Usando folha de luz microscopia de fluorescência para Imagem Desenvolvimento Zebrafish Eye
Summary
Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.
Abstract
Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions.
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.
Introduction
Morfogénese é o processo que molda o embrião e em conjunto com o crescimento e a diferenciação dirige a ontogenia a partir de um ovo fertilizado num organismo multicelular madura. Os processos morfogenéticos durante o desenvolvimento animal pode ser analisado melhor por imagem dos espécimes vivos intactos 1-3. Isto é porque tais imagiologia embrião inteiro preserva todos os componentes que conduzem e regulam o desenvolvimento, incluindo gradientes de moléculas de sinalização, matriz extracelular, vasculatura, inervação bem como as propriedades mecânicas do tecido circundante. Para colmatar as escamas, no qual a morfogénese ocorre, os eventos subcelulares rápidos tem que ser capturado numa escala de tempo minutos no contexto do desenvolvimento de todo o tecido ao longo de horas ou dias. Para cumprir todos estes requisitos, a aplicação moderna 4 do ortogonal microscópio avião iluminação 5 foi desenvolvido. Originalmente, ele foi nomeado o Selective Avião Illumination Microscopy (SPIM) 4; agora é um termo abrangente folha de luz microscopia de fluorescência (LSFM) é normalmente usado. LSFM permite imagens em resolução de tempo de alta, enquanto induz menos fototoxicidade de varredura a laser ou disco giratório microscópios confocal 6,7. Hoje em dia, já existem muitas implementações do princípio básico folha de luz de iluminação e que tem sido utilizado para a imagem uma grande variedade de amostras e os processos anteriormente inacessíveis aos investigadores 8-11.
Nós primeiro lugar gostaria de destacar várias vantagens importantes de LSFM sobre as abordagens de microscopia confocal convencionais:
Para obter resultados significativos a partir de imagens ao vivo experiências microscópicas, é importante que a observação afecta apenas minimamente a amostra. No entanto, muitos organismos, incluindo peixes-zebra são muito suscetíveis a exposição à luz laser, tornando-se um desafio para a imagem-los em um microscópio confocal com resolução temporal alta sem ef fototoxicidadefects como 6,7 desenvolvimento parado ou atrasado. LSFM é atualmente a técnica de imagem de fluorescência com o mínimo de efeitos perturbadores sobre a amostra 7. Uma vez que a folha fina de luz laser ilumina apenas a parte do espécime que é criada uma imagem num ponto de tempo específico, a folha de microscópio de luz é usando fótons de forma muito eficiente. Consequentemente, a exposição pouca luz permite observações de lapso de tempo mais longos de espécimes saudáveis, por exemplo, 12-17. Além disso, graças à capacidade de invasão mínima de LSFM, o número de imagens adquiridas já não é ditada pela quantidade de luz na amostra pode tolerar, mas sim pela quantidade de dados que podem ser processados e armazenados.
Na mesma linha de manter a amostra em condições fisiológicas perto, LSFM vem com a montagem de amostras estratégias alternativas bem adequado para embriões vivos. Em técnicas LSFM, os embriões são tipicamente incorporado dentro de uma coluna fina de baixa porcentagem de agarose. o mounting em cilindros de agarose permite a total liberdade de rotação, de modo que a amostra pode ser observado a partir do ângulo perfeito (em LSFM referido como vista) e a partir de vários pontos de vista simultaneamente. A imagem multiview e subsequente fusão multiview é benéfico especialmente para grandes amostras, espalhando e permite capturá-los com alta, resolução isotrópica. Um resumo das outras estratégias de montagem LSFM possíveis pode ser encontrada no manual de instruções do microscópio oficial, no capítulo sobre a preparação da amostra escrito pelo laboratório de E. Reynaud. É uma leitura recomendada, especialmente se o objetivo é imagem amostras diferentes do que o descrito aqui.
A aquisição de imagem em LSFM é um campo largo, baseado em câmera, ao contrário de varredura a laser do microscópio confocal. Isto resulta num sinal-para maior ruído (SNR) de imagens adquiridas e pode ser extremamente rápido (dezenas a centenas de quadros por segundo). A alta sensibilidade do LSFM ainda permite que imagens de samp fracamente fluorescenteles, como fatores de transcrição expressos em níveis endógenos 18 ou, no futuro próximo, proteínas endógenas marcado usando CRISPR / Cas9. A elevada SNR também é importante para a análise de imagem a jusante bem sucedida. A alta velocidade é necessário não só para capturar processos intracelulares rápidos, mas também a imagem de todo o embrião a partir de vários pontos de vista suficientemente rápido. A fusão perfeita dos múltiplos pontos de vista só pode ser alcançado, se o fenômeno observado não muda durante a aquisição destas várias pilhas z provenientes de pontos de vista distintos.
As vantagens de LSFM não normalmente vêm em detrimento da qualidade da imagem. A resolução lateral de LSFM é ligeiramente pior do que a resolução de um microscópio confocal. Isto é porque os objectivos de detecção utilizados em LSFM têm menor abertura numérica (normalmente 1,0 ou menos) em relação aos objectivos 1,2-1,3 de água ou imersão em silício configurações padrão confocal. Além disso, devido à ampla detecção de campo na LSFM (AbsenCE de um buraco de agulha), não há mais a luz para fora de foco em comparação com um microscópio confocal. A quantidade de luz fora do foco é determinada pela espessura da folha de luz. No entanto, estas desvantagens são compensadas pela maior SNR em LSFM. Na prática, isto resulta em imagens de qualidade semelhante em comparação com, por exemplo, girando disco de aquisição confocal 15. Consequentemente, isso permite a extração confiável de recursos como membranas celulares ou núcleos, por exemplo, para a linhagem celular de rastreamento 15,19.
