تطوير متليفة الكبد نموذج الناجم عن الإيثانول في الزرد لدراسة السلف بوساطة الخلايا الكبدية التجديد
Summary
Sustained fibrosis with deposition of excessive extracellular matrix proteins leads to cirrhosis. Alcohol abuse is one of the main causes of severe liver disease. We established an ethanol-induced zebrafish fibrotic liver model to study the mechanisms and strategies of promoting hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury.
Abstract
Sustained liver fibrosis with continuation of extracellular matrix (ECM) protein build-up results in the loss of cellular competency of the liver, leading to cirrhosis with hepatocellular dysfunction. Among multiple hepatic insults, alcohol abuse can lead to significant health problems including liver failure and hepatocellular carcinoma. Nonetheless, the identity of endogenous cellular sources that regenerate hepatocytes in response to alcohol has not been properly investigated. Moreover, few studies have effectively modeled hepatocyte regeneration upon alcohol-induced injury. We recently reported on establishing an ethanol (EtOH)-induced fibrotic liver model in zebrafish in which hepatic progenitor cells (HPCs) gave rise to hepatocytes upon near-complete hepatocyte loss in the presence of fibrogenic stimulus. Furthermore, through chemical screens using this model, we identified multiple small molecules that enhance hepatocyte regeneration. Here we describe in detail the procedures to develop an EtOH-induced fibrotic liver model and to perform chemical screens using this model in zebrafish. This protocol will be a critical tool to delineate the molecular and cellular mechanisms of how hepatocyte regenerates in the fibrotic liver. Furthermore, these methods will facilitate potential discovery of novel therapeutic strategies for chronic liver disease in vivo.
Introduction
وعلى الرغم من قدرة تجديد رائعة من خلايا الكبد 1، والتي هي كبرى نوع من الخلايا متني من الكبد، فشل الكبد المزمن يضعف هذه القدرة، مما يؤدي إلى خلية سلفية الكبدية (HPC) تجديد معتمد على 2.
ويستمد تلف الكبد المزمن بشكل رئيسي من تعاطي الكحول، التهاب الكبد الوبائي المزمن فيروس (HCV) إصابة 3 و غير الكحولية مرض الكبد الدهني (NAFLD) 4. أنه يؤدي إلى تليف الكبد المستمر، الذي يرتبط مع تراكم البروتينات المصفوفة خارج الخلية (ECM). استمرار تراكم ECM يشوه بنية الكبد سليمة من خلال تشكيل ندبة الأنسجة الليفية 5، مما أدى لاحقا في تليف الكبد مع معدلات الاعتلال والوفيات مرتفعة. وقد بذلت محاولات كثيرة لتخفيف استجابة التليف أساسا من خلال التركيز على تثبيط السيتوكينات profibrogenic وmyofibroblasts تنشيط 6. ويستمد هذا الأخير في المقام الأول من خلايا النجمية الكبدية (Hالمنبوذة)، وخلايا الكبد حيث المبدأ غير متني المسؤولة عن تشكيل ندبة الكبد 4. ومع ذلك، علاجات التجدد التي تحفز مصادر الخلوية الذاتية بما في ذلك HPCS على تجديد خلايا الكبد في وجود الشتائم التليف متواصلة في انتظار مزيد من التحقيقات.
وقد وصفت العديد من النماذج التجريبية من التليف الكبدي في الثدييات. وقد استخدم على نطاق واسع حقن المتكرر من رابع كلوريد الكربون (لجنة علم المناخ 4) للحث على التليف في الكبد في الفئران والجرذان نماذج 7. عندما جنبا إلى جنب مع اتباع نظام غذائي عالي الدهون (HF)، قاد الكحول إلى upregulation كبير في التعبير الجيني profibrogenic والتليف الكبدي 8. في حين تنكس دهني (تراكم الدهون) ناتج عن التعرض الكحول الحاد، فهو يجعل الكبد عرضة للإصابة الكبد أشد 9.
الزرد، دانيو rerio، ظهرت كنظام نموذج الفقاريات لا تقدر بثمن لدراسة تجديد. رغم أنالفقاريات الأخرى أقل مثل سمندل الماء وقنافذ البحر لديها قدرة فائقة على التجدد، والزرد ومزايا أكثر من النظم نموذج الأخرى في ما يخص استراتيجيات التلاعب الجيني والتصور اللازم لمعالجة التجدد المحتمل عوامل 10. يمثل الزرد أيضا نموذجا الفقاريات جذابة لدراسة أمراض الكبد الكحولية (محددة المدة) ببساطة عن طريق إضافة الإيثانول (ETOH) إلى المياه. الحادة ETOH التعرض لالزرد اليرقات والكبار تسبب تشحم الكبد 11-13. عندما تلقى الزرد الكبار التعرض ETOH موسعة، وقد لوحظ ترسب الكولاجين مع upregulation من الجينات ذات الصلة التليف 14. ومع ذلك، توجد حاجة لتطوير نماذج لدراسة تجديد الكبد ردا على ETOH كحافز التليف.
