이미지 Zebrafish의 눈 개발에 가벼운 시트 형광 현미경을 사용하여
Summary
Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.
Abstract
Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions.
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.
Introduction
형태 형성은 배아 모양과 함께 성장 및 분화와 성숙 다세포 유기체로 수정란에서 개체 발생을 구동하는 과정입니다. 동물 개발하는 동안 형태 발생 과정은 그대로 살아있는 표본 1-3의 이미지로 최고의 분석 할 수 있습니다. 이러한 전 배아 촬상 이용시 시그널링 분자의 기울기, 세포 외 기질, 혈관, 신경 분포뿐만 아니라 주변 조직의 기계적 특성을 포함한 현상을 조절하는 모든 부품을 유지하기 때문이다. 형태 형성이 발생하는 비늘, 다리, 빠른 세포 내 사건은 시간 또는 며칠에 걸쳐 전체 조직의 발달의 맥락에서 미소 시간 스케일에 캡처되어야한다. 이러한 모든 요구 사항을 충족하기 위해 직교 평면 조명 현미경 (5)의 현대적인 구현 (4)는 개발되었다. 원래, 그것은 선택적 평면 조명 현미경 (SPI 지명되었다M) 4; 이제 모든 것을 포함하는 용어 가벼운 시트 형광 현미경 (LSFM)이 일반적으로 사용된다. 레이저 스캐닝 또는 회전하는 디스크 공 초점 현미경 6,7보다 광독성을 유도하면서 LSFM 높은 시간 해상도로 촬영을 할 수 있습니다. 요즘이 이미 기본적인 광 시트 조명의 원리의 많은 구현하고 그 이미지에 이전 연구자 8-11 액세스 시험편 및 프로세스의 많은 다양한 사용되었다.
우리는 먼저 기존의 공 초점 현미경 접근 방식을 통해 LSFM의 몇 가지 주요 장점을 강조하고 싶습니다 :
라이브 영상 현미경 실험에서 의미있는 결과를 얻기 위해서는, 관찰 만 최소 시료에 영향을 미치는 것이 중요하다. 그러나, 제브라 피쉬를 포함한 많은 생물은 광독성의 EF없이 높은 시간 해상도의 공 초점 현미경 이미지 그들에게이 도전하고, 레이저 광선에 매우 민감하다정체 또는 지연 개발 6,7 등 fects. LSFM 현재 샘플 7의 최소 분열 효과 형광 영상 법이다. 얇은 레이저 광 시트는 특정 시점에서 촬상 된 시험편의 일부만을 조명하므로, 광 시트 현미경은 매우 효율적으로 광자를 사용하고있다. 따라서, 낮은 조명 노출은 건강 시편의 이상 경과 관찰, 예를 들어 12 ~ 17 수 있습니다. 또한 LSFM의 최소 침습 덕분에, 획득 된 영상의 개수가 더이상 아니라 처리되고 저장 될 수있는 데이터의 양에 의해 시료가 견딜 수있는 빛의 양에 의해 결정되지 않는다.
근처 생리 학적 조건에서 시편을 유지하는 동일한 선에 따라서, LSFM 라이브 배아에 적합 다른 샘플 설치 전략이 함께 제공됩니다. LSFM 기술에서, 배아는 일반적으로 낮은 비율 아가로 오스의 얇은 칼럼에 포함된다. mountin동시에 여러 도면에서 (LSFM보기라고에서) 아가로 g 실린더는 회전 자유롭게 허용하므로 시료 완벽한 각도에서 관찰 될 수있다. 멀티 뷰 영상 및 후속 안식 융합 큰, 산란 표본에 특히 유용 높은 등방성 해상도로 캡처 할 수 있습니다. 다른 가능한 LSFM 설치 전략의 요약 E. 레이노의 실험실에 의해 작성된 샘플 준비의 장에서, 공식 현미경 운영 매뉴얼에서 찾을 수 있습니다. 그것은 여기에 설명 된 것보다 목표는 이미지를 다른 샘플에 특히 경우, 권장 읽기입니다.
LSFM의 화상 취득은 레이저 스캐닝 공 초점 레이저 주사 현미경 반대로, 넓은 시야, 카메라 계이다. 이것은 더 높은 신호 – 취득 이미지 잡음비 (SNR)를 초래하고 (초당 프레임 수십에서 수백)을 매우 빠르게 할 수있다. LSFM의 높은 민감도는 더 약하게 형광 SAMP의 영상을 가능하게레, 가까운 미래에 내인성 레벨 18에서 표현 된 전사 인자와 같은 내인성 단백질 / Cas9를 CRISPR를 사용하여 태그. 높은 SNR은 성공적인 하류 이미지 분석에 중요하다. 높은 속도가 빠른만큼 여러보기에서 전체 배아를뿐만 아니라 빠른 세포 내 프로세스를 캡처하는 데 필요한뿐만 아니라 이미지입니다. 관찰 된 현상은 별도의 뷰에서 오는 이러한 여러 Z 스택 획득 동안 변경하지 않는 경우 여러 뷰의 원활한 융합 만 달성 될 수있다.
LSFM의 이점은 일반적으로 화질을 희생 오지 않는다. LSFM의 측면 해상도는 공 초점 현미경의 해상도보다 약간 더 나쁘다. LSFM에 사용되는 검출 목적이 하부 개구 표준 촛점 설정 물 또는 실리콘 침지 목표 1.2~1.3 비교 (보통 1.0 이하)을 가지고 있기 때문이다. 또한, 때문에 LSFM의 넓은 필드 검출 (에 absen핀홀 CE)은 공 초점 현미경에 비해 포커스 아웃 광있다. 포커스 아웃 광량은 광 시트의 두께에 의해 결정된다. 그럼에도 불구하고, 이러한 단점은 LSFM에서 높은 SNR에 의해 보상된다. 실제로, 이것은 예컨대 디스크 촛점 취득 15 회전에 비해 유사한 이미지 품질을 초래한다. 따라서,이 세포 혈통이 15,19 추적을 위해, 세포막이나 핵, 예를 들어, 같은 기능의 신뢰성 추출 할 수 있습니다.