A resolução axial da LSFM é determinada, para além do objectivo de detecção, pela espessura da folha de luz. A resolução axial pode LSFM em alguns casos, ultrapassar a resolução de microscópios confocal. Em primeiro lugar, a melhoria na resolução ocorre quando a folha de luz é mais fina do que a resolução axial da objectiva de detecção, o que ocorre tipicamente para grandes espécimes fotografada com uma objectiva de baixa ampliação. A segunda maneira, como o LSFM pode achIEVE melhor resolução axial, é a fusão multiview, em que a informação de alta resolução xy a partir de diferentes pontos de vista é combinado em uma pilha de imagens. A pilha fundida resultante tem uma resolução isotrópica aproximando-se dos valores de resolução no sentido lateral 20,21. A estratégia para registrar as múltiplas vistas para o outro descrito neste artigo é baseado no uso de esferas de poliestireno fluorescentes como marcadores fiduciárias embutidos na agarose em torno da amostra 20,21.
Como resultado da comercialização LSFM, esta técnica está agora disponível para uma ampla comunidade de cientistas 22. Portanto, a motivação para escrever este protocolo é o de tornar esta tecnologia acessível a biólogos do desenvolvimento sem experiência prática em LSFM e para obter estes cientistas começaram a usar essa tecnologia com suas amostras. Nosso protocolo usa o microscópio folha de luz comercial, o que constitui um microscópio conceitualmente simples tchapéu é fácil de operar. Gostaríamos, adicionalmente, gostaria de mencionar outros protocolos recentes para geração de imagens de peixe-zebra com configurações LSFM construídos em casa, o que pode ser adequado para responder a determinadas perguntas 23-25. Outra opção de entrada para LSFM são as plataformas abertas 26,27, que utilizam os princípios de acesso aberto para trazer microscopia folha de luz para uma comunidade mais ampla. A documentação, tanto do hardware e os aspectos de software podem ser encontradas em http://openspim.org e https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.
Neste protocolo, usamos o peixe-zebra teleósteos como um sistema modelo para estudar processos de desenvolvimento com LSFM. Morfogênese do olho de peixe-zebra é um exemplo que sublinha muitos dos benefícios de LSFM. LSFM já tenha sido utilizado no passado para investigar o desenvolvimento do olho em medaka 28 e no peixe-zebra 29,30. Na fase inicial de desenvolvimento do olho é complicado para orientar correctamente o embrião para microscopia convencional,como a gema de volumoso não permite que o embrião para deitar de lado com o olho voltado para o objetivo. No entanto, com LSFM de montagem para uma coluna de agarose, a amostra pode ser posicionado de forma reprodutível. Além disso, durante a transição da vesícula óptica com a fase cálice óptico, o olho sofre grandes rearranjos morfogenéticas acompanhados de crescimento, o que requer a captura de um grande pilha Z e um grande campo de visão. Também para estes desafios LSFM é superior à imagem confocal convencional. O processo de formação cálice óptico é tridimensional, portanto, é difícil de compreender e visualizar apenas pela imagem de um ponto de vista. Isso faz com que imagem multiview com resolução isotrópica benéfico. Após a formação do cálice óptico, a retina torna-se cada vez mais sensíveis à exposição a laser. Assim, a baixa fototoxicidade associada com LSFM é uma grande vantagem para a imagem latente a longo prazo.
Aqui apresentamos um protocolo otimizado para a imagem latente de um a três dias de peixe-zebra de idade embriões alarvas nd com foco no desenvolvimento do olho. Nosso método permite a gravação de filmes de lapso de tempo, cobrindo até 12-14 h com alta resolução espacial e temporal. Importante, que também mostram uma conduta para o processamento de dados, que é um passo essencial na LSFM, como esta técnica gera invariavelmente grandes conjuntos de dados, frequentemente na gama de terabytes.
Protocol
Representative Results
Discussion
1. As etapas críticas e solução de problemas para a aquisição de dados
As configurações de imagem típicos para uma GFP e RFP expressando amostra pode ser encontrada na Tabela 3. No microscópio configuração descrita a folha de luz é estático, formada por uma lente cilíndrica. Os dois objectivos de iluminação são lentes de ar e o objetivo de detecção é uma lente de água-dipping. Aumentar com 20X 1,0 / 1,0 ou 40X / 1.0 objectivos dá 230 nm e 115 nm, tamanho de pixel e um campo de vista de 441 x 441 x 221 uM ou 221 uM, respectivamente. Recomenda-se usar a espessura folha de luz padrão com o centro para as bordas proporção de 1: 2. Para 20X / 1.0 esta espessura corresponde a 4,5 uM e para 40X / 1,0-3,2 uM no centro. Se a velocidade de imagem não é a prioridade primária, usar faixas separadas no caso de uma amostra multicolor para evitar a interferência de emissão de fluorescência entre os canais. A maior velocidade de aquisição é limitada a 50 ms por z passo pelavelocidade de movimento do z-piloto. Se o objectivo é atingir a velocidade máxima de imagem no caso de, por exemplo, duas faixas com iluminação de dupla face, o tempo de exposição deve ser definido de modo que a soma de todas as imagens obtidas por Z etapa é abaixo de 50 mseg. Por outro lado, se apenas uma única imagem é adquirida por Z passo, não é benéfico para definir o tempo de exposição mais curto do que 50 ms.
