باستخدام ورقة ضوء مضان المجهري لصورة التنمية الزرد العين
Summary
Light sheet fluorescence microscopy is an excellent tool for imaging embryonic development. It allows recording of long time-lapse movies of live embryos in near physiological conditions. We demonstrate its application for imaging zebrafish eye development across wide spatio-temporal scales and present a pipeline for fusion and deconvolution of multiview datasets.
Abstract
Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM compared to confocal systems are its low phototoxicity, gentle mounting strategies, fast acquisition with high signal to noise ratio and the possibility of imaging samples from various angles (views) for long periods of time. Imaging from multiple views unleashes the full potential of LSFM, but at the same time it can create terabyte-sized datasets. Processing such datasets is the biggest challenge of using LSFM. In this protocol we outline some solutions to this problem. Until recently, LSFM was mostly performed in laboratories that had the expertise to build and operate their own light sheet microscopes. However, in the last three years several commercial implementations of LSFM became available, which are multipurpose and easy to use for any developmental biologist. This article is primarily directed to those researchers, who are not LSFM technology developers, but want to employ LSFM as a tool to answer specific developmental biology questions.
Here, we use imaging of zebrafish eye development as an example to introduce the reader to LSFM technology and we demonstrate applications of LSFM across multiple spatial and temporal scales. This article describes a complete experimental protocol starting with the mounting of zebrafish embryos for LSFM. We then outline the options for imaging using the commercially available light sheet microscope. Importantly, we also explain a pipeline for subsequent registration and fusion of multiview datasets using an open source solution implemented as a Fiji plugin. While this protocol focuses on imaging the developing zebrafish eye and processing data from a particular imaging setup, most of the insights and troubleshooting suggestions presented here are of general use and the protocol can be adapted to a variety of light sheet microscopy experiments.
Introduction
التشكل هو عملية التي تشكل الجنين وجنبا إلى جنب مع نمو وتمايز يدفع تطور الجنين من بويضة مخصبة إلى متعددة الخلايا الناضجة. عمليات التخلق خلال تطوير حيوان يمكن تحليلها بشكل أفضل من خلال التصوير عينات حية سالمة 1-3. وذلك لأن مثل هذا التصوير الجنين كله يحافظ على جميع العناصر التي تدفع وتنظيم التنمية بما في ذلك التدرجات من جزيئات الإشارة، المصفوفة خارج الخلية، الأوعية الدموية، الغدد العرقية وكذلك الخواص الميكانيكية للأنسجة المحيطة بها. لسد المقاييس، والذي يحدث التشكل، لديها الأحداث التحت خلوية سريعة ليتم القبض على فترة زمنية دقيقة في سياق تطوير النسيج كله على مدى ساعات أو أيام. لتلبية جميع هذه المتطلبات، وقد تم تطوير تطبيق الحديث 4 من متعامد إضاءة الطائرة المجهر 5. في الأصل، كان اسمه والانتقائية طائرة الإضاءة المجهري (SPIM) 4؛ الآن يستخدم عادة مصطلح شاملة لجميع ورقة ضوء مضان المجهر (LSFM). LSFM تمكن التصوير في قرار الأوان، في حين حمل الضيائية أقل من المسح بالليزر أو الغزل قرص المجاهر مبائر 6،7. في الوقت الحاضر، وهناك بالفعل العديد من تطبيقات مبدأ رقة ضوء الإضاءة الأساسية وتم استخدامه لصورة مجموعة كبيرة ومتنوعة من النماذج والعمليات التي يتعذر الوصول إليها من قبل الباحثين 8-11.