LSFM의 축 해상도 광 판 두께에 의해, 검출 목적에 부가하여, 결정된다. 어떤 경우 LSFM 캔의 축 방향 해상도는 공 초점 현미경의 해상도를 넘어. 광 시트는 일반적으로 저배율 대물 이미지화 큰 시험편 발생하는 검출 목적의 축 해상도보다 얇은 경우에는 우선, 해상도의 향상이 온다. LSFM은 ACH 수있는 방법 두 번째 방법,더 축 해상도 ieve, 다른 관점에서 높은 XY 해상도 정보가 하나의 이미지 스택에 결합되는 안식 융합이다. 생성 된 병합 스택은 횡 방향 (20, 21)의 해상도 값에 접근 등방성 해상도를 갖는다. 이 문서에서 설명하는 서로 상에 여러 뷰를 등록하기위한 전략은 샘플 (20, 21)의 주위에 아가로 오스에 포함 된 신탁 마커로 형광 폴리스티렌 비즈를 사용하여 기반으로합니다.
LSFM 상용화로 인해,이 기술은 과학 (22)의 넓은 지역에 사용할 수있다. 따라서,이 프로토콜을 작성하기위한 동기 부여는 LSFM에서 실무 경험이 부족한 발달 생물 학자들에이 기술이 액세스 할 수 있도록 이들 과학자들은 샘플이 기술을 사용하기 시작 얻는 것입니다. 우리의 프로토콜은 개념적으로 간단한 현미경 t를 구성하는 상업 빛 시트 현미경을 사용모자가 작동하기 쉽습니다. 우리는 또한 특정 질문에 23-25 답변을 적합 할 수 있습니다 홈 내장 LSFM의 설정과 제브라 피쉬 이미징에 대한 최근의 다른 프로토콜을 언급하고 싶습니다. LSFM 또 다른 항목 옵션은 넓은 지역 사회에 빛 시트 현미경을 가지고 오픈 액세스 원리를 사용하는 오픈 플랫폼 (26, 27)이다. 하드웨어와 소프트웨어 측면 모두의 문서는 http://openspim.org 및 https://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/에서 찾을 수 있습니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 LSFM과 발달 과정을 연구하는 모델 시스템으로 경골 제브라 피쉬를 사용합니다. 제브라 피쉬 눈의 형태 형성은 LSFM의 혜택을 많이 강조 예입니다. LSFM 이미 28 메다카 및 지브라 피쉬 29,30 안구 발달을 조사하기 위해 과거에 사용되었다. 시력 발달의 초기 단계는 종래의 현미경 정확하게 태아의 방향을 복잡부피가 큰 노른자로 배아가 눈 목표를 향하도록 측면에 거짓말을 할 수 없습니다. 그러나 LSFM는 아가 로스 칼럼에 장착하여, 샘플 재현성 위치 될 수있다. 또한, 광학 컵 무대에 광학 소포에서 전환하는 동안, 눈은 큰 Z 스택과보기의 큰 필드를 캡처 필요 성장과 함께 주요 형태 형성 재 배열을 겪는다. 또한 이러한 문제에 대한 LSFM은 기존의 공 초점 이미징 우수하다. 광섬유 컵 형성 과정은 따라서 이해할 한 시야에서 촬상 의해서만 시각화하기 어려운 입체이다. 이 등방성 해상도를 가진 멀티 뷰 영상이 유용합니다. 광학 컵 형성 한 후, 망막 레이저 노출에 더욱 민감하게된다. 따라서 LSFM와 연관된 낮은 광독성 장기 이미징 큰 장점이다.
여기에서 우리는 이전 제브라 피쉬는 배아 1 ~ 3 일의 촬영을 위해 최적화 된 프로토콜을 제시눈 개발에 초점을 맞춘 차 애벌레. 우리의 방법은 높은 공간 및 시간 해상도로 12 ~ 14 시간까지 취재 시간 경과 동영상 촬영을 할 수 있습니다. 이 기술은 변함없이 자주 테라 바이트 범위에서, 큰 데이터 세트를 생성으로 중요한 것은, 우리는 또한, LSFM에 필수적인 단계이다 데이터 처리를위한 파이프 라인을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
데이터 수집 1. 중요한 단계 및 문제 해결
GFP의 발현 및 샘플 RFP의 일반적인 촬상 설정 원통형 렌즈에 의해 형성된 광 시트는 정적 설명한 현미경 설정, 표 3에서 볼 수있다. 두 조명 목적은 공기 렌즈이며, 검출의 목적은 물에 침지 렌즈이다. 20X / 1.0 또는 40X / 1.0 목표에 1.0을 확대하는 것은 230 내지 115 나노 미터 픽셀 크기는 각각 441 X 441 μm의 또는 221 X 221 μm의의 시야를 제공합니다. 2 : 비율 1 국경 센터 기본 광 시트 두께를 사용하는 것이 좋습니다. 20X / 1.0이 두께는 4.5 μm의 및 40X / 1.0 중앙 μm의 3.2에 대한 대응한다. 이미징 속도 차 우선 순위가 아닌 경우, 채널들 사이의 형광 발광의 크로스 토크를 방지하는 다색 샘플의 경우에는 별도의 트랙을 사용한다. 취득 최고 속도가 Z에 의해 단계 50 밀리 초에 한정Z 축 드라이버의 이동 속도. 목표 등의 경우에 최대 촬상 속도를 달성하는 경우, Z 스텝 당 찍은 모든 이미지의 합이 50 밀리 초 이하가되도록, 이중면 조명 두 트랙은, 노광 시간이 설정되어야한다. 단일 이미지 Z 스텝마다 취득하는 경우 한편, 이는 50 밀리 초보다 짧은 노출 시간을 설정하는 것이 유익하지 않다.