مؤخرا، قمنا بتطوير نموذج الكبد متليفة الناجم عن ETOH في الزرد 15. نحن الجمع بين نظام الاجتثاث الوراثية-الكبدية محددة مع العلاج ETOH في اليرقات وأدولر الزرد. ولدت لنا اثنين من خطوط المعدلة وراثيا، تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) GT1 وتيراغرام (fabp10a: mCherry-NTR) GT2، التي تنصهر القولونية nitroreductase (NTR) إلى السماوي وmCherry بروتين فلوري، على التوالي، تحت سيطرة من الأحماض الدهنية الكبدية محددة ملزمة 10A البروتين، والكبد الأساسي (fabp10a) المروج. في هذا النظام، NTR يحول ميترونيدازول دواء مساعد غير سام (MTZ) في الحمض النووي بين حبلا ربط عبر وكيل 16، استحثاث موت صريح من خلايا الكبد. استخدام هذا النموذج، أثبتنا أن مجموعة من الخلايا الكبدية، والتي تستجيب لإشارات الشق، وتحويلها إلى خلايا الكبد في غياب القريب من خلايا الكبد وفي الزيادة من ECM. بعثنا هذه الخلايا كما HPCS. وعلاوة على ذلك، من خلال شاشات الكيميائية، حددنا تفعيل جزيء صغير من إشارات Wnt ومثبطات يشير الشق أن زيادة تجديد خلايا الكبد في الكبد متليفة. Therefoإعادة، لدينا نموذج الكبد متليفة في الزرد يمثل نظام الفحص الكيميائي رائع بالمقارنة مع اختلاف الثقافات الخلية أو نظام الفرز على أساس الثدييات. وهو في الجسم الحي مع نظام من حيث التكلفة كبيرة وفوائد لتوفير الوقت. نحن هنا وصف الإجراءات التفصيلية لإنشاء نموذج الكبد متليفة الناجم عن ETOH ولأداء شاشات الكيميائية باستخدام هذا النموذج في الزرد. وعلاوة على ذلك، تم إجراء التحليلات الوقت طبعا للتحقيق في كيفية تجديد خلايا الكبد ويحدث في الكبد متليفة. وهذا البروتوكول توفر أداة لا تقدر بثمن لدراسة آليات واستراتيجيات لتعزيز تجديد خلايا الكبد في الكبد متليفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لاحظنا بوساطة HPC الكبدية تجديد في كبد ETOH / MTZ المعاملة يتعافى، مما يشير إلى أنه حتى في وجود كمية كبيرة من البروتينات ECM بما في ذلك نوع ييفي أنا الكولاجين، وHPCS تحتفظ كفاءتهم لتجديد خلايا الكبد كما. وقال إن MTZ فقط المعالجة لا تزيد ترسب البروتينات ECM بشكل ملحوظ، في حين أن ETOH …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من GTEC (2731336 و 1411318)، والمعاهد الوطنية للصحة (K01DK081351)، وجبهة الخلاص الوطني (1354837) لكلية العلوم الصحية نشكر عالم جيورجيس للقراءة نقدية للمخطوطة.
Materials
| Calcium sulfate hemihydrate (CaSO4) | Acros | AC385355000 | |
| Magnesium sulfate (MgSO4) | EMD | MX0075 | |
| 1,4-Piperazinediethanesulfonic acid (PIPES) | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 | |
| Metronidazole (MTZ) | Sigma-Aldrich | M3761 | |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) tablet | Amresco | E404 | Dissolve one tablet with 100 ml distilled water |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2438 | |
| Bovine serum albumin | Fisher Scientific | BP1600 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
| Low-melting agarose | Amresco | BP165 | |
| Stem Cell Signaling Compound Library | Selleck Chemicals | L2100 | 10mM stock in DMSO |
| ActiProbe-1K Library | Timtec | ActiProbe-1K | 10mM stock in DMSO |
| SB 415286 | Selleck Chemicals | S2729 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| CHIR-99021 | Selleck Chemicals | S2924 | Dissolve with DMSO to 10mM |
| Anti-Collagen I antibody | Abcam | ab23730 | Use at 1:100 for immunostaining, reacts with fish |
| AlexaFluor 647 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Molecular Probes | A31573 | Use at 1:200 for immunostaining |
| Mounting media (Vectorshield) | Vector Laboratories | H-1400 | |
| 100 mm petri dish | VWR | 25384-088 | |
| 24-well plate | VWR | 10062-896 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | Dumont #55 |
| Glass slide | VWR | 48312-003 | 75×25 mm |
| Cover glass | VWR | 48366-045 | 18 mm |
| Plastic wrap | Fisher Scientific | 22305654 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 1213100 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 | |
| Vibrotome | Leica | VT1000 S | |
| Stereo microscope | Leica | M80 | |
| Epifluoresent microscope | Leica | M205 FA | |
| Confocol microscope | Zeiss | LSM700 |
References
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration. J Cell Physiol. 213 (2), 286-300 (2007).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem cells and liver regeneration. Gastroenterology. 137 (2), 466-481 (2009).
