Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration

Adrienne C. Greene; Darryl Y. Sasaki; George D. Bachand

doi:10.3791/54051

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

生物工程

Jel destekli rehidrasyon kullanma Dev boyutlu Polymersomes Şekillendirme

Published: May 26, 2016

doi:

10.3791/54051

Adrienne C. Greene¹, Darryl Y. Sasaki², George D. Bachand¹

¹Center for Integrated Nanotechnologies,Sandia National Laboratories, ²Biological and Engineering Sciences,Sandia National Laboratories

Summary

We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

Abstract

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (> 4 µm) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (>4 µm) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (>100 µm).

Introduction

Sentetik hücre büyüklüğünde, dev tek katmanlı veziküller (GUVs) oluşturulması yapay hücre gibi sistem ^1,2 nesil için bir çerçeve oluşturmak için farklı hücresel süreçleri in vitro yeniden ilgi artmaktadır. lipid zarlar oluşan GUVs doğal biyolojik zarların çok taklit olsa da, çevresel dalgalanmalara karşı stabil değildir ve oldukça kısa bir raf ömrüne sahiptir. Bu sınırlamalar nedeniyle, amfifilik blok kopolimerleri polimer kesecikler veya polymersomes oluşturulması için yağ taklit olarak kullanılmıştır. ⁸ ^– Bu kapsamda, polymersomes nedeniyle artan istikrar ^3, kimyasal yönlülük ^4,5 ve değiştirilebilir fiziksel özellikleri ⁶ biomimetic hücre sistemlerinin geliştirilmesi avantajlıdır.

Mevcut yöntemler, dev-ebatlı polymersomes electroformation ⁹ ve şablonu rehidrasyon ¹⁰ w iki meydana getirmek üzerehich zaman alıcı, emek-yoğun, uzman gerektiren ekipman ve bozulmamış dev polymersomes düşük verim üretmek. Basit bir jel destekli rehidrasyon yöntemi son zamanlarda lipit GUVs ¹¹ üretimi için geliştirilmiştir. Burada, dev değişen polimer bileşimleri ile polymersomes, kontrollü boyutu ve çeşitli tampon kompozisyonlar oluşturmak için jel destekli rehidrasyon tekniğinin bir uyarlamasını açıklar.

Kısaca, standart DNA jel elektroforezi agaroz filmleri ağırlık / hacim% 1, bir cam lamel üzerine kurutulur. kloroform içinde hazırlanan polimer çözeltiler, daha sonra susuz agaroz film boyunca yayılmış ve buharlaşmaya bırakılır. Tam çözücü çıkarıldıktan sonra, polimer filmler boyutlu polymersomes 30 dakika içinde oluşturulmuş orta derecede ısıtma (40-70 ° C) ve dev (> 4 mm) ile seçim tampon maddesi içinde yeniden ıslatılmıştır. Bu yöntem hızla standart laboratuar ekipmanları ve REAGEN kullanarak tamamen sağlam, iyi biçimlendirilmiş polymersomes yüzlerce üretirasgari maliyetle ts.

Jel destekli rehidrasyon yöntemi gösteren Şekil 1 şematik. Bir diblok kopolimer oluşan Dev polymersomes rehidrasyon ~ 30 dakika sonra oluşturulur. Hidrofil blok macenta olarak gösterilir ve hidrofobik blok yeşil gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Protocol

