Utilización de hojas de luz de microscopía de fluorescencia a la imagen de ojo de pez cebra Desarrollo
Summary
Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.
Abstract
Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions.
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.
Introduction
La morfogénesis es el proceso que da forma el embrión y, junto con el crecimiento y la diferenciación impulsa la ontogenia de un huevo fecundado en un organismo multicelular maduro. Los procesos morfogenéticos durante el desarrollo de los animales se pueden analizar mejor mediante imágenes de los especímenes vivos intactos 1-3. Esto es porque tal formación de imágenes embrión entero conserva todos los componentes que generan y regulan el desarrollo, incluyendo los gradientes de moléculas de señalización, matriz extracelular, vasculatura, inervación, así como propiedades mecánicas del tejido circundante. Para salvar las escalas, en las que se produce la morfogénesis, los acontecimientos subcelulares rápidas tienen que ser capturado en una escala temporal minutos en el contexto del desarrollo de todo el tejido durante horas o días. Para cumplir con todos estos requisitos, se ha desarrollado una aplicación moderna 4 de la ortogonal microscopio plano de iluminación 5. Originalmente, fue nombrado el plano de iluminación selectiva de Microscopía (SPIM) 4; ahora una hoja de luz que todo lo abarca término microscopía de fluorescencia (LSFM) se utiliza normalmente. LSFM permite obtener imágenes en alta resolución en el tiempo, mientras que induce menos fototoxicidad de escaneo láser o disco giratorio microscopios confocales 6,7. Hoy en día, ya hay muchas implementaciones del principio básico de hoja de luz de iluminación y se ha utilizado para la imagen una gran variedad de muestras y procesos que antes eran inaccesibles para los investigadores 8-11.
En primer lugar, quisiéramos destacar varias ventajas clave de LSFM sobre los enfoques de microscopía confocal convencionales:
Para obtener resultados significativos a partir de imágenes en vivo experimentos microscópicas, es importante que la observación sólo afecta mínimamente la muestra. Sin embargo, muchos organismos incluyendo el pez cebra son muy susceptibles a la exposición a la luz láser, por lo que es difícil de imagen en un microscopio confocal de alta resolución de tiempo sin ef fototoxicidaddefectos como 6,7 estancamiento del desarrollo o retraso. LSFM es actualmente la técnica de imágenes de fluorescencia con los menores efectos perturbadores en la muestra 7. Dado que la hoja delgada luz láser ilumina sólo la parte de la muestra que se forma la imagen en un punto de tiempo determinado, el microscopio de lámina de luz es el uso de fotones de manera muy eficiente. En consecuencia, la baja exposición a la luz para observaciones con lapso de tiempo más largos de los especímenes más sanos, por ejemplo 12-17. Por otra parte, gracias a la mínima invasividad de LSFM, el número de imágenes adquiridas ya no está dictada por la cantidad de luz que la muestra puede tolerar, sino más bien por la cantidad de datos pueden ser procesados y almacenados.
En la misma línea de mantener la muestra en condiciones fisiológicas cerca, LSFM viene con el montaje de la muestra estrategias alternativas muy adecuados para los embriones vivos. En las técnicas de LSFM, los embriones se insertan típicamente dentro de una delgada columna de agarosa de bajo porcentaje. el mounting en cilindros de agarosa permite la completa libertad de rotación, por lo que la muestra se puede observar desde el ángulo perfecto (en LSFM denomina vista) y desde varios puntos de vista al mismo tiempo. La proyección de imagen de múltiples vistas y la fusión de múltiples vistas posterior es beneficioso sobre todo para grandes muestras de dispersión, y permite la captura de ellos con alta resolución, isotrópico. Un resumen de otras estrategias posibles de montaje LSFM se puede encontrar en el manual oficial de explotación del microscopio, en el capítulo sobre la preparación de la muestra escrito por el laboratorio de E. Reynaud. Es una lectura recomendable, especialmente si el objetivo es a diferentes muestras de imagen que se describe aquí.
La adquisición de imágenes en LSFM es de gran campo, basado en cámaras, a diferencia de escaneo láser confocal microscopio. Esto resulta en una señal a una mayor relación de ruido (SNR) de las imágenes adquiridas y puede ser extremadamente rápido (decenas a cientos de cuadros por segundo). La alta sensibilidad de LSFM permite además de imágenes de samp débilmente fluorescenteles, como factores de transcripción expresados en los niveles endógenos o 18, en el futuro cercano, las proteínas endógenas etiquetados utilizando CRISPR / Cas9. La alta SNR también es importante para el éxito de análisis de imágenes aguas abajo. Se requiere que la alta velocidad no sólo para capturar procesos intracelulares rápidas, sino también a la imagen de todo el embrión desde múltiples puntos de vista suficientemente rápido. Una fusión perfecta de las varias vistas sólo se puede lograr, si el fenómeno observado no cambia durante la adquisición de estas varias pilas z procedentes de vistas separadas.
Las ventajas de LSFM no vienen típicamente a expensas de la calidad de imagen. La resolución lateral de LSFM es ligeramente peor que la resolución de un microscopio confocal. Esto se debe a los objetivos de detección utilizados en LSFM tienen una menor apertura numérica (generalmente 1,0 o menos) en comparación con 1/2 a 1/3 de los objetivos de agua o la inmersión de silicio sobre la instalación de confocal estándar. Además, debido a la amplia detección de campos en LSFM (Absence de un agujero de alfiler), hay más luz fuera de foco en comparación con un microscopio confocal. La cantidad de luz fuera de foco es determinado por el espesor de la lámina de luz. Sin embargo, estas desventajas se compensan por el mayor SNR en LSFM. En la práctica, esto se traduce en imágenes de calidad similar en comparación con, por ejemplo, girando el disco de adquisición confocal 15. En consecuencia, esto permite la extracción fiable de características como las membranas celulares o núcleos, por ejemplo, por linaje de células rastreo 15,19.