نود أولا لتسليط الضوء على العديد من المزايا الرئيسية لLSFM على نهج متحد البؤر المجهري التقليدية:
للحصول على نتائج ذات مغزى من التجارب المجهرية التصوير الحي، من المهم أن الملاحظة يؤثر فقط على الحد الأدنى من العينة. ومع ذلك، فإن العديد من الكائنات الحية بما فيها الزرد معرضة جدا للتعرض للضوء الليزر، مما يجعل من الصعب على صورة لهم في المجهر متحد البؤر لقرار الأوان دون EF الضيائيةتأثيرات سلبية مثل 6،7 تطوير المتعثرة أو المتأخرة. LSFM حاليا تقنية التصوير مضان بأقل الآثار المدمرة على العينة 7. منذ ورقة رقيقة من ضوء الليزر تضيء فقط جزء من العينة التي تم تصويرها في نقطة زمنية معينة، ورقة المجهر الضوئي هو استخدام الفوتونات بكفاءة عالية. وبالتالي، فإن التعرض للضوء المنخفض يسمح للملاحظات مرور الزمن أطول من العينات صحية، على سبيل المثال 12-17. وعلاوة على ذلك، وذلك بفضل الغازية الحد الأدنى من LSFM، لم يعد يملي عدد من الصور التي حصل عليها كمية الضوء العينة يمكن أن يتسامح، ولكن بدلا من مقدار البيانات يمكن معالجتها وتخزينها.
وعلى نفس المنوال من الحفاظ على العينة في الظروف الفسيولوجية القريب، LSFM يأتي مع استراتيجيات عينة تصاعد بديلة مناسبة تماما لأجنة حية. في تقنيات LSFM، وعادة ما تكون جزءا لا يتجزأ من الأجنة داخل عمود رقيقة من انخفاض نسبة الاغاروز. ومونتينز في اسطوانات الأغاروس يسمح للحرية كاملة للدوران، وبالتالي فإن عينة يمكن ملاحظتها من زاوية مثالية (في LSFM يشار إلى رأي) ومن عدة جهات في وقت واحد. التصوير بطرق عرض متعددة والانصهار بطرق عرض متعددة لاحق هو مفيد بشكل خاص للالكبيرة، عينات نثر ويسمح القبض عليهم مع ارتفاع، القرار الخواص. ملخص استراتيجيات تصاعد LSFM أخرى محتملة يمكن العثور عليها في دليل المجهر التشغيل الرسمي، في الفصل المتعلق إعداد العينات كتبه المختبر من E. رينو. ومن قراءة الموصى بها، وخاصة إذا كان الهدف هو صورة عينات مختلفة من وصفها هنا.
الحصول على الصور في LSFM هو مجال واسع، تقوم الكاميرا، بدلا من المسح الضوئي ليزر المجهر متحد البؤر. وهذا يؤدي إلى ارتفاع إشارة إلى نسبة الضوضاء (SNR) للصور المكتسبة، ويمكن أن تكون سريعة جدا (عشرات ومئات من لقطة في الثانية). حساسية عالية من LSFM يتيح المزيد من التصوير من عصيدة الفلورسنت ضعيفليه، مثل عوامل النسخ التي أعرب عنها في المستويات المحلية 18 أو، في المستقبل القريب، البروتينات الذاتية الموسومة باستخدام كريسبر / Cas9. وSNR عالية المهم لنجاح تحليل الصور المصب أيضا. مطلوب سرعة عالية ليس فقط للقبض على العمليات داخل الخلايا السريعة، ولكن أيضا لصورة الجنين كله من وجهات نظر متعددة بسرعة كافية. والانصهار السلس من وجهات نظر متعددة لا يمكن أن يتحقق إلا إذا لم تتغير هذه الظاهرة لوحظت خلال الاستحواذ على هذه عدة أكوام ض القادمة من جهات مستقلة.
لا تأتي مزايا LSFM عادة على حساب جودة الصورة. القرار الوحشي LSFM هو أسوأ قليلا من دقة المجهر متحد البؤر. وذلك لأن أهداف الكشف المستخدمة في LSFM لها أقل الفتحة العددية (عادة 1.0 أو أقل) مقارنة مع 1،2-1،3 الأهداف المياه أو الغمر السيليكون على الاجهزة متحد البؤر القياسية. بالإضافة إلى ذلك، ويرجع ذلك إلى الكشف عن حقل واسع في LSFM (أبسينم من الثقب)، وهناك المزيد من الضوء خارج نطاق التركيز مقارنة مع المجهر متحد البؤر. يتم تحديد كمية من خارج تركيز الضوء من قبل ورقة سماكة خفيفة. ومع ذلك، يتم تعويض هذه العيوب من قبل SNR العالي في LSFM. في الممارسة العملية، وهذا يؤدي في صور ذات جودة مماثلة مقارنة على سبيل المثال الغزل القرص مبائر اقتناء 15. ونتيجة لذلك، وهذا يتيح استخراج موثوق من الميزات مثل أغشية الخلايا أو نوى، على سبيل المثال، عن نسب خلية تتبع 15،19.