1. Polimer ve agaroz hazırlanması Not: Eldiven ve bir laboratuvar önlüğü, bu protokol boyunca her zaman giyilmelidir. Koruyucu gözlük aynı şekilde herhangi bir organik çözücü veya olası sıçramasına ile herhangi bir adımla çalışması sırasında ihtiyaç vardır. kloroform içinde polimerin 5 mg / ml çözelti hazırlayın. B poli (bütadien) (PEO-PBD EO 22 -bd 37) tam olarak çözülmesi için bir cam şişe ve girdap diblok kopolimer – katı poli (etilen oksit) 5 mg kloroform 1 ml ilave edilir. Bir kimyasal davlumbaz kloroform kullanılarak tüm adımları uygulayın. 99.5 mol% 'si etiketlenmemiş polimerin bir% 0.5 mol nihai konsantrasyonda, bir flüoresan işaretli sfingosin (satın önce kloroform içinde çözülmüş) ilave edin. Örneğin, pipet 0 ° nihai konsantrasyonu için 997,58 ul PEO-PBD, EO (2.950 Dalton'luk bir molekül ağırlığına sahip), kloroform içinde 22 -bd 37 polimer içine kloroform içinde bir 1 mg / ml floresan işaretli sfingosin 12 ul.İşaretli sfmgosin karıştırılır% 5 mol ve 99.5 mol% 'si polimeri. -20 ° C'de, bir kloroform-dirençli kapak ile hava geçirmez bir şişe içinde mağazası çözeltisi. Şişe kenarında tesisatçı bandı sarın nerede flakon üzerine kapak vidaları ve flakon kapağı sabitleyin. Kapağın dış tesisatçı bant başka bir parça sarın ve nihayet en az buharlaşma sağlamak için bant dışına Parafilm sarın. 250 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi içinde 50 ml su (ya da 50 mi, 100 mM sükroz) içinde 0.5 mg, standart agaroz karıştırılarak bir% 1 w / v agaroz çözeltisi olun. Yaklaşık 1 dakika boyunca, standart mikrodalga agaroz kaynatıp (çözeltinin temizleme tarafından belirtildiği gibi ya da tamamen çözünene kadar). Not: Agaroz çözeltinin soğutulması bir kaç dakika sonra veya kullanılmış katılaşmaya bırakılır, depolanır ve aynı yöntem kullanılarak, erimiş tekrar edilebilir. 2. Agaroz Film Hazırlanması tıkanmasını önlemek için 1000 ul pipet kapalı ucunu kesin. kesme ucu kullanarak, pipet 3doğrudan üreticiden 25 mm kare cam lamel üzerine eritilmiş agaroz çözüm 00 ul. Agaroz ~ 65-75 ° C öncesinde çökelmeye soğumaya izin ver. Agaroz çok serin ise, yayılma sürecinde yüzeyde gelme başlayacaktır. Agaroz çok sıcak ise tersine, yüzeye agaroz uyması yayılıyor fazla gerektirecektir. eldivenli parmakları ile lamel sadece kenarından tutun ve eşit lamel yüzeyi boyunca agaroz yaymak için bir 1000 ul pipet uzun kenarını kullanın. Agaroz tamamen yapışır ve lamel kapakları kadar ileri ve geri lamel üzerinde pipet hareket ettirin. Agaroz yukarı bakacak şekilde Parafilm bir parça üzerine agaroz kaplı lamel yerleştirin. lamelleri istenen sayıda kaplanmış sonra en az 1 saat süre ile yüzeyi üzerine agaroz kurutmak için 37 ° C inkübatör içine lamelleri ile Parafilm yerleştirin. Not: DehidrasyonAgaroz görebilir tabakası ortadan kaybolması ile belirlenir; lamel düz ve net görünmelidir. filmler tamamen susuz olduğunda, mağaza agaroz yüzeyi tek kullanımlık plastik Petri kabındaki yukarı bakacak şekilde lamelleri. 3. Polimer film formasyonu Pipet 30 ul agaroz film üzerine polimer çözeltisi hazırlanır. eldivenli parmakları ile lamel sadece kenarından tutun ve dairesel yayma hareketi kullanılarak agaroz filmler arasında çözüm yaymak için bir 18 G iğne uzun kenarını kullanın. Çözelti buharlaştırıldı kadar yayılan devam edin. Not: iğnenin keskin ucunun dikkatli olun. yukarı bakacak şekilde, bir plastik Petri tabağı polimer tarafında polimer filmleri yerleştirin ve alüminyum folyo ile kaplı bir standart bir ev vakum desikatörde petri tabak koyun tam olarak herhangi bir kalan solventin çıkması için en az 1 saat boyunca (işaretli sfingosin photobleaching önlemek için). Pol 4. oluşumuymersomes Bir coverwell uyun ya ev yapımı polidimetilsiloksan (PDMS) de (orta ± 1 cm çaplı tedavi PDMS bir ~ 0.5 cm kalınlığında bir blok zımbalanarak) ya da bir polimer film ile kaplı lamel de ticari olarak temin edilebilir. sıkı bir mühür coverwell ve kapak arasında oluşana kadar yukarı