| 1920 X 1920 이미지 크기 |
| 16 비트 |
| 피벗에 스캔 |
| 온라인 융합 이중 양면 조명 |
| 10X / 0.2 조명 목적 |
| 20X / 1.0 W-플랜 고차 색지움 검출 대물 |
| 트랙 1 : 여진 488 nm의 통상적 100 mW의 레이저의 2 %, 550 nm의 발광 SP 필터 |
| 트랙 2 : 여진 561 nm의 일반적으로 3 %의 75 mW의 레이저 (58)5 nm의 발광 LP 필터 |
| 100 밀리 초 노출 시간까지 |
| Z 스택 두께 50 ~ 100 μm의 |
| 연속 Z 구동 모드에서 1.5 μm의 Z 스텝 사이즈 |
| 28.5 ° C에서 배양 |
표 3 : 설정 이미징.
실험 후 샘플을 검사
이 시험편은 아직 실험 끝에 정상인지 확인하는 것이 중요하다. 첫 번째 판독으로, 입체경에서 시편의 심장 박동을 확인합니다. 날카로운 집게 한 쌍의 시료 아가 취출 할 수 있고,이 촬상에 의해 영향을받는 경우를 확인하기 위해 추가 개발 인큐베이터로 옮겼다. 대안 적으로, 항체 염색을 위해 고정 될 수있다.
설치 및 드리프트
실 (S)의 삼투압을 유지하는 것이 필수적이다그렇지 않으면 / 부종 아가로 오스와 발생 샘플의 후속 불안의 감소, 가까운 매립 아가로 오스의 삼투압에 olution. 따라서, 챔버를 채우기 위해 동일한 용액 (메틸렌 블루없이 E3 매체)를 사용하고, 1 % 저 융점 아가로 분액을 제조 하였다. 그것의 겔화 특성을 잃을 수있는 또한, 2 개 이상의 시간 동안 70 ° C 가열 블록의 아가로 오스를 두지 마십시오.
이 배아의 열 충격 반응 또는 사망으로 이어질 수있는, 너무 뜨거운 아가로 오스로 물고기를 포함하지 마십시오. 배아에 따뜻한 아가로 오스의 효과에 대해 확신하는 경우, 꼬리가 구부러지지 않는과 심장 박동이 진정되지 않는 것을 확인합니다. 이 경우, 실험에 다른 배아를 사용한다.
샘플 짧은 (약 2 cm)와 아가로 오스 컬럼의 전체 길이를 유지하고 플런저 팁을 지향 머리로 제브라 피쉬를 탑재합니다. 마찬가지로, 아가 실린더는 capill로부터 압출진은 가능한 짧게 유지되어야한다. 이러한 조치는 영화에 걸쳐 샘플의 안정성을 보장한다. 이 큰 굴절과 반사를 야기 같이 유리 모세관 자체가 광 경로로 도달하지 않도록 동시에, 아가 로스 컬럼 충분히 길어야한다.
샘플의 초기 드리프트 아가 실린더 자체의 체적 변화에 의해 야기된다. 플런저의 슬라이딩하는 것은 이유가 아닙니다. 따라서, 플라 스티 나 매니큐어와 플런저를 해결하는 데 도움이되지 않습니다. 배아가 너무 인해 자연 성장 영화 동안 위치를 변경 될 수 있습니다. 따라서, 시야의 중앙에 관심 영역의 중심 및 이들의 움직임을 수용하기 위하여 가장자리에 약간의 공간을 유지하는 것이 바람직하다.
광로의 매립 매체의 감소량
제대로 샘플을 배향하는 최상의 이미지 품질 15을 달성하는 데 도움이됩니다. 유전자집회는 여기 및 방출 빛이 가능한 한 적은 조직 및 장착 미디어를 통해 이동해야합니다. 최적의 솔루션은 아가없이 장착된다. 이것은 메인 루트가 phytagel에 장착하고 좌우 뿌리이어서 완전히 겔 컬럼에서 성장할 수 있도록하고있는 애기 횡 루트 촬상 14에 대한 설치 예를 달성 하였다. 아가로 오스 프리 실장은 이일 (12)를 통해 Tribolium 비틀의 전체 배아의 영상을 위해 개발되었다. 이미지 품질을 개선하는 경우의 기본 동기 아니었다. Tribolium 배아는 단순히 충분히 아가로 오스 내부에 생존하지 않습니다. 절대적으로 삽입 미디어 무료 장착은 제브라 피쉬의 장기 이미징 달성되지 않았습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 사실을 이용할 수있는 아가 응고가 가장 배아 하나 아가 깊은 위치 눈 매립 컬럼의 표면 부근에 상기 제 2 눈으로 모세관에 비스듬히 배치되는 경우. 티표면에 가까운 그 눈이 우수한 이미지 품질을 제공하며, 따라서 우선적으로 묘화한다.
아가 로스 농도 장기 이미징
장착 아가 로스의 농도는 시료의 안정성과 산소의 태아 성장과 확산을 수용 할 가능성 사이의 타협이다. 1 % 아가 로스 농도 이상을 사용하여 샘플의 안정성에 추가 이득이 없다. 실험을 최적화하기위한 출발점으로 우리는 1 % 아가 로스에 장착하기에 너무 섬세 미만 24 HPF의 배아에 적합한 0.6 % 아가로 오스를 권장합니다. 이전 배아와 유충 마취시키다 위해, MS-222 농도는 부작용없이 13 μg의 200 / ㎖로 상승 될 수있다.