| tamanho 1920 x 1920 imagem |
| 16 bits |
| Pivot digitalizar na |
| iluminação de dupla face com a fusão on-line |
| 10X objetivo / 0,2 iluminação |
| 20X objetivo de detecção / 1.0 W Plan-Apochromat |
| Pista 1: Excitação 488 nm, tipicamente de 2% dos 100 mW do laser, 550 nm filtro de emissão SP |
| Faixa 2: Excitação 561 nm tipicamente 3% de 75 a laser mW, 58filtro de emissão de 5 nm LP |
| Tempo de exposição até 100 ms |
| espessura de resma Z 50-100 mm |
| 1-1,5 mm tamanho z etapa no modo de z unidade contínua |
| A incubação a 28,5 ° C |
Tabela 3: Geração de Configurações.
Inspecionando a amostra após o experimento
É importante assegurar que a amostra ainda está saudável no final da experiência. Como uma primeira leitura, verificar o batimento cardíaco do espécime sob um estereoscópio. Com um par de pinças cortantes, a amostra pode ser levado para fora da agarose e transferidos para a incubadora de continuar a desenvolver, a fim de verificar se ele foi afectada pela imagiologia. Alternativamente, ele pode ser fixado para a coloração do anticorpo.
Montagem e deriva
É essencial para manter a osmolaridade do s câmaraOlution perto da osmolaridade da incorporação de agarose, caso contrário, inchaço / encolhimento da agarose e subsequente instabilidade da amostra vai ocorrer. Portanto, use a mesma solução (médio E3 sem azul de metileno) para encher a câmara e para preparar as alíquotas ponto de agarose a 1% de baixo ponto de fusão. Além disso, não deixe a agarose no 70 ° bloco de aquecimento C por mais de 2 horas, uma vez que podem perder suas propriedades gelificantes.
Não incorpore o peixe em agarose quente demais, pois isso pode levar a resposta ao choque térmico ou morte do embrião. Se não tiver certeza sobre o efeito de agarose quente sobre os embriões, verifique se a cauda não se dobra e que a frequência cardíaca não abrandar. Se isto ocorrer, usar um embrião diferentes para a experiência.
Manter o comprimento total da coluna de agarose com a amostra curto (cerca de 2 cm) e montar o peixe-zebra com a cabeça orientada para a ponta do êmbolo. Da mesma forma, o cilindro de agarose extrudido do capillary deve ser mantido o mais curto possível. Estas medidas irão garantir a estabilidade da amostra durante todo o filme. Ao mesmo tempo, a coluna de agarose deve ser suficientemente longo para que o próprio capilar de vidro não atingir no caminho da luz, como esta causaria maior refracção e reflexão.
O desvio inicial da amostra é causado pelas alterações no volume do próprio cilindro de agarose. Deslizamento do êmbolo não é a razão para isso. Portanto, isso não ajuda a fixar o êmbolo com plasticina ou unha polonês. O embrião pode mudar a sua posição durante o filme, devido ao seu crescimento natural também. Por conseguinte, é aconselhável para o centro da região de interesse no meio do campo de vista e manter algum espaço nas extremidades para acomodar esses movimentos.
quantidade reduzida de meio de incorporação no caminho da luz
Orientando a amostra corretamente ajuda a alcançar a melhor qualidade de imagem possível 15. Generali, excitação e emissão de luz deve viajar através de tão pouco tecido e meios de montagem possível. A solução ideal é a montagem de agarose-free. Isto foi conseguido, por exemplo, em uma instalação para geração de imagens de Arabidopsis raízes laterais 14, em que a raiz principal foi montado em Phytagel e as raízes laterais foram subsequentemente deixar a crescer para fora da coluna de gel completamente. Montagem sem-agarose foi também desenvolvido para a imagem latente da embriogênese completa de Tribolium do besouro em dois dias 12. melhora a qualidade da imagem não era a principal motivação nesse caso. embriões Tribolium simplesmente não sobrevivem dentro do agarose tempo suficiente. Uma montagem sem meios absolutamente incorporação não foi alcançado para a imagem latente a longo prazo em peixes-zebra. Ainda assim, podemos tirar vantagem do facto de que quando os solidifica de agarose, a maioria dos embriões estão posicionados na diagonal no capilar com uma ocular localizada no fundo da agarose e o segundo olho estar perto da superfície da coluna de embebimento. Tele olho mais próximo à superfície proporciona uma qualidade de imagem superior e, portanto, deve ser trabalhada preferencialmente.
concentração de agarose e imagiologia de longo prazo
A concentração de agarose para a montagem é um compromisso entre a estabilidade da amostra e a possibilidade de acomodar o crescimento do embrião e difusão do oxigénio a ele. Não há nenhum ganho adicional na estabilidade da amostra quando se utiliza concentrações de agarose superiores a 1%. Como ponto de partida para a optimização das experiências recomendamos 0,6% de agarose, que também é adequado para os embriões mais jovens do que 24 HPF que são muito delicado para ser montado em 1% de agarose. Para anestesiar os embriões mais velhos e larvas, a concentração de MS-222 pode ser aumentada para 200 ug / ml, sem efeitos laterais 13.