يتم تحديد القرار المحوري LSFM، بالإضافة إلى هدف الكشف، من قبل ورقة سماكة خفيفة. القرار المحوري يمكن LSFM في بعض الحالات تجاوز القرار المجاهر مبائر. أولا، التحسن في قرار يأتي عندما ورقة الخفيفة هو أرق من القرار المحوري للهدف الكشف، والذي يحدث عادة لعينات كبيرة المصورة مع هدف تضخم منخفض. والطريقة الثانية، كيف يمكن للLSFM منظمة العمل ضد الجوعieve قرار المحوري أفضل، هو الانصهار بطرق عرض متعددة، يتم فيه الجمع بين قرار المعلومات عالية س ص من وجهات نظر مختلفة في كومة صورة واحدة. كومة اندمجت مما أدى لديه قرار موحد الخواص يقترب من قيم قرار في الاتجاه الجانبي 20،21. وتقوم استراتيجية لتسجيل وجهات نظر متعددة على بعضها البعض وصفها في هذه المقالة على استخدام الخرز البوليسترين الفلورسنت كعلامات الائتمانية جزءا لا يتجزأ من الاغاروز حول العينة 20،21.
ونتيجة لتسويق LSFM، هذه التقنية متاحة الآن لشريحة واسعة من العلماء 22. ولذلك، فإن الدافع لكتابة هذا البروتوكول هو لجعل هذه التكنولوجيا في متناول علماء البيولوجيا التطورية التي تفتقر إلى الخبرة العملية في LSFM والحصول بدأ هؤلاء العلماء استخدام هذه التكنولوجيا مع تلك العينات. يستخدم بروتوكول لدينا والتجاري ضوء المجهر ورقة، وهو ما يشكل المجهر ر بسيط من الناحية النظريةقبعة من السهل أن تعمل. ونود أن نذكر بالإضافة إلى غيرها من البروتوكولات الأخيرة لتصوير الزرد مع الاجهزة LSFM محلي الصنع، والتي قد تكون مناسبة للإجابة على الأسئلة معينة 23-25. خيار إدخال آخر لLSFM هي منصات مفتوحة 26،27، والتي تستخدم مبادئ النفاذ المفتوح لجلب ضوء المجهر ورقة إلى المجتمع الأوسع. يمكن العثور على وثائق في كل من الأجهزة والبرمجيات الجوانب في http://openspim.org وhttps://sites.google.com/site/openspinmicroscopy/.
في هذا البروتوكول، ونحن نستخدم الزرد مكتملة العظام كنظام نموذج لدراسة العمليات التنموية مع LSFM. التشكل من العين الزرد هو مثال يؤكد العديد من الفوائد من LSFM. وقد تم بالفعل استخدام LSFM في الماضي لتحقيق تنمية العين في الميداكا 28 وفي الزرد 29،30. في مرحلة مبكرة من التنمية العين ومعقدة لتوجيه الجنين بشكل صحيح للفحص المجهري التقليدي،كما صفار ضخمة لا يسمح للجنين أن يكذب على الجانب مع مركزه تواجه الهدف. ومع ذلك، مع LSFM تصاعد في عمود الاغاروز، وعينة يمكن وضعه بتكاثر. بالإضافة إلى ذلك، خلال فترة الانتقال من الحويصلة البصرية إلى مرحلة كوب البصرية، والعين تخضع إعادة ترتيب تخلقية الرئيسية يرافقه نمو، والتي تتطلب تسجيل ض كومة كبيرة وحقل كبير من الرأي. أيضا لمواجهة هذه التحديات LSFM متفوقة على التصوير متحد البؤر التقليدية. عملية تشكيل كوب الضوئية هي ثلاثية الأبعاد، وبالتالي فإنه من الصعب فهم وتصور فقط عن طريق التصوير من رأي واحد. وهذا يجعل التصوير بطرق عرض متعددة لقرار موحد الخواص مفيدة. بعد تشكيل كوب البصري والشبكية تصبح حساسة على نحو متزايد للتعرض ليزر. وهكذا، فإن الضيائية المنخفضة المصاحبة LSFM هي الميزة الرئيسية للتصوير على المدى الطويل.