La resolución axial de LSFM se determina, además del objetivo de detección, por el espesor de la lámina de luz. La resolución axial de LSFM puede en algunos casos supera la resolución de los microscopios confocal. En primer lugar, la mejora en la resolución viene cuando la lámina de luz es más fina que la resolución axial del objetivo de detección, que se produce normalmente para grandes especímenes fotografiados con un objetivo bajo aumento. La segunda forma, cómo el LSFM puede ACHIEVE mejor resolución axial, es la fusión de múltiples vistas, en la que la información de alta resolución xy desde diferentes puntos de vista se combina en una sola imagen de pila. La pila fusionado resultante tiene una resolución isotrópica acercarse a los valores de la resolución en la dirección lateral 20,21. La estrategia para el registro de los múltiples puntos de vista sobre la otra se describe en este artículo se basa en el uso de perlas de poliestireno fluorescentes como marcadores fiduciarios embebidos en la agarosa alrededor de la muestra 20,21.
Como resultado de la comercialización LSFM, esta técnica ya está disponible para una amplia comunidad de científicos 22. Por lo tanto, la motivación para escribir este protocolo es que esta tecnología sea accesible para los biólogos del desarrollo que carecen de experiencia práctica en LSFM y para obtener estos científicos empezaron a utilizar esta tecnología con sus muestras. Nuestro protocolo utiliza el microscopio ficha técnica de iluminación comercial, lo que constituye un microscopio conceptualmente simple tsombrero es fácil de operar. Además, nos gustaría hablar de otros protocolos recientes para obtener imágenes de pez cebra con configuraciones LSFM de fabricación casera, que podrían ser adecuados para responder a determinadas preguntas 23-25. Otra opción de entrada a LSFM son las plataformas abiertas 26,27, que utilizan los principios de libre acceso para traer la microscopía de lámina de luz a una comunidad más amplia. La documentación tanto del hardware y los aspectos del software se puede encontrar en http://openspim.org y https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.
En este protocolo, se utiliza el pez cebra teleósteos como un sistema modelo para estudiar los procesos de desarrollo con LSFM. La morfogénesis del ojo de pez cebra es un ejemplo que pone de manifiesto muchos de los beneficios de LSFM. LSFM ya se ha utilizado en el pasado para investigar el desarrollo del ojo en medaka 28 y en el pez cebra 29,30. En la etapa temprana de desarrollo del ojo que es complicado para orientar el embrión correctamente para microscopía convencional,como la yema voluminosos no permite que el embrión se encuentran en el lado con su ojo hacia el objetivo. Sin embargo, con LSFM de montaje en una columna de agarosa, la muestra puede ser reproducible posicionado. Además, durante la transición de la vesícula óptica a la etapa de copa óptica, el ojo se somete a grandes reordenamientos morfogenéticas acompañadas de crecimiento, lo que requiere la captura de una gran pila z y un gran campo de visión. También para estos desafíos LSFM es superior a la imagen confocal convencional. El proceso de formación copa óptica es tridimensional, por lo tanto es difícil de comprender y visualizar únicamente por formación de imágenes de una vista. Esto hace que las imágenes multivista con la resolución isotrópica beneficioso. Después de la formación copa óptica, la retina se vuelve cada vez más sensibles a la exposición al láser. Por lo tanto, la baja fototoxicidad asociado con LSFM es una ventaja importante para la formación de imágenes a largo plazo.
Aquí presentamos un protocolo optimizado para la imagen de uno a tres días de edad embriones de pez cebra unalarvas nd con enfoque en el desarrollo del ojo. Nuestro método permite la grabación de películas a intervalos que cubren hasta 12-14 h con alta resolución espacial y temporal. Es importante destacar que, también mostramos una tubería para el procesamiento de datos, que es un paso esencial en LSFM, ya que esta técnica invariablemente genera grandes conjuntos de datos, a menudo en el rango terabyte.
Protocol
Representative Results
Discussion
1. Los pasos críticos y reparación para la adquisición de datos
Los ajustes de imagen típicos para una GFP y RFP que expresan muestra se pueden encontrar en la Tabla 3. En la configuración del microscopio se describe la lámina de luz es estática, formada por una lente cilíndrica. Los dos objetivos de iluminación son lentes de aire y el objetivo es la detección de una lente de inmersión en agua. Zoom 1,0 con 20X / 1.0 o 40X / 1.0 objetivos da 230 nm y 115 nm de tamaño de píxel y un campo de visión de 441 x 441 micras o 221 x 221 micras, respectivamente. Se recomienda utilizar el espesor de la lámina de luz por defecto con el centro a frontera relación de 1: 2. Para 20X / 1.0 este espesor corresponde a 4,5 micras y 40X / 1,0 a 3,2 micras en el centro. Si la velocidad de formación de imágenes no es la prioridad principal, utilice pistas separadas en caso de una muestra multicolor para evitar la diafonía de la emisión de fluorescencia entre los canales. La velocidad más alta de la adquisición está limitada a 50 ms por z paso por elvelocidad de movimiento de la z-conductor. Si el objetivo es lograr la velocidad máxima de formación de imágenes en el caso de, por ejemplo, dos pistas con iluminación doble cara, el tiempo de exposición se deben establecer de modo que la suma de todas las imágenes tomadas por z paso es inferior a 50 ms. Por otro lado, si sólo una única imagen se adquiere por z paso, no es beneficiosa para establecer el tiempo de exposición más corto que 50 ms.