bakacak şekilde polimer ile polimer kaplı lamel üzerine hafifçe coverwell basın. çok fazla bastırmayın ve lamel kırmak için dikkatli olun. odası için 200-500 ul rehidratasyon çözüm (su iyi, ama tamponlar veya medya içeren bir dizi de çalışır) ekleyin (rehidrasyon hacminin yapışık coverwell boyutuna bağlıdır). rehidrasyon solüsyonu buharlaşmasını azaltmak için bir rutubet gözünün oluşturun. cam bir Petri tabağına kenarları boyunca bir rulo ıslak Kimwipe yerleştirin. nem odası içine yapıştırılmış coverwell polimer filmi koyun ve bir kapak ile kapatın. photobleaching en aza indirmek için alüminyum folyo ile Petri kabı örtün. yersıcak bir plaka üzerinde Petri kabı, en az 30 dakika boyunca 40 ° C olarak ayarlandı. Ayarlamak için 24-70 ° C arasında oluşan veziküllerin (Şekil 5) büyüklüğü rehidrasyon boyunca sıcak plaka sıcaklığı ayarlayın. Dikkatli kullanılması gerektiğini, böylece bu sıcaklıkta ötesine geçmeden zaman 70 ° C agaroz Tm yakındır. Photobleaching sonra Floresan Kurtarma tarafından Polymersomes 5. Karakterizasyonu (sıkı bağlamak) görüntüleme için bir ters mikroskop coverwell doğrudan yapıştırılmış olan lamel hareket ettirin. Polimer çözümü dahil floresan lipid dayalı uygun filtre kümesi seçin. Rodamin etiketli lipitlerin polimer çözeltileri halinde katkılı, bir 560/25 nm uyarılma filtreli ve 607/36 nm emisyon filtre veya benzer filtre kümesi kullanın. polymersomes yapıştırılacağı lamel üst yüzeyi üzerinde odaklanmak için 100X yağ amacı kullanın. polymersomes özellikle isenizbüyük (> 20 mm) ya da bir polimer film çok kalın ise, düşük bir güç hedef (örneğin, 40X) daha polymersomes görselleştirmek için kullanılmalıdır. floresan mikroskobu kullanarak polymersomes tanımlayın. çapı> 5 mikron ile karakteristik içi boş, küresel vezikül tarafından polymersomes belirleyin. ayarlanabilir bir kondenser içeren bir floresan mikroskop (sıkı bağlamak) photobleaching sonra floresan kurtarma kullanarak membran akışkanlığını karakterize eder. Nedeniyle yapışık doğa ve yüzeylerde polymersomes sıkı ambalaj, polymersomes doğal hareket sıkı bağlamak görüntüleme kalitesini artırmak, sınırlıdır. ilgi polymersome üzerinde mikroskop odaklanın. küçük bir bölgeye kondansatör kapatıp polymersome kenar ilgi görüntüleme bölgesi içinde olduğundan emin olun. Kamera artırmak ve tüm nötral yoğunluk filtreleri etkili bir ilgi bölgeyi photobleach kaldırılır emin olun. Membran fl izin 30-60 saniye ya da floresan yoğunluğu önemli ölçüde azalmıştır kadar photobleach için yoğunluk uorescence. Lambayı kapatın ve tam kondansatörü açın. Başlangıç ayarlarına geri poz azaltmak ve 3 dakika boyunca görüntüleri her 30 saniyede yakalayan hemen başlar. Standart yöntemler 12 kullanılarak membran difüzyon katsayılarını hesaplayın. ağartılmış bölgesi 3-5 dakika içinde flüoresan yoğunluğu kavuşur, bu membran sıvı olduğunu göstermektedir. Polymersome Boyutu 6. karakterizasyonu . Görüntüleme yazılımı kullanılarak polymersomes boyutu analizi için 6. Süreci Şekil Adım-adım oluşturduğu veziküllerin çapını ölçmek yönergeler. Kullanıcı kullanılan mikroskop piksel / mikron kalibrasyon birimlerini bilmeniz gerekir.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Görüntü analiz yazılımı 13 polymersomes kazanılmış görüntüleri açın. açılır her analiz kutusu ve tıklayarak "Set skalası" üzerine tıklayarak resmin ölçeği ayarlayın. Standart yöntemler kullanılarak mikroskop (yani, bir mikrometre) için ölçek kalibre. Kalibrasyon birimlerinde doldurun ve "Tamam" a tıklayın. hat alet kutusuna tıklayın ve bir kesecik çapını kapsayan bir çizgi çizin. açılan her analiz kutuya tıklayarak ve "ölçü" tıklayarak uzunluk ölçümleri toplayın. Yukarıdaki prosedür ve ölçümler veri penceresine eklenecek her yeni ölçüm aşağıdaki bireysel veziküller ölçme devam edin. Her satırı çizim ve üzerine çizilen çizgiyi diziye uzunluğu ölçüldükten sonra "Ctrl + D"Görüntü daha kolay veziküller analiz edildiği izlemek için yapım.