이 배아 및 CAUS의 성장을 제한하기 때문에 경우 개발 배아는, 장착 아가로 오스는 권장하지 않습니다, 이상 ± 12 시간 동안 몇 군데 있습니다꼬리 변형을 말이지. 이 문제는 13,39 물을 유사한 굴절률 FEP 폴리머 튜브에 배아를 장착하여 제브라 피쉬에 대한 해결되었다. 마우스 배아 한편, 아가 중공 실린더 (40) 나 주사기 (41)에 부착 된 아크릴로드의 구멍에 고정 될 수있다. FEP 튜브 장착 튜브의 벽은 아가로 오스보다 빛이 약간 더 굴절 때문에,하지만 기본 방법으로 사용하지 않는 것이 좋습니다.
라이트 시트 정렬
좋은 이미지 품질을하여도 모든 실험 전에 자동 광 시트 정렬을 수행하는 것이 중요합니다. 줌 설정이 변경된 경우 특히 목적은 취출하고, 또는 다른 액체 챔버에 사용 하였다.
조명
빛 시트의 피벗 스캔이 항상 활성화되어야한다. 큰 산란 시험편 들어, 온라인 F와 이중면 조명을 적용 할 필요가있다usion보기의 들판을 가로 질러에도 조명을 달성했다. 이중면 조도는 배아의 렌즈에 의해 입사광 시트의 굴절률이며 눈 영상의 특정 문제를 감소시킨다. 더 작고 산란 시험편 효율적 절반 촬상 시간을 단축하고 양면 이중 조명에 비해 약간 더 나은 이미지 품질을 초래할 수있는 하나의면 조명을 이용하여 이미징 될 수있다. 두 아암 용 조명 광로 항상 상이하고보다 효율적인 하나가 선택 될 수 있기 때문이다. 또한, 각각의 측면에서 오는 두 개의 빛 시트를 융합 한 후 흐림 약한 원인이 하나의 평면에 완벽 적이 없습니다. 성장하는 미세 소관 (동영상 2)와 같은 매우 빠른 세포 내 이벤트의 경우, 이중 양면 조명 모션 블러가 발생할 수 있습니다 순차적으로, 취득 왼쪽과 오른쪽에서 조명 이미지 때문에, 적합하지 않습니다.
광표백및 광독성
이하의 형광 광표백 종종 LSFM의 큰 장점으로 언급된다. 우리는 목표는 전혀 광표백 없어야한다고 주장한다. 실시간 이미징 실험 띄는 광표백이있는 경우, 시료는 허용 레이저 노광의 생리 학적 범위에서 이미 아마. 회전 디스크 현미경의 제브라 피쉬 배아를 이미징 할 때, 우리의 경험, 높은 광독성도 크게 형광 신호 표백제 전에 배아 발달을 멈출 수 있습니다. 광표백 거의 또는 전혀 관찰되도록 따라서 LSFM에서 촬상 설정을 조정한다. LSFM 샘플 완만해도, 그 이후의 데이터 분석을위한 충분한 잡음 비율로 신호를 달성하는데 필요한만큼의 레이저 파워 및 노출 시간을 사용하는 것이 현명하다.
Z 스택, 시간 간격 및 데이터 사이즈
LSFM 의해 생성 된 파일은 일반적으로 매우 크다; 때로는 테라 바이트 범위이다. 이미지 품질 및 데이터 크기 사이의 타협을 만드는 것이 필요하다. 특히 시간 경과 인수에 스택 및 간격의 Z 간격에 해당합니다. 는 z 간격을 정의하려면 Z-스택 도구 탭에서 최적의 버튼을 이상적으로 데이터 세트 나중에 deconvolved됩니다 특히, 사용되어야한다. 이것은 주변 광 조각 사이의 50 % 오버랩을 달성하기 위해 간격을 산출한다. 그럼에도 불구하고, 다소 큰 Z 간격은 일반적으로 허용됩니다. 이들은 Z 스택뿐만 아니라 최종 파일 크기를 획득하는데 필요한 시간을 감소시킨다. 최적의 시간 샘플링 관심의 과정에 따라 달라집니다. 전체 눈을 위해 개발 5 ~ 10 분 간격으로 일반적으로 허용됩니다. 일부 구조를 자동으로 추적 할 수있는 경우, 이후의 시점 충분히 유사해야한다.
형광 구슬
형광 구슬은 주로 다른 뷰를 등록하는 등의 기준 마커를 제공서로 상에 다 관찰 데이터 세트의. 항상 철저하게 사용하기 전에 비드 솔루션을 소용돌이. 이 형광 염료의 손실을 초래할 수있는 구슬을 가열하지 마십시오. 안식 등록 최적 비드 농도를 실험적으로 결정되어야한다. 설명 된 플러그인은 각 뷰에 걸쳐 약 1,000 검출 구슬 가장 잘 작동합니다. 큰 (500 내지 1,000 ㎚) 구슬은 작은 (500nm 이하) 구슬보다 더 견고하게 검출된다. 큰 구슬 밝게하며 샘플 구조 오 탐지없이 세그먼트 쉽기 때문이다. 큰 비드의 단점은 최종 융착 deconvolved 이미지에서 매우 눈에 띄는 것으로된다. 각각의 새로운 형광 마커를 들어, 적절한 비드 크기 및 형광 방출을 최적화한다. 그림 5와 영화 (3)로부터 샘플의 예를 제공하기 위해, 100 nm의 녹색 발광 구슬 막-GFP 채널에 너무 많은 오 탐지를 만들었지 만 1,000 Nm 적색 발광 비즈는 견고 샘플 내부의 매우 적은 양의 탐지와 H2B-RFP 채널에서 검출되었다. 비드 검출 형광 마커 채널에 실패한 경우에만 비드를 함유하는 별개의 채널이 획득 될 수 있지만, 이것은 매우 실용적이지 않다. 서브 해상도 크기 비드는 컨벌루션 (도 2C-D)에 사용할 수있는 현미경의 점 확산 함수 (PSF)를 직접 판독을 제공한다. 정렬 및 합성이 더 큰 비드 (예 : 1000 ㎚)로 작동하는 경우, PSF의 별도의 이미지 서브 해상도, 예를 들어, 100 nm의 비드를 얻을 수있다. 여러 가지 빛깔의 구슬을 사용하여 멀티 채널 획득의 등록 과정 및 채널 오버레이 완벽하게되는지 확인을 위해 도움이됩니다.