No caso de embriões em desenvolvimento são gravadas por mais de ± 12 hr, a montagem de agarose não é recomendado, porque restringe o crescimento do embrião e causES cauda deformação. Este problema foi resolvido por peixe-zebra através da montagem de embriões em tubos de polímero de FEP com índice de refração semelhante ao regar 13,39. Embriões de ratinho, por outro lado, pode ser imobilizada em agarose cilindros ocos 40 ou em furos de uma haste de acrílico ligado a uma seringa 41. FEP montagem em tubo não é recomendada como método padrão no entanto, porque a parede do tubo reflecte a luz ligeiramente mais de agarose.
alinhamento folha de luz
Para uma boa qualidade de imagem é fundamental para realizar o alinhamento folha de luz automático antes de cada experimento. Especialmente se as definições de zoom foram alteradas, os objectivos foram tiradas, ou um líquido diferente foi usado na câmara.
Iluminação
A digitalização pivot da folha de luz deve ser sempre activado. Para grandes amostras de dispersão, é necessário aplicar a iluminação de dupla face com f on-lineusion para conseguir uma iluminação uniforme em todo o campo de vista. iluminação de dupla face diminui também um problema específico da imagem do olho, que é a refracção da folha de luz recebida pela lente do embrião. , espécimes de espalhamento menos menores podem ser eficientemente fotografada usando iluminação de um único lado, o qual encurta o tempo de imagiologia por meio e pode resultar em pouco melhor qualidade da imagem em comparação com a iluminação de dupla face. Isto é porque os percursos de luz para os dois braços de iluminação são sempre diferentes e a uma mais eficiente pode ser escolhido. Além disso, as duas folhas de luz provenientes de cada lado nunca está perfeitamente no mesmo plano, o que provoca ligeira desfocagem após a fusão. Para eventos intracelulares muito rápido, como os microtúbulos crescimento (Filme 2), a iluminação de dupla face não é apropriado, uma vez que as imagens com iluminação de esquerda e direita são adquiridos sequencialmente, o que poderia resultar no borrão de movimento.
fotodegradaçãoe fototoxicidade
Menos fotobranqueamento fluoróforo é muitas vezes mencionado como uma vantagem principal do LSFM. Poderíamos argumentar que o objetivo não deve ser fotodegradação em tudo. Se houver fotodegradação perceptível na experiência de imagem ao vivo, o espécime é, provavelmente, já está fora de sua faixa fisiológica de exposição à radiação laser tolerado. Quando imagiologia os embriões de peixe-zebra no microscópio disco giratório, em nossa experiência, alta fototoxicidade pode parar o desenvolvimento do embrião, mesmo antes de os branqueadores de sinais fluorescentes acentuadamente. Portanto, as configurações de imagem no LSFM deve ser ajustada de modo que pouco ou nenhum fotobranqueamento é observado. Mesmo que LSFM é suave para a amostra, é prudente usar apenas a quantidade de tempo a potência do laser e da exposição, conforme necessário para alcançar uma relação sinal-ruído suficiente para a análise de dados subsequente.
Z-stack, intervalos de tempo e tamanho de dados
Os arquivos gerados pelo LSFM são geralmente muito grande; às vezes na faixa terabyte. Muitas vezes, é necessário fazer um compromisso entre qualidade de imagem e tamanho de dados. Este é particularmente o caso para z espaçamento das pilhas e intervalos nas aquisições de lapso de tempo. Para definir os intervalos de Z, o botão óptimo no separador ferramenta Z-pilha devem, idealmente, ser utilizada, especialmente se o conjunto de dados será deconvolved mais tarde. Ele calcula o espaçamento para alcançar 50% de sobreposição entre fatias ópticos vizinhos. Ainda assim, um pouco maiores intervalos z são geralmente aceitáveis. Eles reduzem o tempo necessário para adquirir a pilha Z, bem como o tamanho do ficheiro final. O tempo óptimo de amostragem depende do processo de interesse. Por olho geral intervalos desenvolvimento 5-10 min são geralmente aceitável. Se algumas estruturas estão a ser automaticamente rastreadas, os pontos de tempo subsequentes deve ser suficientemente semelhante.
As contas fluorescentes
partículas fluorescentes servem principalmente como marcadores fiduciais para registrar pontos de vista diferentesde um conjunto de dados multivista uns sobre os outros. Sempre vortex as soluções talão antes de usar. Não aquecer os grânulos como esta pode levar à perda do corante fluorescente. A concentração ideal do grânulo para o registo multivista tem que ser determinada experimentalmente. O plugin descrito funciona melhor com cerca de 1.000 contas de detectados ao longo de cada vista. Maiores (500 nm ou 1000 nm) grânulos são detectados de forma mais enérgica do que menores (menos de 500 nm) esferas. Isto é porque os grânulos maiores são mais brilhantes e são mais fáceis de segmento sem detecções falsas positivas de estruturas presentes na amostra. A desvantagem das contas maiores é que eles são muito proeminentes na imagem fundida e deconvolved final. Para cada novo marcador fluorescente, o tamanho do grânulo e a emissão de fluorescência apropriado tem que ser optimizado. Para dar um exemplo de amostra a partir da Figura 5 e do filme 3, 100 nm de emissão grânulos verdes deu muitas detecções falsas positivas no canal de membrana-GFP, mas n 1000grânulos de emissão vermelha m foram robustamente detectado no canal H2B-RFP com muito poucas detecções positivas dentro da amostra. Se falhar a detecção do grânulo no canal com o marcador fluorescente, um canal separado contendo apenas grânulos podem ser adquiridos, mas este não é muito prática. Os grânulos de tamanho sub-resolução dar uma leitura directa da função de dispersão (PSF) do microscópio, o qual pode ser utilizado para desconvolução (Figura 2C-D). Se o registo e fusão funciona melhor com grânulos maiores (por exemplo, 1.000 nm), uma imagem separada do PSF podem ser adquiridos com o sub-resolução, por exemplo, 100 nm esferas. Usando grânulos multicolor é útil durante o registo de aquisição multicanal e por verificar que a sobreposição de canais perfeitamente.