Representative Results

Polymersomes (Şekil 1) ve Şekil 2 'de gösterilen genel laboratuar ekipmanı, yukarıdaki prosedür izlenerek oluşturuldu. Polymersomes iyonu giderilmiş su (Şekil 3) ile yeniden ıslatılmıştır ve 100X yağ objektif kullanarak Epifloresans bir ters mikroskop görüntülenmiştir. polymersomes görünür değilse, bir 100X petrol amacı ile yakalamak için çok büyük boyutlarda oluşmuş olabileceğini unutmayın; Daha düşük güç hedefi yerine kullanılacak gerekebilir. Jel destekli rehidrasyon kullanılarak avantajlarından biri rehidrasyon çözümleri çeşitli polymersomes oluşturabilirler yönlülük olup. Polymersomes başarılı iyonu giderilmiş su, tam bir memeli hücre kültürü ortamı, Şekil 4'te gösterildiği gibi, şeker çözeltisinin iki fizyolojik olarak ilgili tampon çözeltileri (fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ya da Tris-tamponlu tuzlu su (TBS)) olarak oluşturulmuştur., Standart koşullar altında, (rehidrasyon1 saat boyunca 40 ° C) su ile, daha büyük 70 ° den polymersomes tipik bakış 40 x 40 um 2. alan başına bulunur. polymersomes yüzey üretimi homojen olmasa da, bu temsilci verimi görüş alanlarının düzinelerce vardır. Ayrıca, polymersomes en az 24 saat boyunca çözelti içinde stabil idi. Polymersomes boyutu kolayca değişen sıcaklıklarda polimer filmler rehidrasyon ile ayarlandı. Oda sıcaklığında deiyonize su içinde oluşturulan Polymersomes 2.9 ± 0.7 um arasında bir ortalama çapa sahiptir. Rehidrasyon sırasında sıcaklık arttıkça, polymersomes ortalama boyutu (Tablo 1) artar. Yüksek sıcaklıklarda (> 60 ° C), boyutları ile oluşturulan polymersomes da daha büyük 100 um (Şekil 5). Tüm görüntü işleme açık kaynak görüntüleme yazılımı (Şekil 6) kullanılarak tamamlanmıştır.Toplanan Görüntüler yazılım programında açılmıştır. kalibre piksel boyutu ayarlamak ölçek kutusu içine girildi. satırı aracını kullanarak, çizgiler çapları arasında çizildi. Her bir çizgi çizilir sonra, kalibre uzunluğu ölçülmüş ve sonuçlar kutusuna eklendi. Veriler daha sonra seçim (örneğin, Excel, Prizma, Origin, vb) matematiksel yazılımda çizilebilir . Polymersomes oluşumu için gerekli olan istenen ürün yaygın ve ucuz bir laboratuar malzeme Şekil 2. Şekil şunlardır: Parafilm, kloroform veya başka bir uygun çözücü içinde bir 18.5 G iğne, polimer, 1,000 ul pipet, bir Erlenmeyer şişesi, cımbız, agaroz, 25 mm kare lamelleri, PDMS görüntüleme kuyuları ve cam Petri. için tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek. Jel destekli rehidrasyon yönteminin Şekil 3. Resimler. Agaroz Çözünmüş eşit filmi kat tüm lamel kadar 25 mm kare lamel yayılır. Lameller, sonra 37 ° C inkübatör içine yerleştirilir ve film kurutulmuştur. Bir polimer çözeltisi susuz agaroz film üzerine yatırılır ve dairesel hareketlerle bir iğne kullanılarak yayılır. Lamel sonra bir kurutucu O'da / N tamamen herhangi bir çözücü artıkları buharlaşmaya yer almaktadır. Son olarak, ve görüntüleme odası yüzeye yapıştırılır ve polimerler 40 ° C polymersomes oluşumuna izin vermek için en az 25 dk seçim solüsyonu ile rehidrate ve bir Petri kabı içine yerleştirilir. Bu büyük halini görmek için tıklayınız rakam. </p> Şekil 4. Polymersomes farklı tamponlar, çeşitli meydana gelebilir. PEO-PBD polimer filmler, 1 saat boyunca 40 ° C 'de gösterilen tampon maddesi ile rehidre edildi. Ölçek çubuğu = 10 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Rehidrasyon boyunca sıcaklığı arttırmak Şekil 5. polymersomes boyutunu artırır. Belirtilen rehidrasyon sıcaklıklarda su içinde oluşturulan polymersomes temsili epifluorışıma ve görüntüler. Daha büyük polymersomes sıcaklık sonucu artırılması. Ölçek çubuğu 10 mikron =."_blank> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. Sıcaklık (° C) Ortalama Boy (um) 24 2.93 ± 0.7 40 5.76 ± 2.5 50 6.65 ± 2.4 60 11.46 ± 5.8 70 14.04 ± 7.0 Tablo 1. hesaplandı farklı sıcaklık koşulu başına su içinde 100'den büyük polymersomes için. Ortalama çapları artmış polymersome boyutu rehidrasyon sonuçları sırasında sıcaklığının artırılması ve burada tasvir edilmektedir. Hata standart sapmadır.