이후 멀티 뷰 등록 및 융합없이 하나의보기에서 이미징 때 형광 구슬의 추가가 필요하지 않습니다. 그러나, 이러한 경우에 구슬 있으면 초기시 도움이 될 수 있습니다리터 빛 시트 조정은 빛 시트의 품질을 확인하고 일반적으로 광학 수차를 공개 할 수 있습니다. 이러한 광학 수차가 손상되었거나 오염 목적, 아가로 오스의 챔버 또는 불균일의 더러운 창 같은 다양한 소스에서 발생 할 수 있습니다. 비즈는 안식 등록 피지 플러그 (20)에 의해 드리프트 보정에 이용 될 수있다.
멀티 뷰
안식 재구성 위해서는, 서로 대향하지 뷰 3 등 (5)의 홀수 번호를 취득하는 것이 좋다. PSFS가 서로 다른 방향에서 몇 군데 있기 때문에이 디컨 볼 루션을 향상시킨다. 플레이 중 충분한 오버랩이되는 시간 경과 수집의 시작을 확인하는 것이 중요하다. 이것은 가장 바로 첫 시점의 뷰가 성공적으로 등록 할 수있는 것을 확인, 즉, 경험적으로 이루어진다. 안식 수집의 목적은 해상도를 증가시킬 때큰 산란 표본의 이미지는, 각 뷰의 시료 전체 이미지에 바람직하지 않지만, 신호 열화가 샘플의 중심을 중지. 시험편의 후반부에서 저화질 취득 안식 재건술에 유용한 정보를 추가 할 것이다.
데이터 처리를위한 중요한 단계 2와 문제
현재 잘 문서화 채택하기가 비교적 쉬운 밝은 장 현미경 안식 데이터를 처리하기위한 여러 가지 가능성이 존재한다. 우리는 피지 (32) (스테판 Preibisch 게시되지 않은, 구현 된 오픈 소스 소프트웨어 인 다안 재구성 응용 프로그램 사용 링크 (1A) 및 Link1b 재료의 목록을). 이 플러그인은 이전 SPIM 등록 플러그인 (20)의 주요 재 설계하고, 검토BigDataViewer와 XML 및 SPIM 등록 워크 플로우와 HDF5 형식 (33) (그림 1B, 통합 Schmied 등. (42)에 의해 링크 2 , 링크 3 ). 본 출원은 또한 상당한 처리 속도 43 고성능 컴퓨팅 클러스터에 대해 적응 될 수있다. 이 다 안식 등록 신청 적극적 더욱 개발되고 향상 유지. 설명 된 소프트웨어에 대한 문제 또는 기능 요청의 경우, 각각의 GitHub의 페이지 (에 문제를 제기하십시오 링크 4 멀티 뷰 재건 및 링크 5 BigDataViewer를 들어).
두 번째 옵션은 현미경과 함께 사용할 수있는 상용 소프트웨어를 사용하는 것이다. 이 솔루션은 잘 작동 및 사용 다른보기를 등록 형광 비드를 사용하는 동일한 원리. 그러나, 빠른 BigDataViewer와 같은 전체 데이터 세트를 가시화하기위한 옵션이 부족하다. 또한, 소프트웨어는 클러스터에 적합한 소프트웨어에 대한 추가 라이센스를 구입하지 않는 다른 사용자에 대한 또 처리 블럭 현미경 수 없다.
또한 오픈 소스 소프트웨어입니다 세 번째 옵션은, 최근 켈러 실 (44)에 의해 출판 처리 및 광 시트 데이터의 다운 스트림 분석을위한 포괄적 인 프레임 워크를 제공했다. 이 소프트웨어는 따라서 샘플 주위 형광 비드의 존재를 필요로하지 않으며, 다안 융합을 수행하는 샘플 내의 정보를 사용한다. 그러나, 동시에 촬상 뷰 (목표)에 직교하는 방향을지지하므로는 임의의 각도 (44)로부터 취득한 데이터에 대해 사용될 수 없다.
하드웨어 요구 사항
ntent "> 처리를 위해 사용되는 하드웨어는 이미지의 취득 이후의 분석보다 빠르다. 앞서 실제 실험의 충분한 저장 용량을 사용할 수있는 데이터 처리에 대한 명확한 파이프 라인을이 있어야한다. 표 4에서 찾아 볼 수 있으며 쉽게 처리되지 않은 데이터 홍수하세요. 융합보기, 최대 강도 예측 또는 구형 돌기 (45)와 같은 모든 원시 이미지가 아니라 자른 버전 또는 처리 된 이미지를 저장할 종종 비현실적이다.| 프로세서 | 두 개의 인텔 제온 프로세서 E5-2630 (식스 코어, 2.30 GHz의 터보 15 MB, 7.2 GT / 초) |
| 기억 | 1백28기가바이트 (16 × 8 GB) 1600 MHz의 DDR3 ECC RDIMM |
| 혹사하다 | 4 × 4 TB 3.5 인치 시리얼 ATA (7.200 RPM) 하드 드라이브 |
| HDD 컨트롤러 | PERC H310 SATA / SAS 콘델 정밀에 대한 콘트롤러 |
| HDD 구성 | C1 SATA 3.5 인치, 1-4 하드 드라이브 |
| 제도법 | 듀얼 2기가바이트 엔비디아 쿼드로 4000 (/ 2 DP & 1w이 카드는 DVI-I 각) (2 DP-DVI & 2 DVI-VGA 어댑터) (MRGA17H) |
| 네트워크 | 인텔 X520-T2 듀얼 포트 10 기가비트 이더넷 네트워크 인터페이스 카드 |
표 4 : 하드웨어 요구 사항.