A adição de partículas fluorescentes não é necessário quando imagiologia de uma única visão sem registro multiview posterior e fusão. No entanto, mesmo nos casos em que os grânulos podem ser úteis durante a Initial ajuste folha de luz para verificar a qualidade da folha de luz e, em geral, para revelar as aberrações ópticas. Tais aberrações ópticas podem ser provenientes de várias fontes, como objetivos danificadas ou sujas, janelas sujas da câmara ou falta de homogeneidade na agarose. Contas também pode ser usado para a correção de deriva pelo registo multiview Fiji plug-in 20.
Multiview
Para efeitos de reconstrução multiview, é melhor para adquirir um número ímpar de visualizações 3, 5 e assim por diante, que não são opostos entre si. Isso melhora a deconvolução desde os PSFs são gravadas a partir de diferentes direções. Também é importante para confirmar no início da aquisição do lapso de tempo que não é suficiente sobreposição entre os pontos de vista. Este é o melhor feito de forma empírica, ou seja, imediatamente confirmando que as vistas no primeiro ponto de tempo pode ser registrado com êxito. Quando o objetivo da aquisição multiview é aumentar a resoluçãode uma imagem de um grande espécime de espalhamento, não é aconselhável a imagem inteira da amostra em cada ponto de vista, mas para parar em torno do centro da amostra, em que o sinal se deteriora. A aquisição de baixa qualidade a partir da segunda metade da amostra não acrescentaria informações úteis para a reconstrução multiview.
2. As etapas críticas e solução de problemas para o processamento de dados
Actualmente, existem diversas possibilidades para o processamento de dados a partir de um microscópio multivistas folha de luz que estão bem documentados e relativamente fáceis de adoptar. Nós usamos a aplicação reconstrução multiview, que é um software de código aberto implementada em Fiji 32 (Stephan Preibisch inédito, Ligação 1a e Link1b na Lista de Materiais). Este plugin é uma grande reformulação do SPIM anterior plug-in de registro 20, revisadapor Schmied et al. 42, integrando o formato HDF5 33 com o fluxo de trabalho de registro SPIM (Figura 1B, BigDataViewer e seu XML e Link 2 , ligação 3 ). Esta aplicação pode também ser adaptado para cluster de computação de alto desempenho, o que acelera significativamente o processamento de 43. Este pedido de registro multiview está ativamente desenvolvido e continua melhorando. Em caso de problemas ou pedidos de funcionalidades para o software descrito, envie questões sobre as respectivas páginas GitHub ( Fazer a ligação 4 para Multiview Reconstrução e Fazer a ligação 5 para BigDataViewer).
A segunda opção é usar o software comercial disponível em conjunto com o microscópio. Esta solução funciona bem e emprega o mesmo princípio da utilização de partículas fluorescentes para registrar os diferentes pontos de vista. No entanto, ela não tem a opção de visualizar todo o conjunto de dados rápido como com o BigDataViewer. Além disso, o software não pode ser adaptada ao cluster e, além disso, os blocos de processamento do microscópio para outros utilizadores, a menos que licença adicional para o software é comprado.
A terceira opção, que também é um software de código aberto, foi recentemente publicado pelo laboratório de Keller 44 e fornece um quadro abrangente para processamento e análise a jusante dos dados folha de luz. Este software está a utilizar informações a partir de dentro da amostra para realizar a fusão multivista, por conseguinte, não requer a presença de partículas fluorescentes à volta da amostra. Mas, ao mesmo tempo que assume a orientação ortogonal dos planos de corte (objetivos), de modo que não pode ser usado para dados adquiridos a partir de ângulos arbitrários 44.
Os requisitos de hardware
ntent "> O hardware utilizado para o processamento podem ser encontradas na Tabela 4. Tem que haver capacidade de armazenamento suficiente e um oleoduto claro para o processamento de dados disponíveis, antes da experiência real. aquisição das imagens é mais rápido do que a análise subsequente e é fácil para se inundado com dados não processados. Muitas vezes, é irrealista para armazenar todas as imagens cruas, mas sim uma versão colhida ou imagens processadas como vistas fundidas, projeções de intensidade máxima ou projeções esféricas 45.| Processador | Dois processadores Intel Xeon E5-2630 (Six Core, 2.30 GHz Turbo, 15 MB, 7.2 GT / s) |
| Memória | 128 GB (16 × 8 GB) 1600 MHz DDR3 ECC RDIMM |
| Disco rígido | 4 × 4 TB Serial ATA de 3.5 polegadas (7.200 rpm) Hard Drive |
| HDD controlador | PERC H310 SATA / SAS Controller para Dell Precision |
| Configuração HDD | C1 SATA de 3,5 polegadas, 1-4 discos rígidos |
| Gráficos | Dual 2 GB NVIDIA Quadro 4000 (2 cartões w / 2 DP & 1 DVI-I cada) (2 DP-DVI e 2 adaptador DVI-VGA) (MRGA17H) |
| Rede | Intel X520-T2 de porta dupla 10 GbE Network Interface Card |
Tabela 4: Requisitos de hardware.