Discussion

Polymersomes yaygın biyolojik zar taklit olarak ele hale gelmektedir. polimerlerin sağlam ve çok yönlü özellikler membran fonksiyonelleşmesine, uzun ömür ve ayarlı yanıt gerektiren çalışmalar için onları yaygın çekici hale getiriyor. Dev boyutlu polymersomes ^9,10 (> 4 mm) oluşturulması için geleneksel yöntemler, emek yoğun ve pahalı ve özel ekipman gerektirmektedir. Burada, ilk kez, standart ucuz laboratuvar reaktifler ve ekipman kullanılarak dev boyutlu polymersomes oluşturulması için hızlı, çok yönlü ve sağlam yöntem sunuyoruz.

Jel destekli rehidrasyon kullanılarak, tek katmanlı polymersomes hızlı oluşturulabilir (<30 dakika), (hücre kültür ortamı da dahil olmak üzere), rehidrasyon çözümleri çeşitli ve farklı polimerlerin çeşitli (veriler gösterilmemiştir). çok katmanlı veya asimetrik kesecikler bu teknik kullanılarak gözlenmedi. B poli (- Bu çalışma boyunca, poli (etilen oksit) kullanılırbütadien) (PEO-PBD EO ₂₂ -bd ₃₇₎ nötr iki bloklu kopolimer. (Yüklü diblok kopolimerler de dahil olmak üzere), çok sayıda, farklı polimer bileşimleri de bu yöntemi (gösterilmemiştir) ile çalışır. Bununla birlikte, bazı ticari olarak temin edilebilen üç-bloklu kopolimerleri ve yüksek molekül ağırlıklı iki bloklu kopolimerler (~> 5000 Dalton) farklı polymersomes oluşturmazlar. Bu yazının deney tüm etiketli lipid konsantrasyonu düşük görselleştirme amaçlı polimer çözeltileri içine katkılı edildi. doğrudan bir floresan boya ile işlevselleştirilmiş polimerler dahil olmak üzere, görüntüleme için diğer yöntemler de kullanılabilir. floresan mikroskopi daha fazla çözünürlük sağlar olsa Polymersomes aynı şekilde, parlak bir alan mikroskobu ile görüntülenebilir.

protokole en küçük değişiklikler genellikle sonuçları değiştirmez. Örneğin, kapak slipleri üzerine yayılır polimer çözeltisinin konsantrasyonu küçük farklar, polimer f oluşumunu değiştirmeyenilm kurdu. Tam konsantrasyon aralığı saptanabilir değildi, polymersome oluşumu başarılı polimer film konsantrasyonları (örneğin, 1-10 mg / ml) geniş bir yelpazesi ile ortaya çıkar. Ancak, olumsuz polymersome oluşumunu etkiler bazı protokol değişiklikler vardır. En önemli polymersomes çok kötü oluşumunda sonucu (yerine kare) o yuvarlak cam lamelleri olduğunu. Biz aslında polymersomes oluşumunu engelleyen camına agaroz son derece bile kaplamak için bu bağlıyorlar.

