形成用凝胶辅助补液巨型的聚合物囊泡

1.聚合物和琼脂糖准备注：手套和白大褂在任何时候都应在本协议佩戴。护目镜与任何有机溶剂或可能飞溅任何一步工作中同样需要。 制备在氯仿中的5mg / ml的聚合物溶液。 1毫升氯仿添加至5mg固体聚（环氧乙烷）的- B-聚（丁二烯）（PEO-PBD，EO 22 -BD 37）在玻璃小瓶中并涡旋充分溶解二嵌段共聚物。执行化学通风柜用氯仿所有步骤。 在99.5％（摩尔）未标记的聚合物的0.5％（摩尔）的最终浓度混合在荧光标记的脂质（购已经溶解在氯仿）。 例如，吸管〜12微升的氯仿1毫克/毫升的荧光标记的脂质成997.58微升的PEO-PBD，EO 22 -BD 37聚合物的氯仿（与2950道尔顿的分子量）为0的最终浓度。5摩尔％标记的脂质混合，99.5摩尔％的聚合物。 与在-20℃的耐氯仿 – 盖密封的管形​​瓶中商店溶液。裹在瓶边缘水管工的磁带，其中盖子拧在小瓶中并固定盖子小瓶。包裹在盖的外侧另一块管道工胶带的最后缠绕在带的外封口膜，以确保最小的蒸发。 通过在250毫升锥形瓶中的50毫升水（或者50μL的100mM蔗糖）中混合0.5毫克标准的琼脂糖制成1％w / v琼脂糖溶液。沸腾在标准微波〜1分钟的琼脂糖溶液（或直至完全溶解作为由溶液的结算说明）。 注意：琼脂糖溶液可以冷却几分钟后使用，或者使其固化，储存和使用相同的过程再次熔化。 2.琼脂糖膜的制备切到底掀起了1000微升枪头，以防止堵塞。使用切尖，吸管300微升融化的琼脂糖溶液到25平方毫米的玻璃直接从制造商盖玻片。 允许琼脂糖冷却至65-75〜℃下之前沉积。如果琼脂糖太酷了，就开始在传播过程中表面上聚集。相反，如果琼脂糖太热，这将需要更多的扩频粘附琼脂糖到表面。 持用戴手套的手指盖玻片只是边缘，并使用另一个1000微升枪头的长边均匀地横跨盖玻片的表面上扩散的琼脂糖。移动枪头来回盖玻片直到琼脂糖完全附着并覆盖盖玻片。 放置琼脂糖涂覆盖玻片到一张封口膜的与琼脂糖朝上。一旦盖玻片所需数量的涂覆，放置封口膜与盖玻片成37℃培养箱脱水琼脂糖到表面上至少1小时。 注：脱水通过琼脂糖的可见层的消失来确定;盖玻片应看平，清晰。一旦电影完全脱水，储存与琼脂糖面朝上的一次性塑料培养皿盖玻片。 3.高分子成膜吸移管将30μl制备的聚合物溶液到琼脂糖膜。 持用戴手套的手指盖玻片只是边缘并使用18G的针的长边跨使用圆形扩频运动琼脂糖膜散布溶液。继续传播，直到溶液蒸发。 注意：请小心针的尖底的。 放置在一个塑料培养皿聚合物面朝上的聚合物膜，并把培养皿成覆盖铝箔标准室内真空干燥器（防止标记的脂质的漂白）至少1小时，以完全除去任何残留的溶剂。 4.波尔的形成ymersomes 坚持一个coverwell，无论是自制聚二甲基硅氧烷（PDMS）以及（与中间的约1cm直径固化的PDMS的约0.5厘米厚的块冲压出）或市售很好地涂覆有聚合物膜的盖玻片。轻轻按下coverwell到朝上直到紧密密封在coverwell和盖玻片之间形成的聚合物的聚合物涂覆的盖玻片。要小心，不要太用力按下，打破盖玻片。 添加200-500微升补液溶液（水是好的，但缓冲剂或媒体的阵列也作品）至腔室（补液体积取决于附着在coverwell的大小）。 创建一个湿度室以降低补液溶液的蒸发。放置沿着玻璃培养皿的边缘的轧制，湿的Kimwipe。与附着coverwell聚合物薄膜放入湿度室中，并用盖子覆盖。盖培养皿用铝箔，以尽量减少漂白。地点培养皿上热板设定为40℃至少30分钟。 从24-70℃，调整加热板的再水化过程中的温度来调整所形成的小泡（ 图5）的大小。 70℃继续超出这个温度时，靠近琼脂糖的Tm 值所以应谨慎使用。 5.漂白后表征荧光恢复聚合物囊泡（FRAP） 移动盖玻片与附着coverwell直接到达摄像倒置显微镜。 选择基于包含在聚合物溶液中的荧光脂质适当滤波器集合。罗丹明标记的脂质掺杂到聚合物溶液中，使用一个二十五分之五百六十零激发滤光器和三十六分之六百零七nm发射滤波器，或类似过滤器组。 用100X油物镜聚焦，其中聚合物囊泡将附着在盖玻片的顶表面上。如果聚合物囊泡特别大（> 20微米），或者如果聚合物膜太厚，较低功率的目标（ 例如，40X）应该被用于更好地可视化的聚合物囊泡。 识别使用荧光显微镜的聚合物囊泡。由特性中空，球形囊泡直径> 5微米的识别聚合物囊泡。 表征利用荧光恢复细胞膜的流动性含有一个可调节冷凝器的荧光显微镜漂白（FRAP）之后。由于附着的性质和基材聚合物囊泡严密包装，聚合物囊泡的自然运动是有限的，增加FRAP成像质量。 专注于感兴趣的聚合物囊泡显微镜。关闭冷凝器的小区域，并确保一个聚合物囊泡的边缘是感兴趣的成像区域内。 增加相机曝光，并确保所有的中性密度过滤器除去以有效光漂白的感兴趣的区域。允许膜FL荧光强度光漂白30-60秒或直至荧光强度显著降低。 关闭灯泡并完全打开冷凝器。减少曝光回到起始设置立即开始捕获图像，每30秒3分钟。 计算使用标准方法12膜扩散系数。如果漂白区域重新获得3-5分钟内的荧光强度，这表明该膜是流体。 6.表征聚合物囊泡尺寸 图6.使用映像软件的聚合物囊泡的大小分析过程。一步一步如何测量形成的小泡的直径指令。用户必须知道使用的显微镜​​的像素/微米的校准单元。ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。 打开聚合物囊泡的所获取的图像中的图像分析软件13。 通过点击分析下拉框，并在点击“设置规模”设置为图像的规模。 校准刻度使用标准方法显微镜（即微米）。 填写校验台，并单击“确定”。 点击在线工具盒，画一条线跨越泡的直径。 通过点击分析下拉框，并点击“测量”收集长度测量。 继续测量遵循上面的程序和每一个新的测量将被添加到测量数据窗口个别囊泡。 按“Ctrl + D”绘制每一行，并测量长度，印画上线后，图像使其更容易追踪这些囊泡进行了分析。