Méthyl-liaison par capture d'ADN de séquençage pour les tissus du patient
Summary
Nous présentons ici un protocole pour enquêter sur génome large méthylation de l'ADN dans les études de patients cliniques à grande échelle de dépistage en utilisant le séquençage de l'ADN méthyl-Binding Capture (MBDCap-seq ou MBD-seq) la technologie et de la bioinformatique ultérieures analyse pipeline.
Abstract
La méthylation est l'une des modifications épigénétiques essentielles à l'ADN, qui est responsable de la régulation précise des gènes nécessaires à un développement stable et la différenciation des différents types de tissus. Dysrégulation de ce procédé est souvent la caractéristique de diverses maladies telles que le cancer. Ici, nous présentons l'une des techniques de séquençage récents, Methyl-Binding séquençage d'ADN de capture (MBDCap-seq), utilisé pour quantifier la méthylation dans divers tissus normaux et pathologiques pour les grandes cohortes de patients. Nous décrivons un protocole détaillé de cette approche d'enrichissement d'affinité avec un pipeline de bioinformatique pour obtenir une quantification optimale. Cette technique a été utilisée pour séquencer des centaines de patients à travers divers types de cancer comme une partie du projet de méthylome 1000 (Système méthylome Cancer).
Introduction
La régulation épigénétique de gènes par méthylation de l' ADN est l' un des mécanismes essentiels nécessaires pour déterminer le sort de la cellule par la différenciation stable de différents types de tissus dans le corps 1. Dysrégulation de ce processus a été connu pour causer diverses maladies , dont le cancer 2.
Ce procédé implique essentiellement l'addition de groupes méthyle sur le résidu cytosine dans les dinucléotides CpG d'ADN 3. Il y a quelques différentes techniques actuellement utilisées pour étudier ce mécanisme, chacun ayant ses propres avantages , comme indiqué dans de nombreuses études 2-8. Ici, nous allons discuter de l'une de ces techniques appelées Methyl-Binding séquençage d'ADN de capture (MBDCap-seq), où nous utilisons une technique d'enrichissement d'affinité pour identifier les régions méthylés de l'ADN. Cette technique se fonde sur la capacité de méthyle de liaison de la protéine MBD2 pour enrichir les fragments d'ADN génomique contenant des sites CpG méthylés. Nous utilisons un kit d'enrichissement de l'ADN méthylé commercialpour l'isolement de ces régions méthylées. Notre laboratoire a examiné des centaines d'échantillons de patients avec cette technique et ici nous fournir un protocole optimisé complet, qui peut être utilisée pour étudier les grandes cohortes de patients.
Comme on le voit avec toute technologie de séquençage de nouvelle génération, MBDCap-seq exige également une approche bioinformatique spécifiques afin de quantifier avec précision les niveaux de méthylation dans les échantillons. Il y a eu de nombreuses études récentes dans le but d'optimiser le processus des données de séquençage 9, 10 normalisation et d' analyse. Dans ce protocole, nous démontrons une de ces méthodes de mise en œuvre d'une approche unique de récupération de lecture – LONUT – suivie par la normalisation linéaire de chaque échantillon afin de permettre des comparaisons impartiales à travers un grand nombre d'échantillons de patients.
Protocol
Representative Results
Discussion
La technique MBDCap-seq est une approche d'enrichissement d'affinité 3, considéré comme une alternative rentable lors d' enquêtes sur des cohortes avec un grand nombre de patients 15. Le pipeline présenté ici décrit une approche globale de l'échantillon achats à l'analyse et l'interprétation des données. L'une des étapes les plus importantes est la mise en place d'une procédure d'amplification par PCR pour améliorer l'efficacité de la PCR des régions du GC enrichi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le travail est soutenu par CPRIT Research Training Award RP140105, ainsi que partiellement pris en charge par les Instituts américains nationaux de la santé (NIH) des subventions R01 GM114142 et par la Fondation William et Ella Owens Medical Research.
Materials
| Methylminer DNA enrichment Kit | Invitrogen | ME10025 | |
| Dynabeads M-280 Streptavidin | Invitrogen | 112-05D | |
| Bioruptor Plus Sonication Device | diagenode | B01020001 | |
| 3M sodium acetate pH 5.2 | Sigma | S7899 | 100ml |
| SPRIworks Fragment Library System I | Beckman Coulter | A50100 | Fully automated library construction system |
| Adapter Primers | Bioo Scientific | 514104 | PCR primer mix |
| Qubit | Invitrogen | Q32854 | Fluorometric Quantitation System |
| PCR master mix | KAPA scientific | KK2621 | PCR master mix |
| AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | PCR Purification beads |
| EB Buffer | Qiagen | 19086 | |
| HiSeq 2000 Sequencing System | Illumina |
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