Bu yöntemin en önemli güçlüklerden biri, yüksek bir verimle yüzeyinden polymersomes yeniden değerlendirilmesi performansını sağlamasıdır. Orijinal yüzeyinden polymersomes kaldırarak avantajlı olabilir ki belirli durumlar vardır. Nedeniyle susuz polimer filmden yüksek eşiğe, bireysel polymersomes kaldırarak ve görüntüleme kalitesi ve karakterizasyonu artıracak lamelleri temizlemek için onları yapışan (parti için) Sıkı bağlamak analiz sırasında tamamen uzun ömürlü. (Geri kazanılan veziküllerin, ilk olarak oluşan önemli ölçüde daha düşük olmasına rağmen) uç yüzeyinden polymersomes desorbe olacak kesilmiş olduğu bir pipet ile bu nazik pipetleme yapmak için. Polymersomes sonra polymersome yeni lamel ile etkileşim sağlayan, Modifiye edilmiş lamel yüzeylerine yerleştirilebilir. 15 dakika polymersomes görüntüleme için yüzeye aşağı düşmesine izin için Tipik olarak, nötr PEO-PBD polymersomes için, ozon ile tedavi lamelleri. Farklı yüzey modifikasyonu, farklı polymersome bileşimlerinde (örneğin, negatif ya da pozitif polimerleri yüklü) için gereklidir.

Bu protokolde kullanılan birçok malzeme başarılı bir şekilde depolanır ve günler, haftalar boyunca kullanılır. katılaşmış agaroz yeniden kaynatılan ve agaroz bile kaynadıktan sonra agrega yaşamaya başlar, ya da katılaşmış agaroz kurumaya başlayana kadar tekrar edilebilir. kurutulmuş agaroz filmler ile lamelleri saklanabilir ve kullanım edilebilir(örneğin, ay) süresiz d. Kloroform içinde çözülmüş bir polimer birkaç ay boyunca -20 ° C 'de muhafaza edilebilir. polimer film agaroz filmler üzerinde kurutulur sonra, ancak, filmler iki hafta içinde (daha uzun süreli depolama doğrudan belirlenir etmediğini ev tipi vakum altında saklanır ve kullanılması gerekir, ancak polimer filmler üzerinden iki oluşan polymersomes göze çarpan bir fark vardır hafta).

Burada sunulan jel destekli rehidrasyon protokolünü kullanarak, muntazam şekilli polymersomes yüzlerce standart donanım ve ucuz laboratuvar reaktifleri kullanılarak emeğin sadece birkaç saat hızla oluşur. Ayrıca, polymersomes fizyolojik tampon çözeltilerin çeşitli ve farklı polimer bileşimleri (şekilde gösterilmemiştir) oluşturulabilir. Yönteme küçük değişiklikler ile negatif bir bilim jel destekli tekrar nemlendirme çok yönlü ve erişilebilir teknik işleme, polymersomes oluşumunu değiştirmeyen teknik e değişenXPERTISE.

Kolayca hücrelerinin boyutu ölçekte dev polymersomes oluşturma yeteneği yapay hücre benzeri sistemler oluşturmak için gereklidir. Bu polymersomes yapmak için jel destekli rehidrasyon kullanımı ve çok yönlülük kolaylığı sağlam hücre zarı taklit oluşturulması için biomimetic alanında büyük bir ilerleme vardır. Örneğin, bu teknik kullanılarak, farklı hücre içi bileşenleri, hücre zar proteinleri ve membran taşıma proteinlerinin dahil edilmesi ile polimerin işlevsellik, kapsüllenmesi için stratejiler sadece birkaç isim polymersome bazlı yapay hücreleri oluşturmak için tasarlanabilir.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to gratefully acknowledge Dr. Ian M. Henderson, Andrew Gomez and Dr. Walter F. Paxton for their technical expertise, advice and help in this work. This work was supported by the U.S. Department of Energy, Office of Basic Energy Sciences, Division of Materials Sciences and Engineering (BES-MSE). ACG, DYS and GDB were supported by BES-MSE. This work was performed, in part, at the Center for Integrated Nanotechnologies, an Office of Science User Facility operated for the U.S. Department of Energy (DOE) Office of Science (user project number RA2015A0004, PI: ACG).