| tamaño de la imagen 1920 x 1920 |
| 16-bit |
| Pivote de análisis bajo |
| iluminación de doble cara con la fusión en línea |
| 10X objetivo / 0,2 iluminación |
| 20X / 1.0 W Plan-Apocromático objetivo de detección |
| Pista 1: Excitación 488 nm típicamente 2% de 100 mW láser, 550 nm filtro de emisión SP |
| Pista 2: Excitación 561 nm normalmente de 3% del láser 75 mW, 58filtro de emisión LP 5 nm |
| Tiempo de exposición hasta 100 mseg |
| espesor pila Z 50 a 100 micras |
| 1-1,5 micras tamaño de paso z z en el modo de accionamiento continuo |
| La incubación a 28,5 ° C |
Tabla 3: Proyección de imagen Configuración.
La inspección de la muestra después del experimento
Es importante asegurarse de que la muestra es todavía saludable al final del experimento. En una primera lectura, comprobar el latido del corazón de la muestra en un estereoscopio. Con un par de pinzas cortantes la muestra se puede sacar de la agarosa y se trasladó a la incubadora para desarrollar aún más con el fin de comprobar si se ve afectada por la formación de imágenes. Alternativamente, se puede fijar para la tinción de anticuerpos.
El montaje y la deriva
Es esencial para mantener la osmolaridad de la cámara sOlution cerca de la osmolaridad de la agarosa incrustación, de lo contrario inflamación / encogimiento de la agarosa y la posterior inestabilidad de que ocurrirá la muestra. Por lo tanto, utilizar la misma solución (E3 medio sin el azul de metileno) para llenar la cámara y preparar las alícuotas de bajo punto de fusión punto de agarosa al 1%. Además, no deje que la agarosa en el bloque de calentamiento de 70 ° C durante más de 2 horas, ya que puede perder sus propiedades gelificantes.
No incrustar el pescado en agarosa demasiado caliente, ya que esto puede conducir a la respuesta de choque térmico o la muerte del embrión. Si no está seguro sobre el efecto de agarosa caliente en los embriones, compruebe que la cola no se dobla y que la frecuencia cardíaca no ralentiza. Si esto ocurre, utilizar un embrión diferente para el experimento.
Mantenga la longitud total de la columna de agarosa con la muestra corto (alrededor de 2 cm) y montar el pez cebra con su cabeza orientada hacia la punta del émbolo. Del mismo modo, el cilindro de agarosa extruye a partir de la capillary debe ser lo más corto posible. Estas medidas garantizar la estabilidad de la muestra a lo largo de la película. Al mismo tiempo, la columna de agarosa debe ser lo suficientemente largo como para que el propio capilar de vidrio no llega a la trayectoria de la luz, ya que esto causaría gran refracción y reflexión.
La deriva inicial de la muestra está causado por los cambios de volumen de la propia cilindro de agarosa. Deslizante del émbolo no es la razón para ello. Por lo tanto, no ayuda a solucionar el émbolo con plastilina o esmalte de uñas. El embrión podría cambiar su posición durante la película debido a su crecimiento natural también. Por consiguiente, es aconsejable para centrar la región de interés en el centro del campo de vista y tener algo de espacio en los bordes para adaptarse a estos movimientos.
Reducción de la cantidad de medio de inclusión en la trayectoria luminosa
La orientación de la muestra correctamente ayuda a conseguir la mejor calidad de imagen posible 15. Generally, la excitación y la emisión de luz debe viajar a través menor cantidad de tejido y de los medios de montaje como sea posible. La solución óptima es un montaje libre de agarosa. Esto se logró por ejemplo en una configuración para imágenes Arabidopsis raíz lateral 14, en la que la raíz principal se montó en fitagel y las raíces laterales fueron posteriormente deja de crecer hacia fuera de la columna de gel completamente. Montaje sin agarosa también se desarrolló para obtener imágenes de la embriogénesis completa de Tribolium escarabajo durante dos días 12. mejora de la calidad de la imagen no era una motivación primaria en ese caso. embriones Tribolium simplemente no sobreviven dentro de la agarosa tiempo suficiente. Un montaje sin medios absolutamente incrustación no se ha logrado para la imagen a largo plazo en el pez cebra. Aún así, podemos aprovechar el hecho de que cuando se solidifica la agarosa, la mayoría de los embriones se colocan en diagonal en el capilar con un ojo, situada en pleno agarosa y el segundo ojo de estar cerca de la superficie de la columna de la incrustación. Tque el ojo más cerca de la superficie proporciona una calidad de imagen superior y por lo tanto debe ser reflejado preferentemente.
la concentración de agarosa y de imagen a largo plazo
La concentración de agarosa para el montaje es un compromiso entre la estabilidad de la muestra y la posibilidad de acomodar el crecimiento del embrión y la difusión de oxígeno a la misma. No hay ganancia adicional en la estabilidad de la muestra utilizando las concentraciones de agarosa superiores al 1%. Como punto de partida para la optimización de los experimentos se recomienda 0,6% de agarosa, que también es adecuado para los embriones más jóvenes que 24 HPF que son demasiado delicado para ser montado en 1% de agarosa. Para anestesiar embriones de más edad y larvas, la concentración de MS-222 puede ser elevado a 200 mg / ml sin efectos secundarios 13.
