填充的模具在培养皿并移至孵化器进行热胶凝。孵育在37℃下30分钟。 胶凝或交联水凝胶后，取出PDMS水凝胶铸造模具，并与准备较大的PDMS菜（从步骤3.5）替换它。按PDMS下来到玻璃用无菌抹刀坚持它。 放置此PDMS盖玻片到无菌容器中，菜如培养皿。添加含酚的无血清培养基或化学成分确定的我dium（无血清培养基补充有胰岛素，转铁蛋白和硒（步骤5.4））与井与PDMS菜和盖玻片保持浸渍水凝胶创建。孵育在37℃下30分钟。 注意：如果使用一个专门的菜盖玻片，然后将盖玻片在同样添加网上平台。 交替，FRET成像之前执行该步骤中一天以允许探针以回收作为照射波长与CFP施主激发光谱重叠。 7.三维成像FRET 与从培养皿的水凝胶，在步骤6.4制备除去PDMS皿中，在用于在XY显微镜阶段（ 图2）可调节的试样夹持器固定。在显微镜舞台样品夹的位置。如果需要，应用油的目标。使用的至少40X和高数值孔径（NA）的物镜（ 即 ，1.3的NA）来捕获相对较弱的荧光体Ë排放。 配置的角度进行图像采集领域（视场）：选择单元格使用透射光成像成像和验证与荧光成像转染。选择的至少15个不同的细胞。 选择单元既不是太亮，也不太暗（其否则可能导致探针过饱和或低灵敏度）中，用0.0和1.0之间的FRET比率（否则指示损坏或二进制探针的衰减）。然后关掉灯，以限制曝光。 接近水凝胶的中心和带的相对平坦的照明场中感兴趣的细胞中选择视场（参见图3B和下面的步骤9.2）。 配置的FRET图像通道相机设置。附近的FOV的中心的少数细胞中进行选择，优化了“光学配置”（ 即 ，曝光和每个图像通道增益）。 注意：下面的命名有所不同，取决于不克，以用于操作显微镜和照相机的软件。显微镜软件NIS元素，在这里用于图像采集和分析。 对于单链探针FRET分析，选择每FOV两个图像通道：淬火发射（QE），这是根据在接受激励（AEM）捐助激发和受体发射的供体发射。 注意：对于ICUE1 CFP-YFP探头，CFP激发和发射滤波器对量化宽松政策（418 – 442前，458 – 482 EM）和YFP激发和发射一对AEM（490 – 510前，520 – 550 EM）被使用。 设置QE和AEM收购不饱和的最大信号强度曝光（如果使用的是CCD，具有最小可能的增益），以尽量减少背景噪音。保持光学配置相同的两个荧光团和整个实验，以及实验组，以避免施力的结果（ 即，激发功率，虹膜的大小，曝光和照相机增益）之间（ 图URE 3A）。 获得额外的图像通道，以便收购后更多的分析选项（ 例如，纠正致敏发射（CSE）成像（见讨论））。对于ICUE1 CFP-YFP探头，获得激励（防爆）和Ex 供体发射（EM）通道-电磁体 （QE，选择CFP-CFP在显微镜软件），前供体 – 受体 EM（SE，CFP-选择YFP），前受体 – EM 受体 （AEM，选择YFP-YFP），和Ex 受体 – EM 体 （YFP-CFP）配置（参见图3A）。 配置时间推移图像采集的捕获率。 降低捕获率，如果受限于硬件。短期分析（ 如，30 – 60分钟），表示每分钟12左右收购的每个FOV（5秒的采样率）来捕获信号动力学。使用所需的最低采样率，以避免显ficantly漂白探头。 通过在显微镜软件键入捕获的周期性设置采集速率。长期试验（ 例如 ，24小时），以高获取速率开始捕捉初始脉冲响应，然后切换到一个低的采集速率， 例如，每5至10分钟。 请在显微镜软件“立即运行”以启动图像采集，采集图像5分钟建立在指定的视场探测响应的基准。 在所需的激动剂或拮抗剂的分析物5分钟图像采集，吸管的（ 例如，毛喉素在100nM）后，通过移液混合，并继续成像。 8. FRET校准系统校准：如在步骤6中所述使用额外的校准的水凝胶，制造，使用相同的视场的标准，光学配置和相机集获得至少6代表细胞AEM图像吊环用于FRET成像以上（步骤7.1，7.2，和7.3）。 注意：需要用于“绝对”FRET分析，但不为“亲属”FRET为组合探针和显微镜成像系统的量子产率和光谱灵敏度（QS）的定量。 通过在全强度（上AEM通道激发）选择一个5分钟长时间暴露在激发光光漂白的受体荧光团。使用较小的光圈漂白的利息只有细胞。验证AEM信号比原始信号低至少10％的前和漂白后的信号强度直方图（“LUT”窗口）进行比较。继续漂白如果信号损失小于90％。 注意：确保通过使用不与供体激发光谱重叠AEM激发滤光片的供体荧光团在此过程中不漂白。 获取供体发射下捐助激励与现在漂白受体荧光（DEM）美国ING相同的光学配置，在步骤7.3 QE。 计算每个像素QS作为民主党背景校正后由AEM划分，如下面第9节。 QS =民主党/ AEM 计算平均的QS从蜂窝平均值的小区中。 估计使用校准样品探头（EI）的固有的FRET效率。诱发探头的最大FRET并计算荣= 1 – QE /（AEM x质量得分），如下第9条。或者，使用荣= CSE / AEM，荣或使用FRET效率荣= 1的常规检测端点计算 – （QE / DEM）。 注意：Ei的需要量化激活探针（FAP， 即 ，探针结合分析物的级分）的绝对值部分，但没有必要为“亲属”FRET分析。 通过浸透分析物的生产/激活的探针与分析物相互作用后增加FRET激动剂刺激文化探测响应。 