Materials

125 mL Erlenmeyer flask	VWR	89000-360
18 guage needle	VWR	BD-305196
25 mm square coverslips	VWR	48366-089
Agarose	Sigma	A9539	A standard agarose for DNA gel electrophoresis
Chloroform	Sigma	288306-2L
Commerical coverwell	Electron Microscopy Sciences	70336	Press-to-Seal Silicone Isolators
Fiji Image Analysis Software	ImageJ		Free Download: http://fiji.sc/Fiji
Glass vial with Teflon Lid	VWR	66009-556	1.9mL capacity, case of 144
Liss-rhodamine B PE Lipid	Avanti Polar Lipids	810150C	1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform
Parafilm	VWR	52858-000	10.2 cm x 38.1 m
poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940)	Polymer Source	P2904-BdEO	http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf
Pastic Petri Dish	VWR	25384-092
Teflon tape	VWR	300001-057	1/2" width

References

Streicher, P., et al. Integrin reconstituted in GUVs: A biomimetic system to study initial steps of cell spreading. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (10), 2291-2300 (2009).
Paxton, W., Bouxsein, N. F., Henderson, I., Gomez, A., Bachand, G. Dynamic Assembly of Polymer Nanotube Networks via Kinesin Powered Microtubule Filaments. Nanoscale. , (2015).
Bermudez, H., Brannan, A. K., Hammer, D. a., Bates, F. S., Discher, D. E. Molecular weight dependence of polymersome membrane structure, elasticity, and stability. Macromolecules. 35 (21), 8203-8208 (2002).
Amos, R. C., Nazemi, A., Bonduelle, C. V., Gillies, E. R. Tuning polymersome surfaces: functionalization with dendritic groups. Soft Matter. 8 (21), 5947-5958 (2012).
Egli, S., et al. Biocompatible functionalization of polymersome surfaces: A new approach to surface immobilization and cell targeting using polymersomes. J. Am. Chem. Soc. 133 (12), 4476-4483 (2011).
Kim, K. T., Cornelissen, J. J. L. M., Nolte, R. J. M., Van Hest, J. C. M. A polymersome nanoreactor with controllable permeability induced by stimuli-responsive block copolymers. Adv. Mater. 21 (27), 2787-2791 (2009).
Paxton, W. F., Price, D., Richardson, N. J. Hydroxide ion flux and pH-gradient driven ester hydrolysis in polymer vesicle reactors. Soft Matter. 9, 11295-11302 (2013).
Henderson, I. M., Paxton, W. F. Salt, shake, fuse – Giant hybrid polymer/lipid vesicles through mechanically activated fusion. Angew. Chem. Int. Ed. 53 (13), 3372-3376 (2014).
Discher, B. M. Polymersomes: Tough Vesicles Made from Diblock Copolymers. Science. 284 (5417), 1143-1146 (1999).
Howse, J. R., et al. Templated formation of giant polymer vesicles with controlled size distributions. Nat Mat. 8 (6), 507-511 (2009).
Horger, K. S., Estes, D. J., Capone, R., Mayer, M. Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength Films of Agarose Enable Rapid Formation of Giant Liposomes in Solutions of Physiologic Ionic Strength. J. Am. Chem. Soc. , 1-24 (2009).
Axelrod, D., Koppel, D. E., Schlessinger, J., Elson, E., Webb, W. W. Mobility measurement by analysis of fluorescence photobleaching recovery kinetics. Biophys. J. 16 (9), 1055-1069 (1976).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat meth. 9 (7), 676-682 (2012).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Greene, A. C., Sasaki, D. Y., Bachand, G. D. Forming Giant-sized Polymersomes Using Gel-assisted Rehydration. J. Vis. Exp. (111), e54051, doi:10.3791/54051 (2016).