데이터 처리 속도
데이터 처리에 필요한 시간은 데이터의 크기와 사용 된 하드웨어에 좌우된다. 표 1에서는 4보기 2 채널과 1 시점 구성 예 8.6 GB의 다 관찰 데이터 세트 처리에서의 주요 단계에 필요한 시간의 개요를 제공한다.
| 가공의TEP | 시각 | 프로토콜 단계 |
| HDF5로 다시 저장 | 6 분 30 초 | 6.3 |
| 관심 포인트를 감지 | 20 초 | 6.4 |
| 관심 지점을 사용하여 등록 | 3 초 | 6.5 |
| 콘텐츠 기반의 멀티 뷰 융합 | 4 시간 | 7.2 |
| 멀티 뷰 디컨 볼 루션 (CPU) | 8 시간 | 7.3 |
| 멀티 뷰 디컨 볼 루션 (GPU) | 2 시간 | 7.3 |
표 1 : 데이터 처리 시간.
멀티 뷰 재건을위한 입력 데이터 형식
피지 플러그인 멀티 뷰 재건 .czi,이 .tif 및 ome.tiff 형식을 지원할 수 있습니다. .czi 형식의 데이터 구조로 인해, 불연속 데이터 세트는 아니다전처리없이 지원. 불연속는 기록 (예 : 샘플의 드리프트에 의한 위치를 재조정하기 위해) 다시 시작했다는 것을 의미한다. 이 경우 .czi 파일이 .tif로 다시 저장해야합니다. 이 .tif 각보기를 파일과 조명의 방향은 별도의 파일로 저장해야합니다.
화소 크기의 교정
현미경 – 운영 소프트웨어는 선택된 목표에 기초하여 XY 화소 크기에 대한 보정을 계산한다. 그러나, Z의 화소 크기는 스텝 크기에 의해 독립적으로 정의된다. 잘못된 목적은 소프트웨어에 지정되면 Z 비율로 XY 잘못되었습니다 및 등록에 실패합니다.
초기 등록
데이터 집합을 정의한 후 등록수는 한 것 및 관심 지점의 수는 ViewSetup 탐색기에서 0이된다. 초기 등록은 데이터 세트의 교정을 나타냅니다. 숫자 O를 모두F 등록 및 관심 지점을 처리하는 동안 증가 할 것이다.
관심 지점의 검출을위한 다운 샘플링
샘플링을 사용하여 파일의 로딩 이후, 추천 및 분할 훨씬 빠를 것이다. 검출 매개 변수 따라서 다른 아래 샘플 설정 사이에 감지 설정을 전송, 다운 샘플링에 따라 변경 될 수없는 점에 유의하기 그러나 중요하다.
관심 지점의 검출
이들이 상당히 등록을 방해하지 않기 때문에, 그것은 심지어 오 탐지를 획득하는 가격 각 도면에서 가능한 많은 사실 비드 세그먼트하는 것이 바람직하다. 숫자 몇 가지 경우 허위 탐지는, (관심 지점의 등록 참조) 등록시 제외됩니다. 그러나, 대규모 오 탐지 알고리즘에 문제가 포즈. 그것은뿐만 아니라 검출 성능을 감소시키고,등록,이 세그먼트에 더 이상 화상을 얻어뿐만 아니라보기 사이 이러한 비드를 비교하지만, 또한 등록의 정확성을 감소입니다. 이는 엄격한 검출 파라미터를 이용하여 해결 될 수있다. 또한, 비드 (하나의 구슬 그림 1E에 즉 다중 탐지)의 분할을 통해 등록에 해로운 피해야한다.
관심 지점 등록
서로 상에 뷰를 등록하려면, 각보기의 각 구슬의 위치는 세 개의 가장 가까운 이웃 구슬에 대한 그것의 위치에 의해 설명된다. 이 별자리는 로컬 기하학적 설명을 형성하고 뷰 사이의 각각의 구슬을 비교 할 수 있습니다. 두보기 사이를 설명 일치하는 비즈는 다음 후보의 대응으로 간주됩니다. 이 로컬 기술자는 일반적으로 각각의 구슬에 대한 고유있는 랜덤하게 분포 구슬, 작동합니다.하나는 등록을위한 샘플 핵으로 다른 구조를 사용할 수있다. 그러나, 샘플이 아닌 무작위로 분포되어 핵을 검출하기 위해 다른 방법들 (20, 21)이 적용된다.
후보의 대응은 오탐 (false positive)을 제외하기 위해 RANSAC (36)에 대해 시험한다. 각각의 대응은 서로 상보기를 오버레이에 대한 변환 모델을 제안한다. 아웃 라이어가 다른 하나에 각 지점을 것 반면에 진정한 대응 가능성, 하나의 변환 모델에 동의 할 것이다. 진정한 대응은 두 비교보기 사이 아핀 변환 모델을 산출하기 위해 사용된다. 반복적 최적화 알고리즘있는 글로벌 최적화는 모든 뷰는 뷰 (20, 21) 사이의 최소 변위 목적으로 제 뷰에 등록되어있는 동안 수행된다.
시간 경과 등록
이동하기 때문에현미경 스테이지의 아가 부정확 모터 운동, 표준은 각 스택의 위치가 시간이 지남에 따라 적당히 변한다. 각 시점의 등록이 시점의 의견 차이를 제거하는 반면, 시간 경과 또한 전체로서 등록 할 필요가있다. 이를 위해, 각 시점은 기준 시점에 등록된다.
기준 시간 점
다양한 시점과 시계열 처리되면 비드 강도 인해 표백 시간 동안 저하 될 수 있기 때문에, 대표 시점은 시계열의 중간 통상 기준으로서 선택된다. 이러한 기준에서 관심 지점 감지, 등록 경계 박스 및 융합을위한 파라미터가 결정될 수있다. 이들 파라미터는 각각의 시점에 대한 특정 변형 모델을 계산하는 전체 시간 경과에 적용된다. 시간 경과 등록하는 동안 다른 모든 시점은 REGIST 있습니다이 기준 시점에 공간적으로 겹. 따라서, 전체 기록 용 바운딩 박스 파라미터는 이러한 특정 시점에 의존한다.