velocidade de processamento de dados
O tempo necessário para o processamento de dados depende das dimensões dos dados e do hardware utilizado. Na Tabela 1, apresentamos uma visão geral do tempo necessário para os principais passos no processamento de um exemplo 8.6 GB multiview conjunto de dados que consistia em 1 ponto de tempo com 4 pontos de vista e 2 canais.
| processamento step | Tempo | etapa Protocolo |
| Salve novamente como HDF5 | 6 min 30 seg | 6.3 |
| Detectar Pontos de Interesse | 20 seg | 6.4 |
| Cadastre-se o uso de pontos de interesse | 3 seg | 6.5 |
| fusion multiview baseada em conteúdo | 4 hr | 7.2 |
| deconvolução Multiview (CPU) | 8 hr | 7.3 |
| deconvolução Multiview (GPU) | 2 hr | 7.3 |
Tabela 1: Dados tempo de processamento.
formatos de dados de entrada para a reconstrução multiview
O Fiji Plugin Multiview Reconstrução pode suportar .czi, .tif e formatos ome.tiff. Devido à estrutura de dados do formato .czi, conjuntos de dados não são descontínuossuportado sem pré-tratamento. Descontínua significa que a gravação teve de ser reiniciado (por exemplo, para reajustar as posições devido à deriva da amostra). Neste caso, os ficheiros .czi precisa ser resaved como tif. Para .tif cada visão e direção de iluminação precisa ser salva como um arquivo separado.
A calibração do tamanho do pixel
O software calcula microscópio de operação de calibração para o tamanho do pixel XY com base no objectivo seleccionado. No entanto, o tamanho do pixel em Z é independentemente definido pelo tamanho do passo. Se um objetivo errado está especificado no software do xy à relação z é incorreto e o registro falhará.
O registro inicial
Depois de definir o conjunto de dados o número de inscrições será 1 eo número de pontos de interesse será 0 no ViewSetup Explorer. O registro inicial representa a calibração do conjunto de dados. Tanto o número oinscrições f e pontos de interesse vai aumentar durante o processamento.
Abaixo de amostragem para detecção de pontos de interesse
Utilizando-se a amostragem é recomendada, uma vez que o carregamento dos ficheiros e a segmentação será muito mais rápido. No entanto, é importante notar que os parâmetros de detecção vai mudar dependendo da amostragem para baixo, transferindo assim definições de detecção entre diferentes configurações para baixo da amostra não é possível.
A detecção de pontos de interesse
É aconselhável segmento como muitas pérolas verdadeiras quanto possível em cada ponto de vista, mesmo ao preço de obtenção de algumas detecções de falsos positivos, porque eles não dificultar consideravelmente o registro. detecções falsas, se poucos em números, são excluídos durante o registro (Veja Registro de pontos de interesse). No entanto, enormes detecções falsas positivas representar um problema para o algoritmo. Ele não só reduz o desempenho da detecção eo registro, uma vez que leva muito mais tempo para o segmento de imagem, bem como comparar essas contas entre os pontos de vista, mas também reduz a precisão do registro. Este pode ser tratado usando os parâmetros de detecção mais rigorosas. Além disso, sobre a segmentação dos grânulos (isto é, detecções múltiplas sobre um grânulo Figura 1E) é prejudicial para o registo e deve ser evitado.
Registro de pontos de interesse
Para registrar as vistas para o outro, a localização de cada talão em cada exibição é descrita por sua posição em relação às suas três esferas vizinhos mais próximos. Essas constelações estão formando um descritor geométrica local e permitem comparar cada grânulo entre os pontos de vista. Beads combinando com descritor entre dois pontos de vista são então consideradas como correspondências candidatos. Note que isto só funciona para grânulos distribuídos aleatoriamente, para os quais os descritores locais normalmente são exclusivos para cada talão.Pode-se usar outras estruturas, tais como núcleos na amostra para registro. No entanto, a fim de detectar os núcleos, que são distribuídas aleatoriamente para não na amostra, outros métodos aplicáveis 20,21.
As correspondências candidatos são então testados contra RANSAC 36, a fim de excluir os falsos positivos. Cada correspondência é que sugere um modelo de transformação para sobrepor as vistas para o outro. correspondências verdadeiras provavelmente concordam em um modelo de transformação, enquanto que valores discrepantes faria cada ponto para um diferente. Os verdadeiros correspondências são então utilizados para calcular um modelo de transformação afim entre as duas vistas comparados. A otimização global com um algoritmo de otimização iterativo é então realizada, durante o qual todos os pontos de vista são registrados na primeira vista com o objectivo de deslocamento mínimo entre as visões 20,21.