En el caso de los embriones en desarrollo se crean imágenes durante más de ± 12 horas, no se recomienda el montaje de agarosa, ya que restringe el crecimiento del embrión y causes la deformación de la cola. Este problema fue resuelto por el pez cebra mediante el montaje de los embriones en tubos de polímero FEP con índice de refracción similar al agua 13,39. Los embriones de ratón, por otra parte, se pueden inmovilizar en cilindros de agarosa hueco 40 o en los agujeros de una varilla de acrílico unida a una jeringa 41. el montaje de tubo FEP no se recomienda como método por defecto, sin embargo, debido a que la pared del tubo refracta la luz un poco más de agarosa.
la alineación de lámina de luz
Para una buena calidad de imagen es fundamental para llevar a cabo la alineación automática de lámina de luz antes de cada experimento. Sobre todo si se han cambiado los ajustes de zoom, se tomaron los objetivos, o un líquido diferente se utilizó en la cámara.
Iluminación
La exploración de giro de la hoja de la luz siempre debe ser activado. Para especímenes grandes de dispersión, es necesario aplicar la iluminación doble cara con f líneausion para lograr una iluminación uniforme en todo el campo de visión. iluminación de doble cara también disminuye un problema específico de la formación de imágenes del ojo, que es la refracción de la lámina de luz entrante por la lente del embrión. Más pequeño, menos muestras de dispersión se pueden obtener imágenes de manera eficiente el uso de la iluminación de una sola cara, lo que reduce el tiempo de formación de imágenes por medio y puede resultar en un poco mejor calidad de imagen en comparación con la iluminación doble cara. Esto es porque las trayectorias de la luz para los dos brazos de iluminación son siempre diferentes y el más eficiente puede ser elegido. Además, las dos láminas de luz procedentes de cada lado nunca son perfectamente en un plano, lo que hace que leve desenfoque después de la fusión. Para eventos intracelulares muy rápidos, como los microtúbulos en crecimiento (Película 2), la iluminación de doble cara no es adecuada, ya que las imágenes con la iluminación de la izquierda y la derecha se adquieren de forma secuencial, lo que podría resultar en el desenfoque de movimiento.
photobleachingy fototoxicidad
Menos photobleaching fluoróforo se menciona a menudo como una de las principales ventajas de la LSFM. Podríamos argumentar que el objetivo debe ser no photobleaching en absoluto. Si hay photobleaching notable en el experimento de formación de imágenes en vivo, la muestra es probable que ya fuera de su rango fisiológico de la exposición al láser tolerada. Cuando imágenes de los embriones de pez cebra en el microscopio de disco giratorio, en nuestra experiencia, alta fototoxicidad puede detener el desarrollo del embrión, incluso antes de que los blanqueadores fluorescentes de señal notablemente. Por lo tanto, la configuración de imagen en el LSFM deben ajustarse de modo que se observa poco o ningún photobleaching. A pesar de que LSFM es suave para la muestra, es prudente utilizar sólo la cantidad de tiempo de la potencia del láser y la exposición, según sea necesario para lograr una relación de señal a ruido suficiente para el subsiguiente análisis de datos.
Z-pila, intervalos de tiempo y tamaño de los datos
Los archivos generados por LSFM suelen ser muy grandes; a veces en el rango terabyte. A menudo es necesario para hacer un compromiso entre calidad de imagen y tamaño de los datos. Este es particularmente el caso para z espacio de la pila y los intervalos en las adquisiciones de lapso de tiempo. Para definir los intervalos z, el botón óptima en la pestaña de herramienta Z-pila ideal sería que se utiliza, sobre todo si el conjunto de datos se deconvolved más tarde. Se calcula la distancia para alcanzar el 50% de solapamiento entre las rebanadas ópticos vecinos. Sin embargo, los intervalos de z algo más grandes son generalmente aceptables. Reducen el tiempo necesario para adquirir la pila z, así como el tamaño del archivo final. El muestreo de tiempo óptimo depende del proceso de interés. Para la vista en general el desarrollo intervalos de 5-10 min son generalmente aceptables. Si algunas estructuras han de ser rastreado de forma automática, los puntos de tiempo posteriores deben ser suficientemente similares.
perlas fluorescentes
perlas fluorescentes sirven principalmente como marcadores fiduciales para el registro de diferentes puntos de vistade un conjunto de datos de múltiples vistas sobre la otra. Siempre agite las soluciones de talón a fondo antes de su uso. No calentar los granos ya que esto puede conducir a la pérdida del colorante fluorescente. La concentración óptima del grano para el registro multiview tiene que determinarse experimentalmente. El plug-in se ha descrito funciona mejor con alrededor de 1.000 cuentas detectadas a través de cada punto de vista. Más grandes (500 nm o 1000 nm) perlas se detectan con mayor fuerza de perlas (de menos de 500 nm) más pequeños. Esto es porque los granos más grandes son más brillantes y son más fáciles de segmento sin detecciones de falsos positivos de estructuras en la muestra. La desventaja de las perlas más grandes es que son muy prominente en la imagen fusionada y deconvolved final. Para cada nuevo marcador fluorescente, el tamaño de grano apropiado y emisión de fluorescencia tienen que ser optimizada. Para dar un ejemplo de muestra de la Figura 5 y la película 3, 100 bolas verdes de emisión nm dieron demasiadas falsas detecciones positivas en el canal de membrana-GFP, pero 1.000 nm perlas de emisión de color rojo se detectaron con fuerza en el canal H2B-RFP con muy pocas detecciones positivas dentro de la muestra. Si la detección del grano falla en el canal con el marcador fluorescente, un canal separado solamente contiene perlas puede ser adquirida, pero esto no es muy práctico. Las perlas de tamaño sub-resolución dan una lectura directa de la función de dispersión de punto (PSF) del microscopio, que puede ser utilizado para la deconvolución (Figura 2C-D). Si el registro y la fusión funciona mejor con los granos más grandes (por ejemplo, 1000 nm), una imagen separada de la PSF se puede adquirir con el sub-resolución, por ejemplo, 100 nm perlas. El uso de granos multicolores es útil durante el registro de la adquisición de múltiples canales y de verificar que la superposición de canales perfectamente.
