ジェル支援補水を使用した巨大なサイズのポリマーソームを形成します

1.ポリマーおよびアガロースの準備注意：手袋と白衣は、このプロトコルを通じて常に着用します。安全ゴーグルは、同様に、任意の有機溶媒または可能飛散を持つ任意の段階での作業時に必要とされています。 クロロホルム中のポリマーの5 mg / mlで溶液を調製します。 B-ポリ（ブタジエン）（PEO-PBD、EO 22 -BD 37）が完全に溶解するガラスバイアルと旋回中のジブロック共重合体-固体のポリ（エチレンオキシド）の5 mgのクロロホルム1ミリリットルを追加します。化学ドラフト内でクロロホルムを使用して、すべての手順を実行します。 99.5モル％、非標識ポリマー中に0.5モル％の最終濃度で蛍光標識された脂質（購入済みクロロホルムに溶解）で混ぜます。 例えば、ピペット〜0の最終濃度は997.58μlのPEO-PBD、EO（2950ダルトンの分子量を有する）のクロロホルム22 -BD 37ポリマー中へのクロロホルム中1mg / mlの蛍光標識脂質の12μlの。標識された脂質を混合し5モル％、99.5モル％の重合体。 -20℃でクロロホルム耐性蓋付きの気密バイアルに保管ソリューション。ここで、蓋のネジバイアルへのバイアルエッジで配管工のテープを巻き、バイアルに蓋を固定します。蓋の外側に配管工のテープの別の部分をラップし、最終的には最小限の蒸発を確実にするために、テープの外側にパラフィルムをラップします。 250ミリリットルの三角フラスコに50mlの水（または50ミリリットルの100mMスクロース）に0.5 mgの標準アガロースを混合することにより、1％w / vのアガロース溶液を作ります。 〜1分間の標準的な電子レンジでアガロース溶液を沸騰させる（または溶液のクリアで述べたように完全に溶解するまで）。 注：アガロース溶液を冷却し、数分後に使用されるか、または固化させ、記憶されていると同様の手順を使用して再溶解することができます。 2.アガロースフィルムの調製目詰まりを防ぐために千μlのピペットチップのオフの端をカットします。切断されたチップを用いて、ピペット3メーカーから直接25ミリメートル角のガラスカバースリップ上に溶融アガロース溶液の00μlの。 アガロースが堆積前にへ〜65-75℃に冷却させます。アガロースはあまりにもクールであれば、それは拡散プロセスの間に表面に凝集を開始します。アガロースは熱すぎる場合は逆に、それはより多くの表面にアガロースを接着するために拡散が必要になります。 手袋をした指でカバースリップのちょうど端を持ち、カバーガラスの表面に均等にアガロースを広めるために、別の千μlのピペットチップの長辺を使用しています。アガロースが完全に付着し、カバースリップを覆うまで前後にカバースリップ全体のピペットチップを移動します。 アガロースを上に向けてパラフィルム片の上にアガロースでコーティングされたカバースリップを置きます。カバースリップの所望の数がコーティングされた後、少なくとも1時間、表面にアガロースを脱水し、37℃のインキュベーターにカバースリップでパラフィルムを配置します。 注：脱水アガロースの可視層の消失によって決定されます。カバーガラスは平坦で明確になります。フィルムは完全に脱水した後、店はアガロース表面は使い捨てプラスチックペトリ皿に上に向けてカバースリップ。 3.ポリマーフィルムの形成ピペット30μlをアガロースフィルム上にポリマー溶液を調製しました。 手袋をした指でカバースリップのちょうど端を持ち、円形の拡散運動を用いてアガロースフィルム全体のソリューションを広めるために18 G針の長辺を使用しています。溶液が蒸発するまで広がり続けます。 注意：針の尖端に注意してください。 上向きにプラスチックシャーレポリマー側のポリマーフィルムを配置し、アルミホイルで覆われた標準的な家の真空デシケーターにシャーレを入れ、完全に任意の残留溶媒を除去するために少なくとも1時間（ラベルされた脂質の光退色を防ぐため）。 ポルの4の形成ymersomes coverwellを接着、いずれかの自家製ポリジメチルシロキサン（PDMS）もポリマーフィルムでコーティングしたカバーガラスによく（〜ミドルの〜1cmの直径を有する硬化PDMS 0.5cmの厚さのブロックを打ち抜い）または市販の。タイトなシールがcoverwellとカバーガラスとの間に形成されるまで上向きにポリマーを有するポリマーでコーティングされたカバースリップ上にそっとcoverwellを押します。