멀티 채널 등록
여러 채널을 이미징 할 때 이상적으로 같은 형광 구슬은 모두 몇 군데 채널에서 볼 수 있어야합니다. 검색 및 등록 후 고려 변환에 다른 파장의 빛의 영향을 얻어 개별적 채널에서 수행 될 수있다. 구슬이 모든 채널에 표시되지 않습니다 또는 구슬이 하나의 채널에 너무 많은 이미지를 지배하고 다른 채널 (들)이 너무 어둡 때문에 종종이는 할 수 없습니다. 일반적인 솔루션은 검색 및 등록 취득한 변환 모델의 하나의 채널에 표시 비드를 사용하는 것이다 (즉, 감지, 등록 및 저속 등록 후) 다음 피지> 플러그인> 멀티 뷰 Reconstr하여 다른 채널에 적용uction는> 일괄 처리> 도구> 중복 변환. 드롭 다운 메뉴에서 다른 채널을 선택 한 채널의 변환을 적용합니다. 다음 창에서 XML을 선택하고 확인을 클릭합니다. 그런 다음 소스 채널로 구슬을 포함하고 대상 채널로 구슬없이 채널을 선택하고 채널을 선택합니다. 이는 중복의 경우 변환은 모든 변환하고 OK를 교체 사용합니다. 변환은 모든 다른 채널로 복사 및 XML에 저장됩니다. 멀티 뷰 재건 응용 프로그램을 다시 시작 ViewSetup 탐색기에서 새로운 변환을 참조하십시오.
경계 상자
여러 뷰의 융합은 계산이 매우 많이 있습니다. 그러나, 큰 이미지는 일반적으로 샘플뿐만 아니라, 그 주위의 비드뿐만 아니라 수용 취득한다. 등록 파라미터 일단(S)가 비드로부터 추출되고, 그들 화상의 일부로서 더 이상 유용하지 않는다. 따라서, 융합의 효율을 높이기 위해, 샘플을 포함하는 이미지 스택의 부분은 융합한다. 이자 (바운딩 박스)의 영역 샘플을 포함하도록 정의 가능한 주변의 아가 적게한다. 경계 박스와 부피가 1634 × 1746 × 1632 픽셀로 축소되며, 상기 메모리 요구가 감소되는 반면,도 2에서 예를 들어 2229 × 2136 × 2106 픽셀로 전체 볼륨의 가중 평균 융합, RAM의 3만8천1백96메가바이트을 필요 1만7천7백29메가바이트합니다.
콘텐츠 기반의 멀티 뷰 융합
다 관찰 데이터를 융합에 도전보기는 보통 갑자기 종료하고 동일한 복셀에 대한 동일한 화상 품질을 포함하지 않는다는 것이다. 뷰의 단순 평균 따라서 혼합 유물과 불필요한 이미지 저하로 이어질 것입니다. 콘텐츠 기반의 안식 쿵푸 시온 계정으로 이러한 문제를 모두합니다. 하나의 영상이 종료하고, 다른 하나가 시작되고 둘째, 로컬 이미지 품질을 평가하고, 융합 21 고화질화에 높은 가중치를 적용 여기서 첫째는 상이한 도면을 혼합. 하나의 뷰에 비해 XY의 신호 약간 저하 (도 2E-H,도 5A-D)와 (Z)의 해상도의 향상이있다.
멀티 뷰 디컨 볼 루션
멀티 뷰 디컨 볼 루션의 의견의 융합을 달성하는 또 다른 방법입니다. 이 방법의 다른보기도 PSFS 현미경의 광학계에 의해 콘볼 루션 된 이미지를 복구하기 위해 고려된다. 이 방법은 크게 영상 흐림을 제거하고 신호 (31) (도 2C-D도 2I-J,도 5E-G, 영화 3)의 해상도 및 콘트라스트를 증가시켜 이미지의 품질을 향상시킨다.
ve_content "> 역대 합이 계산 상 매우 집약적 따라서 처리하는 GPU는이 프로세스의 속도를 증가하여 (표 1 참조). 또한 다운 샘플링 된 데이터에 디컨 볼 루션을 수행하기 위해 필요하다. 다운 샘플 피지> 멀티 뷰 재구성을 사용 > 일괄 처리> 도구> 적용을 변환.이 .xml 파일에 저장됩니다 뷰에 새로운 변형 모델을 적용합니다.BigDataViewer 및 BigDataServer에 대한 HDF5 파일 형식
BigDataViewer 33 테라 바이트 규모의 데이터를 쉽게 시각화 할 수 있습니다. 어떻게 BigDataViewer을 제어하는 방법은 표 2에 요약되어있다. 프로그램의 기본 동작의 스크린 캐스트는 원래 출판 (33)의 보충 교재로도 사용할 수 있습니다. BigDataViewer은 이미지 데이터를 포함하는 메타 데이터를 포함 .xml 파일, 및 HDF5 파일에 집중되어있다. 화상 데이터는 대가이다3D 블록에서 여러 해상도 수준의 HDF5에 천만에. 전체 해상도가로드되기 전에 여러 해상도 수준, 낮은 해상도로 더 빠르게 데이터를 시각화 할 수 있습니다. 필요한 경우 각각의 블록은 메모리로로드된다. 따라서, HDF5 이미지 포맷은 BigDataViewer (33)를 통해 데이터를 직접 고속 시각화 할 수있다. 파일의로드가 더 효율적으로 수행하기 때문에이 또한 처리 속도. 이 엄격하게 처리를 위해 필요하지 않지만 따라서, 우리는이 형식으로 데이터 집합을 다시 저장하는 것이 좋습니다. 데이터 형식의 자세한 설명은 참조하시기 바랍니다 링크 (3) . 또한, 데이터 세트 공동 작업자 또는 BigDataServer 33 (사용하여 대중과 공유 할 수있는 링크 6 ).