هنا نقدم بروتوكول الأمثل للتصوير من 1-3 أيام الزرد القديم الأجنة لالثانية اليرقات مع التركيز على تطوير العين. يسمح أسلوبنا تسجيل الوقت الفاصل بين الأفلام تغطي ما يصل إلى 12-14 ساعة مع القرار المكانية والزمانية عالية. الأهم من ذلك، وتبين لنا أيضا خط أنابيب لمعالجة البيانات، وهي خطوة أساسية في LSFM، وهذا الأسلوب يولد دائما مجموعات البيانات الكبيرة، وغالبا في نطاق تيرابايت.
Protocol
Representative Results
Discussion
1. الخطوات الهامة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها للحصول على البيانات
يمكن العثور على إعدادات التصوير نموذجية لGFP وطلب تقديم العروض التعبير عن عينة في الجدول 3. في الإعداد المجهر وصف ورقة الخفيفة الثابتة، التي شكلتها عدسة اسطوانية. أهداف الإضاءة هما العدسات الهواء والهدف الكشف عدسة المياه غمس. تكبير 1.0 مع 20X / 1.0 أو 40X / 1.0 الأهداف يعطي 230 نانومتر و 115 نانومتر حجم بكسل ومجال الرؤية من 441 س 441 ميكرون أو 221 س 221 ميكرون على التوالي. فمن المستحسن استخدام ضوء ورقة سمك الافتراضي مع المركز إلى الحدود نسبة 1: 2. ل20X / 1.0 هذا السمك يتوافق مع 4.5 ميكرون ول40X / 1،0-3،2 ميكرون في المركز. إذا كانت سرعة التصوير ليست هي الأولوية الأساسية، استخدام مسارات منفصلة في حالة وجود عينة متعدد الألوان لتجنب الحديث المتبادل من الانبعاثات مضان بين القنوات. أعلى سرعة اكتساب يقتصر على 50 ميللي ثانية لكل ض خطوة من قبلسرعة الحركة للسائق ض. إذا كان الهدف هو تحقيق أقصى سرعة التصوير في حالة، على سبيل المثال، مسارين مع إضاءة جانب ومزدوجة، يجب تعيين وقت التعرض ذلك أن مجموع كل الصور التي التقطت في ض الخطوة هو أقل من 50 مللي ثانية. من ناحية أخرى، إذا تم الحصول عليها سوى صورة واحدة لكل ض الخطوة، فإنه ليس من المفيد لضبط وقت التعرض أقصر من 50 مللي ثانية.
| حجم 1920 x 1920 صورة |
| 16-بت |
| محور مسح على |
| إضاءة جانب ومزدوجة مع الانصهار على الانترنت |
| 10X الهدف / 0.2 إضاءة |
| 20X الهدف كشف / 1.0 W خطة-امزيغ |
| المسار 1: الإثارة 488 نانومتر عادة 2٪ من 100 ليزر ميغاواط، 550 نانومتر تصفية الانبعاثات SP |
| المسار 2: الإثارة 561 نانومتر عادة 3٪ من 75 ليزر ميغاواط، 585 نانومتر تصفية الانبعاثات ليرة لبنانية |
| التعرض لفترة تصل إلى 100 مللي ثانية |
| Z سماكة كومة 50-100 ميكرون |
| 1-1.5 ميكرون ض حجم الخطوة في وضع ض حملة مستمرة |
| حضانة في 28.5 درجة مئوية |
الجدول 3: التصوير الإعدادات.