あまりにもハードキーを押しますと、カバーガラスを壊さないように注意してください。 室への200から500μlの再水和溶液（水は大丈夫ですが、バッファやマスコミの配列も動作します）を追加します（再水和量を付着coverwellのサイズに依存）。 再水和溶液の蒸発を減少させるために湿度室を作成します。ガラスシャーレの縁に沿って巻かれ、湿ったキムワイプを置きます。湿度チャンバー内に付着しcoverwellを有するポリマーフィルムを置き、蓋をカバーしています。光退色を最小限に抑えるためにアルミホイルでペトリ皿をカバーしています。場所ホットプレート上にペトリ皿は、少なくとも30分間、40℃に設定してください。 （ 図5）が形成された小胞のサイズ24から70°Cから調整するために再水和の間にホットプレートの温度を調整します。この温度を超えて進むときに注意を使用する必要がありますので、70°Cは、アガロースのT mの近くにあります。 光退色後蛍光回復によりポリマーソームの5キャラクタリゼーション（FRAP） イメージングのための倒立顕微鏡に直接接着coverwellでカバースリップを移動します。 ポリマー溶液中に含まれる蛍光脂質に基づいて適切なフィルタセットを選択します。ローダミン標識脂質はポリマー溶液にドープするために、25分の560 nmの励起フィルターと36分の607 nmの発光フィルター、または同等のフィルターセットを使用しています。 ポリマーソームが付着されるカバーガラスの上面に集中する100Xの油浸対物レンズを使用してください。ポリマーソームは特にしている場合大きな（>20μM）または高分子フィルムが厚すぎると、低電力の目的（ 例えば、40倍）は、より良いポリマーソームを可視化するために使用されるべきです。 蛍光顕微鏡を用いて、ポリマーソームを識別します。 > 5μmの直径を有する特徴的な中空の球状ベシクルによってポリマーソームを識別します。 調節可能なコンデンサーを含む蛍光顕微鏡で（FRAP）を光退色後蛍光回復を使用して、膜流動性を特徴づけます。付着自然と基板上のポリマーソームのタイトな梱包に、ポリマーソームの自然な動きは、FRAPイメージング品質を高めること、制限されています。 興味のあるポリマーソームに顕微鏡の焦点を合わせます。小さな領域にコンデンサーを閉じ、ポリマーソームのエッジが関心の撮像領域内にあることを確認してください。 カメラの露出を増やして、すべてのNDフィルターを効果的に関心領域を光退色するために除去されていることを確認します。膜FLを許可します 30〜60秒、または蛍光強度が有意に減少するまで、光退色するuorescence強度。 ランプの電源を切り、完全にコンデンサーを開きます。バック開始の設定への曝露を減少させ、すぐに画像を3分間、30秒ごとのキャプチャを開始。 標準的な方法12を使用して膜の拡散係数を計算します。漂白領域は3-5分以内に蛍光強度を回復する場合、これは、膜が液体であることを示しています。 ポリマーソームサイズの6キャラクタリゼーション イメージングソフトウェアを使用して、ポリマーソームのサイズ分析のために、図6のプロセス。ステップバイステップの形成された小胞の直径を測定する方法について説明します。ユーザーが使用する顕微鏡のピクセル/μm単位のキャリブレーションユニットを知っている必要があります。ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "ターゲット=" _空白 ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 画像解析ソフト13にポリマーソームの取得された画像を開きます。 ボックスとクリック」セットのスケールを「ドロップダウン分析をクリックすることで、画像のスケールを設定します。 標準的な方法を用いて顕微鏡（ すなわち、マイクロメートル）のスケールを調整します。 キャリブレーション単位で入力し、「OK」をクリックします。 ラインツールボックスをクリックして、小胞の直径にまたがる線を引きます。 ボックスとクリック」対策を」ドロップダウン分析をクリックすることで、長さの測定を収集します。 上記の手順と測定データウィンドウに追加されるそれぞれの新しい測定以下の個別の小胞を測定し続けます。 各ラインを引き、上に引かれた線をインプリントするために長さを測定した後を押して "Ctrlキー+ D"画像は、簡単に分析された小胞を追跡すること。