| 키 | <td> 효과|
| F1 | 상기 BigDataViewer의 간단한 설명과 기본적인 조작으로 도움말을 보여줍니다 |
| <> 또는 마우스 휠 | Z에서 운동 |
| 위쪽 및 아래쪽 화살표 | 확대 및 축소 |
| 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드래그 | 뷰어에 샘플을 이동 |
| 왼쪽 클릭 및 드래그 | 커서 주위에 샘플을 회전 |
| 뷰어 또는 탭 왼쪽 또는 오른쪽 화살표 하단의 슬라이더 | 시간 축에서 이동 |
| 추가로 이동을 눌러 | 어떤 축을 따라 빠르게 이동 또는 회전 |
| x와 다음 왼쪽 및 오른쪽 화살표 | X 축을 중심으로 회전 |
| Y 다음 왼쪽과 오른쪽 화살표 | y 축을 중심으로 회전 |
| Z 다음 왼쪽과 오른쪽 화살표 | Z 축을 중심으로 회전 |
| 이동과 X | x 축의보기 배향 |
| 변화와 y | y 축 방향의보기 배향 |
| 이동 및 z | Z 축을 따라 배향보기 |
| 나는 | 다른 보간 모드 간 전환 (즉, 가장 가까운 이웃과 삼선) |
| s 또는 설정> 밝기 및 대비 | 채널, 휘도와 콘트라스트의 색상을 변경 |
| F6 또는 설정> 가시성 및 그룹화 | 표시된 그룹을 변경하는 숫자 키를 통해 그룹을 다른 그룹을 중첩시키고 호출하는 그룹핑있게 |
| F10 또는 도구> 기록 영화 | 현재 표시된 슬라이스의 시계열을 취득 |
표 2 : 빅 데이터 뷰어.
LSFM의 기술 된 구현 3. 제한
낮은 처리량
일반적인 LSFM 실험에서 단지 실험 당 하나의 샘플이 몇 군데있다. 또, 우리의 경험에서 많은 유용한 정보는 하나의 샘플로부터 추출 할 수있다. 여러 배아 고 스루풋 촬상 최근 샘플 위치와 회전 자유도를 희생하더라도 일반적으로 홈 내장 LSFM 셋업 46-48에서 달성되었다.
조직에 부족 침투 깊이
제브라 피쉬 배아 반투명하더라도, 산란 및 흡수 등에 의한 조직에 깊은 촬상하면, 얻어지는 화질 빨리 악화된다. 부분이 샘플에 의해 방출 된 형광의 산란 및 흡수의 효과가 현재 설정 수정 될 수 없다. 불균일 한 화상 품질의 또 다른 원인은 불규칙한 조명이다. 티그는 빛 시트는 왼쪽이나 오른쪽 측면에서 입사 스트라이프 유물과 흐림 결과 해당 경로를 굴절, 어떤 개체입니다. 이중 양면 조명 및 멀티 뷰 융합는 최종 이미지에서 아티팩트를 감소 할 수 있습니다. 마지막으로 화질 인해 에지 방향으로 두꺼워지고 광 시트의 자연스런 형상에 시야의 가장자리쪽으로 약간 악화되는 경향이있다.
유한 화학 조작
약물이나 억제제의 사용은 제브라 피쉬의 연구에 널리 퍼져있다. 약물이 현미경 사용에 의한 시료 챔버와 동일한 챔버를 공유 악기의 다른 사용자의 고려 큰 부피로 제한된다. 약물 실험에 전념 여분의 실을 사용하면이 문제를 해결할 수 있습니다. 유리 구슬 부분적으로 챔버를 작성하는 것은 필요한 액체의 양을 줄일 수 있습니다.
어떤 photomanipulation이 없습니다
CURRENTLY이 광 현미경이나 레이저 어블 레이션 등 지역화 광학 조작의 가능성이 없다. 그럼에도 불구하고, 내장 된 홈 설정은 이러한 특정 애플리케이션에 사용될 수있다.
4. 의의 및 향후 응용 프로그램
LSFM 라이브 배아의 큰 볼륨의 빠른 이미징을위한 날짜에 사용할 수있는 가장 좋은 방법입니다. 공 초점 현미경을 생각할 실험의 대부분은 상술 한 장점을 가진 광 시트 현미경상에서 수행 될 수있다. 시력 발달의 촬상의 경우, LSFM 속도가 중요한 파라미터가 아니다. 대신, 샘플 위치에서 낮은 광독성과 유연성은 결정적인 이점이 있습니다.
LSFM 데이터는 컨벌루션 좋은 결과를 달성하는 데 도움 자동화 된 이미지 분석, 물체 추적에 도움이되는 높은 SNR을 갖는다. 결론적으로, LSFM는 배아 발달과 overa에 정량적 데이터를 생성하는 훌륭한 도구입니다LL 셀과 이후의 모델링 및 해당 프로세스의 물리적 설명은 조직 특성.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].
Materials
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 500 nm red fluorescent beads F-Y 050 | Millipore (Estapor) | 80380495 | |
| 20 μl (1mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
| Teflon tip plungers for 20 μl capillaries | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
| Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm | Thermo scientific (Menzel-Glaser) | ||
| O-rings for chamber windows 17×1.5 mm | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Tweezers, style 55 | Dumont | 0209-55-PO | |
| 50 ml Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 300865 | |
| 150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 397400 | |
| Links | |||
| Link 1 Multiview reconstruction application | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction | ||
| Link 2 BigDataViewer | https://github.com/bigdataviewer | ||
| Link 3 BigDataViewer | http://fiji.sc/BigDataViewer | ||
| Link 4 Multiview reconstruction application-issues | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues | ||
| Link 5 BigDataViewer-issues | https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues | ||
| Link 6 BigDataServer | http://fiji.sc/BigDataServer. |
References
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