La adición de perlas fluorescentes no es necesaria cuando se generan imágenes de una sola vista sin registro multiview posterior y la fusión. Sin embargo, incluso en aquellos casos en los granos pueden ser útiles durante el initial ajuste de lámina de luz para comprobar la calidad de la hoja de la luz y, en general, para revelar las aberraciones ópticas. Tales aberraciones ópticas pueden provenir de diversas fuentes como objetivos dañados o sucios, ventanas sucias de la cámara o de la falta de homogeneidad en la agarosa. Cuentas también se pueden utilizar para la corrección de la deriva por el registro de múltiples vistas Fiji plug-in 20.
Multiview
Para los fines de reconstrucción multiview, es mejor para adquirir un número impar de vistas 3, 5 y así sucesivamente, que no se oponen entre sí. Esto mejora la deconvolución desde los PSF se crean imágenes desde diferentes direcciones. También es importante confirmar al comienzo de la adquisición de lapso de tiempo que existe suficiente superposición entre las vistas. Esto se hace mejor empíricamente, es decir, lo que confirma que las opiniones de inmediato en el primer punto de tiempo se pueden registrar con éxito. Cuando el objetivo de la adquisición multiview es aumentar la resoluciónde una imagen de un espécimen grande de dispersión, no es aconsejable imagen completa de la muestra en cada vista, pero para detener alrededor del centro de la muestra, donde la señal se deteriora. La adquisición de baja calidad a partir de la segunda mitad de la muestra no añadiría información útil para la reconstrucción de múltiples vistas.
2. Los pasos críticos y reparación para el procesamiento de datos
En la actualidad, existen varias posibilidades para el procesamiento de datos de un microscopio multivisión de lámina de luz que están bien documentadas y relativamente fácil de adoptar. Utilizamos la aplicación de reconstrucción de múltiples vistas, que es un software de código abierto implementado en Fiji 32 (Stephan Preibisch inédito, Enlace 1a y Link1b en la Lista de Materiales). Este plugin es un importante rediseño del plugin de registro SPIM 20 anterior, revisadopor Schmied et. al 42, la integración de la BigDataViewer y su formato XML y HDF5 33 con el flujo de trabajo de registro SPIM (Figura 1B, Enlace 2 , Enlace 3 ). Esta aplicación puede ser también adaptado para cluster de computación de alto rendimiento, lo que acelera significativamente el procesamiento de 43. Esta solicitud de registro multiview se desarrolla de forma activa más allá y sigue mejorando. En caso de problemas o peticiones de características para el software que se describe, por favor presentar problemas en las páginas respectivas de GitHub ( Enlace 4 de Multiview la Reconstrucción y el enlace 5 para BigDataViewer).
La segunda opción es utilizar el software comercial disponible junto con el microscopio. Esta solución funciona bien y da empleo el mismo principio de la utilización de perlas fluorescentes para registrar los diferentes puntos de vista. Sin embargo, carece de la opción de visualizar todo el conjunto de datos rápida como con la BigDataViewer. También el software no se puede adaptar a la agrupación y, además, los bloques de procesamiento del microscopio para otros usuarios, a menos que se compra licencia adicional para el software.
La tercera opción, que es también un software de código abierto, ha sido publicado recientemente por el laboratorio Keller 44 y proporciona un marco global para el procesamiento y análisis de aguas abajo de los datos de la hoja de luz. Este software está utilizando información desde dentro de la muestra para llevar a cabo la fusión multiview, por lo tanto, no requiere la presencia de perlas fluorescentes alrededor de la muestra. Pero, al mismo tiempo que asume la orientación ortogonal de los puntos de vista de formación de imágenes (objetivos), por lo que no se puede utilizar para los datos adquiridos de ángulos arbitrarios 44.
Requisitos de hardware
ntent "> El hardware utilizado para el procesamiento puede ser encontrado en la Tabla 4. Tiene que haber suficiente capacidad de almacenamiento y una tubería clara para el procesamiento de los datos disponibles, por delante del experimento real. La adquisición de las imágenes es más rápido que el análisis posterior y es fácil a inundarse con los datos sin procesar. a menudo es poco realista para almacenar todas las imágenes en bruto, sino más bien un recorte o imágenes procesadas como vistas fusionadas, proyecciones de máxima intensidad o proyecciones esféricas 45.| Procesador | Dos procesador Intel Xeon E5-2630 (Six Core, 2,30 GHz Turbo, 15 MB, 7,2 GT / s) |
| Memoria | 128 GB (16 × 8 GB) de 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM |
| Disco duro | 4 × 4 TB Serial ATA de 3,5 pulgadas (7.200 rpm) de disco duro |
| controlador de disco duro | PERC H310 SATA / SAS de Concontrolador para Dell Precision |
| Configuración del disco duro | C1 SATA de 3,5 pulgadas, 1-4 unidades de disco duro |
| Gráficos | Dual 2 GB Quadro 4000 (2 cartas w / DP 2 y 1 DVI-I cada uno) (2 DP-DVI y 2 adaptador DVI-VGA) (MRGA17H) |
| Red | Tarjeta de interfaz de red Intel X520-T2 de doble puerto 10 GbE |
Tabla 4: Requisitos de hardware.