Registro de Time-lapse
Devido a movermento do movimento do motor de agarose e imprecisa da platina do microscópio, a posição de cada pilha varia moderadamente ao longo do tempo. Considerando que o registo do ponto de tempo individual remove a diferença entre os pontos de vista deste ponto de tempo, o lapso de tempo também precisa ser registrado como um todo. Para este efeito, cada ponto de tempo indivíduo é registado para o ponto de tempo de referência.
ponto de tempo de referência
Se uma série temporal com muitos pontos de tempo é processado, um ponto de tempo representativo é seleccionado como referência geralmente a partir do meio das séries de tempo uma vez que as intensidades de grânulo podem degradar ao longo do tempo devido ao branqueamento. Nesta referência, podem ser determinados os parâmetros para detecção de pontos de interesse, o registo, a caixa delimitadora e fusão. Estes parâmetros são, em seguida, aplicada a todo o lapso de tempo para calcular um modelo de transformação específica para cada ponto de tempo individual. Durante o registro de lapso de tempo todos os outros pontos de tempo são também registrado espacialmente até este ponto de tempo de referência. Assim, os parâmetros da caixa delimitadora para toda a gravação estão dependendo de este ponto de tempo específico.
registro de multicanal
Quando imagiologia múltiplos canais, de preferência as mesmas partículas fluorescentes deve ser visível em todos os canais com imagens. A detecção e o registo pode então ser realizada em cada canal individualmente, o que leva em conta a influência dos diferentes comprimentos de onda de luz sobre a transformação. Muitas vezes, isto não é possível, porque os grânulos não são visíveis em todos os canais ou os grânulos são domina a imagem muito em um canal e são muito fraca no outro canal (s). A solução típica é a utilização de grânulos visíveis apenas em um canal para a detecção e registo e o modelo de transformação adquirida (ou seja, após a detecção, registo e registro de lapso de tempo) é então aplicada a outros canais de Fiji> Plugins> Multiview Reconstruction> Processamento em lote> Ferramentas> duplicados Transformations. No menu drop-down para aplicar a transformação de selecionar um canal para outros canais. Na janela seguinte, selecione o XML e clique em OK. Em seguida, selecione o canal que contém as contas como canal Fonte e como canal alvo selecionar o canal (s) sem esferas. Para Duplicate que transformações usar Substituir todas as transformações e pressione OK. As transformações são depois copiados para todos os outros canais e salvo no XML. Para ver as novas transformações na ViewSetup Explorer, reiniciar o Aplicação de Reconstrução MultiView.
caixa delimitadora
A fusão de vários pontos de vista é computacionalmente muito intensiva. No entanto, grandes imagens são normalmente adquiridas a acomodar não só a amostra, mas também os grânulos em torno dele. Uma vez que o parâmetro de registos são extraídos a partir das pérolas, elas já não são úteis como parte da imagem. Por conseguinte, para aumentar a eficiência da fusão, apenas as partes das pilhas de imagens contendo a amostra deve ser fundidos em conjunto. Uma região de interesse (caixa delimitadora) deve ser definido para conter a amostra e tão pouco da agarose circundante quanto possível. Para o exemplo na Figura 2 uma fusão média ponderada em todo o volume com 2229 × 2136 × 2106 px exigiria 38,196 MB de RAM, enquanto que com uma caixa delimitadora o volume é reduzido para 1634 × 1746 × 1632 px e os requisitos de memória são reduzidos para 17,729 MB.
fusion multiview baseada em conteúdo
O desafio de fundir dados multiview é que os pontos de vista geralmente terminam abruptamente e não contêm a mesma qualidade de imagem para os mesmos voxels. média simples dos pontos de vista, portanto, levar a mistura artefatos e degradação da imagem desnecessário. fu multiview baseada em conteúdo Sion leva esses dois problemas em consideração. Primeiro, ele combina os diferentes pontos de vista, onde uma imagem termina ea outra começa e, segundo, que avalia a qualidade de imagem local e aplica pesos mais elevados para maior qualidade de imagem na fusão 21. Em comparação com um único ponto de vista não é uma melhoria da resolução em Z com uma ligeira degradação do sinal em XY (Figura 2E-H, A Figura 5A-D).
Multiview deconvolução
desconvolução multivista é uma outra abordagem para conseguir a fusão dos pontos de vista. Com este método também as PSFs dos diferentes pontos de vista são tomadas em consideração, a fim de recuperar a imagem que foi convolvido pelo sistema óptico do microscópio. Este método melhora drasticamente a qualidade de imagem através da remoção de desfocagem da imagem e aumentando a resolução e contraste do sinal 31 (Figura 2C-D, Figura 2I-J, Figura 5E-G, Filme 3).
ve_content "> Deconvolution é computacionalmente muito intensiva (ver Tabela 1), utilizando-se, assim, uma GPU para processamento aumenta a velocidade deste processo. Também pode ser necessário realizar a deconvolução em dados abaixo amostrados. Para amostra para baixo, use Fiji> Multiview Reconstrução > Processamento em lote> Ferramentas> aplicar transformações. Isto irá aplicar um novo modelo de transformação sobre os pontos de vista que serão guardados no arquivo .xml.formato de arquivo HDF5 para BigDataViewer e BigDataServer
O BigDataViewer 33 permite fácil visualização de dados de terabytes,. Como controlar o BigDataViewer é resumido na Tabela 2. Um screencast da operação básica do programa também está disponível como um suplemento na sua publicação original 33. O BigDataViewer está centrada num ficheiro XML, que contém os metadados, e um ficheiro hdf5, que contém os dados de imagem. Os dados de imagem são present na hdf5 em níveis de resolução múltiplas em blocos 3D. Os níveis de resolução múltiplos permitem visualizar os dados mais rapidamente com resolução mais baixa, antes da resolução total é carregado. blocos individuais só são carregados na memória quando necessário. Assim, o formato de imagem hdf5 permite a visualização direta e rápida dos dados através do BigDataViewer 33. É também acelera o processamento uma vez que o carregamento dos ficheiros é realizada de forma mais eficiente. Portanto, recomendamos resaving o conjunto de dados para este formato, embora não seja estritamente necessário para o processamento. Para obter mais explicações sobre o formato de dados, consulte a ligação 3 . Além disso, os conjuntos de dados podem ser compartilhados com colaboradores ou ao público utilizando o BigDataServer 33 ( Ligação 6 ).