- Shepard, C. W., Finelli, L., Alter, M. J. Global epidemiology of hepatitis C virus infection. Lancet Infect Dis. 5 (9), 558-567 (2005).
- Hernandez-Gea, V., Friedman, S. L. Pathogenesis of liver fibrosis. Annu Rev Pathol. 6, 425-456 (2011).
- Bataller, R., Brenner, D. A. Liver fibrosis. J Clin Invest. 115 (2), 209-218 (2005).
- Kisseleva, T., Brenner, D. A. Anti-fibrogenic strategies and the regression of fibrosis. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 25 (2), 305-317 (2011).
- Constandinou, C., Henderson, N., Iredale, J. P. Modeling liver fibrosis in rodents. Methods Mol Med. 117, 237-250 (2005).
- Gabele, E., et al. A new model of interactive effects of alcohol and high-fat diet on hepatic fibrosis. Alcohol Clin Exp Res. 35 (7), 1361-1367 (2011).
- Lieber, C. S. Alcoholic fatty liver: its pathogenesis and mechanism of progression to inflammation and fibrosis. Alcohol. 34 (1), 9-19 (2004).
- Poss, K. D. Advances in understanding tissue regenerative capacity and mechanisms in animals. Nat Rev Genet. 11 (10), 710-722 (2010).
- Jang, Z. H., et al. Metabolic profiling of an alcoholic fatty liver in zebrafish (Danio rerio). Mol Biosyst. 8 (7), 2001-2009 (2012).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Yin, C., Evason, K. J., Maher, J. J., Stainier, D. Y. The basic helix-loop-helix transcription factor, heart and neural crest derivatives expressed transcript 2, marks hepatic stellate cells in zebrafish: analysis of stellate cell entry into the developing liver. Hepatology. 56 (5), 1958-1970 (2012).
- Lin, J. N., et al. Development of an animal model for alcoholic liver disease in zebrafish. Zebrafish. 12 (4), 271-280 (2015).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. 60 (5), 1753-1766 (2014).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).
- Parsons, M. J., et al. Notch-responsive cells initiate the secondary transition in larval zebrafish pancreas. Mech Dev. 126 (10), 898-912 (2009).
- Baker, K., Warren, K. S., Yellen, G., Fishman, M. C. Defective ‘pacemaker’ current (Ih) in a zebrafish mutant with a slow heart rate. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (9), 4554-4559 (1997).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. J Vis Exp. (69), e4196 (2012).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of organs from the adult zebrafish. J Vis Exp. (37), (2010).
- Paku, S., Schnur, J., Nagy, P., Thorgeirsson, S. S. Origin and structural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol. 158 (4), 1313-1323 (2001).
- Turner, R., et al. Human hepatic stem cell and maturational liver lineage biology. Hepatology. 53 (3), 1035-1045 (2011).
- Kodama, Y., Hijikata, M., Kageyama, R., Shimotohno, K., Chiba, T. The role of notch signaling in the development of intrahepatic bile ducts. Gastroenterology. 127 (6), 1775-1786 (2004).
- Ryback, R., Percarpio, B., Vitale, J. Equilibration and metabolism of ethanol in the goldfish. Nature. 222 (5198), 1068-1070 (1969).
- Mathias, J. R., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Advances in zebrafish chemical screening technologies. Future Med Chem. 4 (14), 1811-1822 (2012).
- Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
- Westhoff, J. H., et al. Development of an automated imaging pipeline for the analysis of the zebrafish larval kidney. PLoS One. 8 (12), e82137 (2013).
- Perlman, Z. E., et al. Multidimensional drug profiling by automated microscopy. Science. 306 (5699), 1194-1198 (2004).
- Chu, J., Sadler, K. C. New school in liver development: lessons from zebrafish. Hepatology. 50 (5), 1656-1663 (2009).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 776-788 (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146 (3), 789-800 (2014).
- Yao, Y., et al. Fine structure, enzyme histochemistry, and immunohistochemistry of liver in zebrafish. Anat Rec (Hoboken). 295 (4), 567-576 (2012).
- Yovchev, M. I., Xue, Y., Shafritz, D. A., Locker, J., Oertel, M. Repopulation of the fibrotic/cirrhotic rat liver by transplanted hepatic stem/progenitor cells and mature hepatocytes. Hepatology. 59 (1), 284-295 (2014).