la velocidad de procesamiento de datos
El tiempo necesario para el procesamiento de datos depende de las dimensiones de los datos y del hardware utilizado. En la Tabla 1, se proporciona un resumen del tiempo requerido para las etapas clave en el procesamiento de un ejemplo 8,6 GB de datos de múltiples vistas que consistía en 1 punto temporal con 4 puntos de vista y 2 canales.
| procesamiento step | Hora | Protocolo de paso |
| Vuelva a guardar como HDF5 | 6 min 30 seg | 6.3 |
| Detectar Puntos de interés | 20 sec | 6.4 |
| Regístrese utilizando puntos de interés | 3 seg | sesenta y cinco |
| multiview fusión basada en el contenido | 4 horas | 7.2 |
| deconvolución Multiview (CPU) | 8 hr | 7.3 |
| deconvolución Multiview (GPU) | 2 horas | 7.3 |
Tabla 1: Datos Tiempo de procesamiento.
formatos de datos de entrada para la reconstrucción multiview
El Plugin Multiview Reconstrucción Fiji puede soportar .czi, .tif y formatos ome.tiff. Debido a la estructura de datos del formato de .czi, conjuntos de datos no son discontinuosapoyado sin tratamiento previo. Discontinua significa que la grabación tuvo que ser renovadas (por ejemplo, volver a ajustar las posiciones debido a la deriva de la muestra). En este caso, los archivos .czi necesitan volver a guardar como .tif. Para .tif cada vista y dirección de la iluminación tiene que ser guardado como un archivo separado.
La calibración del tamaño de píxel
El software microscopio de operación calcula la calibración para el tamaño xy pixel basado en el objetivo seleccionado. Sin embargo, el tamaño de píxel en z se define de forma independiente por el tamaño del paso. Si se especifica un objetivo equivocado en el software de la xy al cociente z es incorrecta y el registro fallará.
El registro inicial
Después de definir el conjunto de datos el número de registros será 1 y el número de puntos de interés será 0 en el Explorador de ViewSetup. El registro inicial representa la calibración del conjunto de datos. Tanto el número of registros y puntos de interés aumentarán durante el procesamiento.
El muestreo para la detección de puntos de interés
El uso de abajo de muestreo se recomienda, ya que la carga de los archivos y la segmentación será mucho más rápido. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los parámetros de detección cambiará en función de la toma de muestras abajo, transfiriendo así la configuración de detección entre los diferentes ajustes de muestra abajo no es posible.
La detección de puntos de interés
Es aconsejable segmento de tantas perlas verdaderas como sea posible en cada vista, incluso al precio de la obtención de algunas detecciones de falsos positivos, debido a que no obstaculicen el registro considerablemente. detecciones falsas, si pocos en número, se excluyen durante el registro (Consulte Registro de puntos de interés). Sin embargo, las detecciones de falsos positivos masivas plantean un problema con el algoritmo. No sólo reduce el rendimiento para la detección yel registro, ya que toma mucho más tiempo para segmentar la imagen, así como comparar estas perlas entre los puntos de vista, sino que también reduce la exactitud del registro. Esto puede ser abordado mediante el uso de parámetros de detección más estrictas. Además, durante la segmentación de las perlas (es decir, múltiples detecciones en un único cordón Figura 1E) es perjudicial para el registro y debe ser evitado.
El registro de puntos de interés
Para registrar los puntos de vista sobre la otra, la ubicación de cada perla en cada vista se describe por su posición con respecto a sus tres vecinos más cercanos perlas. Estas constelaciones están formando un descriptor geométrica local y permiten la comparación de cada perla entre los puntos de vista. Perlas a juego con el descriptor entre dos puntos de vista son, por consiguiente correspondencias candidatos. Tenga en cuenta que esto sólo funciona para los granos distribuidos al azar, para lo cual los descriptores locales suelen ser único para cada cuenta.Uno puede usar otras estructuras tales como núcleos de la muestra para el registro. Sin embargo, con el fin de detectar los núcleos, que se distribuyen al azar no en la muestra, otros métodos se aplican 20,21.
Las correspondencias candidatos se prueban contra RANSAC 36 con el fin de excluir falsos positivos. Cada correspondencia sugiere un modelo de transformación para superponer los puntos de vista sobre la otra. correspondencias verdaderas probablemente estarían de acuerdo en un modelo de transformación, mientras que los valores atípicos haría cada punto a otro diferente. Los verdaderos correspondencias se utilizan entonces para calcular un modelo de transformación afín entre las dos vistas en comparación. Una optimización global con un algoritmo de optimización iterativo se lleva a cabo entonces, durante el cual todos los puntos de vista están registrados en la primera vista con el objetivo de desplazamiento mínimo entre las vistas de 20,21.
el registro de lapso de tiempo
Debido a moverción del movimiento motor de agarosa e impreciso de la platina del microscopio, la posición de cada pila varía moderadamente con el tiempo. Mientras que el registro del punto de tiempo individual elimina la diferencia entre los puntos de vista de este punto de tiempo, el lapso de tiempo también tiene que ser registrado como un todo. Con este fin, cada punto de tiempo individual se ha registrado en el punto de tiempo de referencia.