抑制探头interactioÑ​​使用该结合后的分析物中的FRET减少探针信令的拮抗剂的分析物。注意：在ICUE1探针的情况下，与腺苷酸环化酶抑制剂例如2'抑制cAMP水平，5'-二脱氧腺苷（特定）或3-异丁基甲基黄嘌呤（非特异性）。 9. FRET比的计算绘制和指定的每视场的感兴趣的细胞来定义每个视场随时间背景水平（ 图3B）附近的一个区域，但限制在ROI相对均匀的照明的区域在图像的中心（ 图4A ）。见讨论为背景校正选项的说明。 用显微镜软件：在“后台ROI图标”选择箭头，然后选择“绘制椭圆背景的投资回报率”（其他形状将工作）。确保“不断更新的背景偏移”被选中。激活争夺通过单击背景ROI图标背景的投资回报率的翅膀。或者，用“投资回报率图标”并设置为“使用为背景的投资回报率”和“投资回报在每个不同的多”的投资回报率的特性。 随着ImageJ的：使用工具栏选择圆形绘图工具。然后通过菜单中的形状添加到投资回报率经理“分析→工具→投资回报率经理”。如果需要设置不同的颜色在ROI管理背景的投资回报率。 对于每一个FOV和图像通道（ 例如，QE和AEM），减去每个时间点的背景ROI内的平均值为每个频道建立一个校正的图像， 例如，SQE T，P = QE T，P – BQE T，P其中t是采集时间，p为在FOV（ 即，XY位置），和BQE和BAEM是背景的ROI内的信号的标量值。使用软件中的可用图像运算功能。 W¯¯第i个显微镜软件，使用“投资回报率的背景图标”，然后选择“扣除背景使用的投资回报率。”在弹出的窗口中，选择“在扣除背景的投资回报率”下的“每一个形象”，并选择在“应用到”“所有画面”。 注：背景的投资回报率必须在每个视场被定义为这个功能正常工作（ 例如 ，功能不能正常减去背景的FOV背景的投资回报，如果一些FOV有不确定的背景的ROI）。 随着ImageJ的，使用由迈克尔Cammer编写的宏（http://microscopynotes.com/imagej/macros/）中的“从投资回报率BG减法”。 通过选择“保存为”用于以下分析步骤保存校正时间序列图像。 定义使用为每个视场（ 图4B）下分析每个小区的二进制掩模的小区周围的ROI。使用AEM通道阈值，每个视场图像在启动OF中的实验，发现细胞的边界，明确的投资回报。保存的投资回报。 用显微镜软件：对于每一帧（ 即 FOV），先使用菜单中的“二进制→定义阈值”，选择“应用到当前帧”。调整下限阈值来选择细胞。然后使用“二进制→关闭”功能，如果有必要填补漏洞的二进制掩码。接下来使用ROI图标，选择“复制二进制到投资回报率”;二进制层被自动删除。 追加的投资回报为后续帧的ROI的现有池。删除任何杂散的投资回报。接下来的投资回报“右击”，并确保它们的性质“用作标准的投资回报率”和“投资回报在每个不同的多”。 随着ImageJ的：对于每一个FOV，首先使用菜单“图像→调整→阈值”。然后使用“分析→分析粒子”与显示轮廓和添加到选定的经理。使用如有必要，“二进制→关闭”，以填补“漏洞”中的二进制掩码。删除虚假的投资回报。免费插件可自动执行此过程。 计算在每个像素的基础QE FRET比率，SQE / SAEM相对分析（见步骤10）和E QE = SQE /（QS点¯xSAEM），用于在步骤8.1获得的绝对分析（见步骤10）QS。使用图像的浮点除法。请参阅比推导的解释，讨论部分。 用显微镜软件：使用菜单“图像→图像操作”，然后选择“浮点型”。 随着ImageJ的：请使用“处理→图像计算器”功能或“Calculator_Plus.java”插件。注意：可替换地，宏“pH_ratioMacro符”.txt“可以适于以计算的FRET比率它采用上述的背景校正宏和提供的。 导出每个细胞的平均比值（即每ROI）到电子表格和图形软件。 用显微镜软件：在“投资回报率统计”分析控制或者在“时间分析”分析控制“电子表格导出”按钮，请使用ND导出按钮。 随着ImageJ的：首先选择菜单“分析→设置测量”，并选择确定“平均值”和“标准差”。然后使用ROI管理器并选择按钮“测量”。保存生成的结果窗口。 10. FRET比率分析从每个细胞的平均比率计算随时间的平均蜂窝FRET比率（步骤9.4导出）。考虑基线在该计算（施用分析物前的比率）FRET比率。 注：电子表格和图形软件在这里用来绘制基线subtr行事平均FRET比率和使用上的基线的线性回归的平均（SEM）的标准错误，如步骤10.1.2和10.1.3以下（ 图5和6）。 相对分析（响应的幅度）：规范化每个曲线到公共参考样品（ 例如 ，未处理的样品）。 绝对分析（响应的时间过程）：由归其基线每条曲线移曲线到公共起点FRET比率。 在电子表格和图形软件，交织数据与新列，使得每个原始列以仅包含比数据为基准期的新列配对（每单元平均比列）（比前加分析）。选择“插入列”数据的每个列后插入一个空列。然后基线数据复制到配对空列。 在电子表格和图形软件，选择“插入→新建→分析TRANSFORM删除基准“，然后设置”选择列“，以”隔“，选择”假设基准线是线性的“，并选择”差异计算“下的”“。 计算平均细胞比率和描述性统计。在电子表格和图形软件，选择“插入→新建→分析分析XY行→意味着SD或SEM”，然后选择“行与SEM手段”，在弹出的窗口。