פיתוח מודל כבד אתנול-induced fibrotic דג הזברה ללמוד ובתאים בתיווך תא התחדשות Hepatocyte
Summary
Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.
Abstract
Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.
Introduction
למרות יכולת ההתחדשות המרשימה של hepatocytes 1, שהם סוג תא parenchymal העיקרי של הכבד, אי ספיקת כבד כרונית פוגעת ביכולת הזאת, מה שמובילה תאים ובתאים בכבדים (HPC) התחדשות תלויה 2.
נזק כבד כרונית נגזרת בעיקר שימוש לרעה באלכוהול, וירוס הפטיטיס C כרונית (HCV) 3 ו מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD) 4. זה מוביל פיברוזיס כבד מתמשך, אשר מזוהה עם ההצטברות של תאי מטריקס חלבונים (ECM). מתמיד הצטברות ECM מעווה אדריכלות כבדה ללא פגעה על ידי יצירת רקמת צלקתית סיבית 5, לאחר מכן וכתוצאה מכך שחם עם תחלואה ותמותה גבוהות. ניסיונות רבים נעשו כדי למתן את התגובה fibrotic בעיקר על ידי התמקדות מעכב ציטוקינים profibrogenic והופעל myofibroblasts 6. האחרון נגזר בעיקר מתאי stellate כבדים (Hגיל), התאים הלא parenchymal הכבד עקרון אחראי צלקת בכבד היווצרות 4. אף על פי כן, טיפולי משובי מעודדי מקורות הסלולר אנדוגני כולל HPCs להתחדש hepatocytes בנוכחות עלבונות fibrogenic מתמשכים מחכים לחקירה נוספת.
דגמים ניסיוניים רבים סיסטיק הכבד תוארו ביונקים. הזרקה חוזרת ונשנית של פחמן טטרא (CCL 4) כבר בשימוש נרחב כדי לגרום פיברוזיס כבד מודלים בעכברים וחולדה 7. בשילוב עם תזונה עתירת שומן (HF), אלכוהול הובילה upregulation משמעותית של ביטוי גנים profibrogenic ואת הכבד סיסטיק 8. בעוד steatosis (הצטברות שומנים בדם) הנובעת מחשיפת אלכוהול חריפה, זה הופך את הכבד רגיש פציעה בכבד חמורה יותר 9.
דג הזברה, Danio rerio, התפתחה כמערכת מודל חוליות יסולא בפז ללימוד התחדשות. למרותחוליות אחרות תחתונות כגון סלמנדרות ויש axolotls יכולת מרשימה לרגנרציה הדג הזברה יש יתרונות על פני מערכות מודל אחרות לגבי אסטרטגיות מניפולציה וויזואליזציה גנים הדרושים לביצוע מניפולצית משובי פוטנציאל גורמי 10. דג הזברה גם מייצג מודל חוליות אטרקטיבי ללימוד מחלת כבד אלכוהולית (ALD) פשוט על ידי הוספת אתנול (EtOH) למים שלהם. חשיפה אקוטית EtOH כדי דג הזברה הזחל והבוגר שנגרם steatosis בכבד 11-13. כאשר דג זברה מבוגר זכתה לחשיפת EtOH מורחבת, בתצהיר קולגן נצפה עם גברת ביטוי של גנים הקשורים סיסטיק 14. עם זאת, קיים צורך בפיתוח מודלים ללמוד התחדשות כבדה בתגובת EtOH כגירוי fibrogenic.
לאחרונה, פיתחנו מודל הכבד fibrotic הנגרמת EtOH דג הזברה 15. שילבנו מערכת אבלציה הגנטי הספציפי hepatocyte עם טיפול EtOH ב הזחל adulדג הזברה t. יצרנו שני קווים מהונדסים, Tg (fabp10a: CFP-NTR) Gt1 ו Tg (fabp10a: mCherry-NTR) GT2, שבו nitroreductase E.coli (NTR) הם התמזגו ציאן חלבון פלואורסצנטי mCherry, בהתאמה, בשליטה של חומצת השומן ספציפי hepatocyte מחייבת 10a חלבון, אמרגן בסיסי כבד (fabp10a). במערכת זו, NTR ממירה metronidazole prodrug רעילה (MTZ) לתוך סוכן ה- DNA בין-גדיל מקשרים צולב 16, גרימת מוות מפורש של hepatocytes. באמצעות מודל זה, הראינו כי אוכלוסייה של תאים כבדים, אשר מגיבים Notch signaling, מומר hepatocytes בהעדר ליד של hepatocytes וב העודף ECM. אנחנו המיועד תאים אלה HPCs. יתר על כן, באמצעות מסכים כימיים, זיהינו activators מולקולה הקטן של איתות Wnt ומעכבים של איתות Notch שמרחיב התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic. Therefoמחדש, המודל הכבד fibrotic שלנו דג הזברה מייצג מערכת סינון הכימי מעולה בהשוואה לתא ביותר בתרבות או מערכת סינון מבוסס יונקים. זוהי מערכה in vivo עם עלות משמעותית והטבות לחיסכון בזמן. כאן אנו מתארים את ההליכים המפורטים להקמת מודל כבד fibrotic נגרם EtOH ועל ביצוע מסכים כימיים באמצעות מודל זה דג זברה. יתר על כן, ניתוחי מנות הזמן בוצעו כדי לחקור כיצד hepatocyte התחדשות מתרחש בכבד fibrotic. פרוטוקול זה יספק כלי רב ערך כדי לחקור את המנגנונים ואסטרטגיות של שיפור התחדשות hepatocyte בכבד fibrotic.
Protocol
Representative Results
Discussion
צפינו התחדשות hepatocyte בתיווך HPC ב EtOH / MTZ שטופלו כבדי מחלים, דבר המצביע על כך אפילו בנוכחות של כמות משמעותית של חלבונים ECM כולל סוג סיבי לי קולגן, HPCs לשמור וכשירותו להתחדש כמו hepatocytes. הטיפול בלבד MTZ לא להגדיל בתצהיר של חלבוני ECM משמעותי, ואילו הטיפול רק EtOH לא לגרום HPC הפעלת <sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי תרומות של GTEC (2731336 ו 1411318), ה- NIH (K01DK081351), ואת NSF (1,354,837) כדי CHS אנו מודים Alem גיורגיס לקריאה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75×25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresent microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
- Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
- Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
- Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
- Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
- Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
- Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
- Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective ‘pacemaker’ current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
- Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
- Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
- Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
- Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
- Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
- Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
- Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).