Punto de referencia temporal
Si se procesa una serie de tiempo con muchos puntos de tiempo, un punto de tiempo representativo se selecciona como referencia por lo general desde la mitad de la serie de tiempo ya que las intensidades de talón pueden degradar con el tiempo debido a la decoloración. En esta referencia, los parámetros para la detección de puntos de interés, el registro, el cuadro delimitador y la fusión se puede determinar. Estos parámetros se aplican a todo el lapso de tiempo para calcular un modelo de transformación específico para cada punto de tiempo individual. Durante el registro de lapso de tiempo todos los otros puntos temporales también son registEred espacialmente en este momento el punto de referencia. De este modo los parámetros del cuadro delimitador para toda la grabación dependen de este punto de tiempo específico.
registro multicanal
Cuando la formación de imágenes de múltiples canales, idealmente las mismas perlas fluorescentes deben ser visibles en todos los canales de imágenes. La detección y el registro a continuación se pueden realizar en cada canal de forma individual, que tiene en cuenta la influencia de las diferentes longitudes de onda de luz en la transformación. A menudo esto no es posible, debido a que los granos no son visibles en todos los canales o las perlas están dominando demasiado la imagen en un canal y son demasiado tenue en el otro canal (s). La solución típica es utilizar granos visibles sólo en un canal para la detección y el registro y el modelo de transformación adquirida (es decir, después de la detección, el registro y el registro de lapso de tiempo) se aplica luego a los otros canales por Fiji> Plugins> Multiview Reconstrucción> Procesamiento por lotes> Herramientas> Duplicar Transformaciones. En el menú desplegable para Aplicar transformación de seleccione un canal a otros canales. En la siguiente ventana seleccione el archivo XML y haga clic en OK. A continuación, seleccione el canal que contiene las perlas como Canal de origen y de destino como canal de seleccionar el canal (s) sin granos. Para Duplicar los cuales utilizan transformaciones Reemplazar todas las transformaciones y pulse OK. Las transformaciones se copian a todos los otros canales y se guardan en el archivo XML. Para ver las nuevas transformaciones en el Explorador de ViewSetup, reinicie la aplicación Reconstrucción MultiView.
Cuadro delimitador
La fusión de múltiples puntos de vista es computacionalmente muy intensivo. Sin embargo, grandes imágenes se adquieren para acomodar no sólo la muestra, sino también las perlas de alrededor de ella. Una vez que el parámetro de registros se extraen de los granos, que ya no son útiles como parte de la imagen. Por lo tanto, para aumentar la eficacia de la fusión, sólo las partes de las pilas de imágenes que contienen la muestra deben ser fusionados. Una región de interés (cuadro delimitador) debe definirse para contener la muestra y tan poco de la agarosa circundante como sea posible. Para el ejemplo de la Figura 2 una fusión medio ponderado de todo el volumen con el de 2229 × 2136 × 2106 px requeriría 38,196 MB de RAM, mientras que con un cuadro de límite del volumen se reduce al de 1634 × 1746 × 1632 px y se reducen los requisitos de memoria a 17,729 MB.
multiview fusión basada en el contenido
El reto de la fusión de datos de múltiples vistas es que los puntos de vista por lo general terminan abruptamente y no contienen la misma calidad de imagen para las mismas voxels. un simple promedio de los puntos de vista sería, por tanto, dar lugar a artefactos de mezcla y degradación de la imagen innecesaria. basado en el contenido fu multiview Sion toma ambos problemas en cuenta. En primer lugar, se mezcla los diferentes puntos de vista, donde una imagen termina y comienza el otro y en segundo lugar, se evalúa la calidad de la imagen local y aplica un mayor peso a una mayor calidad de imagen en la fusión 21. En comparación con un solo punto de vista no es una mejora de la resolución en z con una ligera degradación de la señal en xy (Figura 2E-H, la Figura 5A-D).
deconvolución Multiview
deconvolución Multiview es otro enfoque para conseguir la fusión de los puntos de vista. Con este método también los PSFs de las diferentes vistas se tienen en cuenta con el fin de recuperar la imagen que ha sido convolucionada por la óptica del microscopio. Este método mejora drásticamente la calidad de imagen mediante la eliminación de borrosidad de la imagen y el aumento de la resolución y el contraste de la señal 31 (Figura 2C-D, Figura 2I-J, Figura 5E-G, Película 3).
ve_content "> deconvolución es computacionalmente muy intensiva (ver Tabla 1), por lo tanto con una GPU para el procesamiento aumenta la velocidad de este proceso. También puede ser necesario realizar la deconvolución de los datos de muestreo reducido. Para muestra abajo, utilizar Reconstrucción Fiji> Multiview > Procesamiento por lotes> Herramientas> aplicar transformaciones. Esto se aplicará un nuevo modelo de transformación en las opiniones que se guardarán en el archivo .xml.formato de archivo para HDF5 BigDataViewer y BigDataServer
El BigDataViewer 33 permite una fácil visualización de los datos de terabytes. Cómo controlar el BigDataViewer se resume en la Tabla 2. Un screencast de la operación básica del programa también está disponible como un suplemento en su publicación original 33. El BigDataViewer se centra en un archivo .xml, que contiene los metadatos, y un archivo hdf5, que contiene los datos de la imagen. Los datos de imagen son present en el hdf5 en múltiples niveles de resolución en 3D bloques. Los múltiples niveles de resolución permiten la visualización de los datos más rápido con menor resolución, antes de la resolución completa está cargado. Los bloques individuales sólo se cargan en la memoria cuando sea necesario. Por lo tanto, el formato de imagen hdf5 permite la visualización directa y rápida de los datos a través del BigDataViewer 33. También acelera el procesamiento ya que la carga de los archivos se lleva a cabo de manera más eficiente. Por lo tanto, se recomienda volver a guardar el conjunto de datos en este formato, aunque no es estrictamente necesario para el procesamiento. Para una explicación más detallada del formato de datos, por favor refiérase a Link 3 . Además, los conjuntos de datos pueden ser compartidos con colaboradores o al público mediante el BigDataServer 33 ( Enlace 6 ).