| chave | <td> efeito|
| F1 | Mostra a ajuda com uma breve descrição do BigDataViewer e sua operação básica |
| <> Ou roda do mouse | Z em movimento |
| cima e para baixo seta | zoom in e out |
| Botão direito do mouse e arraste | move amostra no visualizador |
| clique esquerdo e arraste | gira amostra em torno do cursor |
| controle deslizante na parte inferior do visualizador ou Tab e seta para a esquerda ou para a direita | movimentos no eixo do tempo |
| Além disso pressionando shift | movimento mais rápido ou rotação em qualquer eixo |
| x e flecha, em seguida, esquerda e direita | gira em torno do eixo x |
| seta y e depois à esquerda e à direita | gira em torno do eixo y |
| z e depois à esquerda e seta para a direita | gira em torno do eixo Z |
| turno e x | orienta a vista ao longo do eixo x |
| turno e y | orienta a vista ao longo do eixo y |
| turno e z | orienta a vista ao longo do eixo z |
| Eu | alterna entre os diferentes modos de interpolação (ou seja, vizinho mais próximo e trilineares) |
| s ou Configurações> Brilho e Contraste | modifica a cor do canais, brilho e contraste |
| F6 ou Configurações> Visibilidade e agrupamento | muda os grupos apresentados, permite o agrupamento de sobreposição de grupos diferentes e chamando os grupos através das teclas numéricas |
| F10 ou Ferramentas> Gravar filme | adquire uma série de tempo da fatia exibida atualmente |
Tabela 2: Big Data Viewer.
3. Limites da aplicação descrita de LSFM
baixa taxa de transferência
Em um experimento LSFM típico só uma amostra por experiência é trabalhada. Ainda assim, na nossa experiência, a uma grande quantidade de informação útil pode ser extraído daquela única amostra. Imagem de elevado rendimento de várias embriões foi recentemente conseguida em casa construída configurações LSFM 46-48, embora normalmente à custa de liberdade de posicionamento da amostra e rotação.
penetração profunda insuficiente para os tecidos
Apesar de embriões de peixe-zebra são translúcidas, a qualidade da imagem obtida é deteriorar-se rapidamente quando imagiologia mais profundo no tecido devido à dispersão e absorção. Parcialmente isto é um efeito de dispersão e absorção da fluorescência emitida pela amostra e não pode ser corrigida na configuração corrente. Outra fonte de a qualidade da imagem irregular é a iluminação irregular. Tele folha de luz é incidente a partir do lado esquerdo ou direito e quaisquer objetos em seu caminho refratam-lo, o que resulta em artefatos da listra e borrão. A iluminação e multiview fusão de dupla face pode diminuir os artefatos na imagem final. Por último, a qualidade da imagem tende a ser um pouco pior no sentido da margem do campo de visão, devido à geometria natural da folha de luz, que é cada vez mais espessa em direcção as bordas.
manipulação química limitada
O uso de drogas ou inibidores é generalizada na investigação peixe-zebra. Neste uso de microscópio de drogas é limitado, devido ao grande volume da câmara de amostra e considerações de outros usuários do instrumento, que partilham a mesma câmara. Usando uma câmara adicional dedicada a experimentos com drogas pode resolver este problema. Enchendo a câmara parcialmente com esferas de vidro reduz o volume de líquido que é necessária.
Sem photomanipulation
Currently não há nenhuma possibilidade de manipulação óptica localizada como fotoconversão, ou ablação a laser no presente microscópio. No entanto, casa construída configurações podem ser usadas para tais aplicações específicas.
4. Os pedidos de significado e futuros
LSFM é o melhor método disponível no momento para a imagem latente rápida de grandes volumes de embriões vivos. A maioria das experiências concebíveis em um microscópio confocal também pode ser realizada em um microscópio de luz com folha vantagens acima mencionadas. No caso da imagiologia de desenvolvimento do olho, a velocidade de LSFM não é o parâmetro crucial. Em vez disso, a baixa fototoxicidade e flexibilidade no posicionamento da amostra são os benefícios decisivos.
Os dados LSFM têm um elevado SNR, o que ajuda a conseguir bons resultados de desconvolução e também é benéfico para análise de imagem automatizado e seguimento de objectos. Em conclusão, LSFM é uma grande ferramenta para a geração de dados quantificáveis sobre o desenvolvimento embrionário e overacelular ll e as características do tecido para a modelagem subseqüente e descrições físicas dos processos em questão.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].
Materials
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 500 nm red fluorescent beads F-Y 050 | Millipore (Estapor) | 80380495 | |
| 20 μl (1mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
| Teflon tip plungers for 20 μl capillaries | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
| Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm | Thermo scientific (Menzel-Glaser) | ||
| O-rings for chamber windows 17×1.5 mm | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Tweezers, style 55 | Dumont | 0209-55-PO | |
| 50 ml Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 300865 | |
| 150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 397400 | |
| Links | |||
| Link 1 Multiview reconstruction application | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction | ||
| Link 2 BigDataViewer | https://github.com/bigdataviewer | ||
| Link 3 BigDataViewer | http://fiji.sc/BigDataViewer | ||
| Link 4 Multiview reconstruction application-issues | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues | ||
| Link 5 BigDataViewer-issues | https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues | ||
| Link 6 BigDataServer | http://fiji.sc/BigDataServer. |
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