| llave | <td> efecto|
| F1 | muestra la Ayuda con una breve descripción de la BigDataViewer y su funcionamiento básico |
| <> O la rueda del ratón | movimiento en z |
| flechas arriba y abajo | acercar y alejar |
| botón derecho del ratón y arrastre | mueve la muestra en el visor |
| clic izquierdo y arrastre | gira en torno a la muestra el cursor |
| control deslizante en la parte inferior del visor o el tabulador y la flecha hacia la izquierda o hacia la derecha | mueve en el eje de tiempo |
| además, presionando shift | un movimiento más rápido o rotación a lo largo de cualquier eje |
| x y luego la flecha izquierda y derecha | gira alrededor del eje x |
| flecha Y y luego a la izquierda y la derecha | gira alrededor del eje Y |
| z y luego a la izquierda y flecha derecha | gira alrededor del eje z |
| turno y x | orienta la vista a lo largo del eje x |
| turno ey | orienta la vista a lo largo del eje Y |
| turno y z | orienta la vista a lo largo del eje z |
| yo | Cambia entre los diferentes modos de interpolación (es decir vecino más cercano) y trilineales |
| s o Ajustes> Brillo y contraste | modifica el color de los canales, brillo y contraste |
| F6 o Configuración> Visibilidad y agrupación | cambia los grupos que se muestran, permite agrupar a la superposición de diferentes grupos y llamando a los grupos a través de las teclas numéricas |
| F10 o Herramientas> grabación de película | adquiere una serie temporal de la división mostrada en ese momento |
Tabla 2: Big visor de datos.
3. Limitaciones de la aplicación descrita de LSFM
bajo rendimiento
En un experimento típico LSFM solamente se forma la imagen de una muestra por experimento. Aún así, en nuestra experiencia, una gran cantidad de información útil puede extraerse de esa sola muestra. Formación de imágenes de alto rendimiento de múltiples embriones se ha logrado recientemente en casa construida configuraciones LSFM 46-48, aunque normalmente a costa de la libertad de posicionamiento de la muestra y la rotación.
Insuficiente penetración profunda en los tejidos
A pesar de embriones de pez cebra son transparentes, la calidad de la imagen obtenida se deteriora rápidamente cuando se generan imágenes más profundo en el tejido debido a la dispersión y absorción. Parcialmente esto es un efecto de dispersión y absorción de la fluorescencia emitida por la muestra y no se puede corregir en la configuración actual. Otra fuente de la calidad de imagen uniforme es la iluminación irregular. Tél lámina de luz incide desde el lado izquierdo o derecho y cualesquiera objetos en su camino refractar, lo que da lugar a artefactos de la raya y la falta de definición. La iluminación y multivista de doble cara de fusión puede disminuir los artefactos en la imagen final. Por último, la calidad de la imagen tiende a ser ligeramente peor hacia el margen del campo de visión debido a la geometría natural de la lámina de luz, que es cada vez más gruesa hacia los bordes.
manipulación química limitada
El uso de fármacos o inhibidores está muy extendido en la investigación de pez cebra. En este uso del microscopio de fármacos se ve limitado, debido a la gran volumen de la cámara de muestras y las consideraciones de otros usuarios del instrumento, que comparten la misma cámara. El uso de una cámara adicional dedicado a experimentos con drogas puede resolver este problema. Llenado de la cámara parcialmente con perlas de vidrio reduce el volumen de líquido que se requiere.
sin photomanipulation
Currently no hay posibilidad de manipulación óptica localizada como fotoconversión, o ablación por láser en este microscopio. Sin embargo, las configuraciones de casa construida se pueden utilizar para tales aplicaciones específicas.
4. Las solicitudes de significación y futuras
LSFM es el mejor método disponible hasta la fecha para imágenes rápidas de grandes volúmenes de embriones vivos. La mayoría de los experimentos concebibles en un microscopio confocal también se puede realizar en un microscopio de lámina de luz con las ventajas antes mencionadas. En el caso de obtención de imágenes de desarrollo del ojo, la velocidad de LSFM no es el parámetro crucial. En cambio, la baja fototoxicidad y la flexibilidad en el posicionamiento de la muestra son las ventajas decisivas.
Los datos LSFM tienen una alta SNR, que ayuda a lograr buenos resultados de deconvolución y también es beneficioso para el análisis automatizado de imágenes y seguimiento de objetos. En conclusión, LSFM es una gran herramienta para la generación de datos cuantificables sobre el desarrollo embrionario y overall celular y las características del tejido para el modelado subsiguiente y descripciones físicas de los procesos en cuestión.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].
Materials
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 500 nm red fluorescent beads F-Y 050 | Millipore (Estapor) | 80380495 | |
| 20 μl (1mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
| Teflon tip plungers for 20 μl capillaries | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
| Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm | Thermo scientific (Menzel-Glaser) | ||
| O-rings for chamber windows 17×1.5 mm | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Tweezers, style 55 | Dumont | 0209-55-PO | |
| 50 ml Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 300865 | |
| 150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 397400 | |
| Links | |||
| Link 1 Multiview reconstruction application | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction | ||
| Link 2 BigDataViewer | https://github.com/bigdataviewer | ||
| Link 3 BigDataViewer | http://fiji.sc/BigDataViewer | ||
| Link 4 Multiview reconstruction application-issues | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues | ||
| Link 5 BigDataViewer-issues | https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues | ||
| Link 6 BigDataServer | http://fiji.sc/BigDataServer. |
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