فحص العينة بعد التجربة
ومن المهم التأكد من أن العينة لا تزال سليمة في نهاية التجربة. كما قراءات الأولى، والتحقق من نبضات القلب للعينة تحت المجسام. مع زوج من الملقط حادة العينة التي يمكن اتخاذها للخروج من الاغاروز ونقلها إلى حاضنة لمواصلة تطوير من أجل معرفة ما إذا كان تأثره التصوير. بدلا من ذلك، يمكن أن تكون ثابتة لتلوين الأجسام المضادة.
تصاعد والانجراف
ومن الضروري للحفاظ على الأسمولية من غرفة الصورةolution بالقرب من الأسمولية من الاغاروز التضمين، وتورم غير ذلك / تقلص من الاغاروز وعدم الاستقرار لاحق من ستحدث العينة. ولذلك، استخدم نفس الحل (E3 المتوسطة دون الميثيلين الأزرق) لملء الغرفة ولإعداد 1٪ انصهار منخفضة قسامات نقطة الاغاروز. بالإضافة إلى ذلك، لا تترك الاغاروز في 70 ° C كتلة التدفئة لأكثر من 2 ساعة، لأنها يمكن أن تفقد خصائص التبلور لها.
لا تضمين الأسماك في الاغاروز حار جدا، وهذا يمكن أن يؤدي إلى رد فعل الصدمة الحرارية أو وفاة الجنين. إذا لم تكن متأكدا حول تأثير الاغاروز دافئة على الأجنة، تأكد من أن الذيل لا ينحني وأن معدل ضربات القلب ولا يبطئ. إذا حدث هذا، استخدم جنين مختلفة للتجربة.
الحفاظ على الطول الإجمالي للعمود الاغاروز مع عينة قصيرة (حوالي 2 سم) وجبل الزرد مع رئيسها موجهة نحو رأس المكبس. وبالمثل، فإن اسطوانة الأغاروس مقذوف من capillيجب أن تبقى آرى قصيرة قدر الإمكان. ومن شأن هذه التدابير ضمان الاستقرار من العينة طوال الفيلم. في الوقت نفسه، يجب أن يكون عمود الاغاروز طويلة بما فيه الكفاية بحيث الزجاج الشعرية نفسها لا تصل في مسار الضوء، وهذا من شأنه أن يسبب انكسار كبير والتأمل.
ويتسبب الانحراف الأولي للعينة التي كتبها التغييرات حجم الاسطوانة الأغاروس نفسها. انزلاق المكبس ليست سبب لذلك. وبالتالي، فإنه لا يساعد على إصلاح المكبس مع البلاستيسين أو طلاء الأظافر. الجنين قد تغير موقفها خلال الفيلم بسبب النمو الطبيعي للغاية. وفقا لذلك، فإنه من المستحسن لتوسيط المنطقة من اهتمام في منتصف مجال الرؤية والحفاظ على بعض غرفة على حواف لاستيعاب هذه الحركات.
المبلغ المخفض من تضمين المتوسطة في مسار الضوء
توجيه العينة بشكل صحيح يساعد على تحقيق أفضل جودة ممكنة صورة 15. جينةتجمع، يجب أن الإثارة وانبعاث ضوء السفر من خلال الأنسجة كما تذكر وسائل الإعلام تصاعد ممكن. الحل الأمثل هو التركيب مجانا الاغاروز. وقد تحقق ذلك على سبيل المثال في الإعداد للتصوير نبات الأرابيدوبسيس الجذر الوحشي 14، والذي أقيم في الجذر الرئيسي إلى phytagel وكانت الجذور الجانبية في وقت لاحق السماح للتخلص من العمود هلام تماما. وقد وضعت تصاعد خالية من الاغاروز أيضا للتصوير من التطور الجنيني الكامل لكونفيوسم خنفساء على مدى يومين 12. كان تحسين جودة الصورة ليست الدافع الرئيسي في هذه الحالة. الأجنة كونفيوسم ببساطة لا البقاء على قيد الحياة داخل الاغاروز طويلة بما فيه الكفاية. لم يتم التوصل الى تصاعد خالية من وسائل الاعلام التضمين تماما للتصوير على المدى الطويل في الزرد. ومع ذلك، يمكننا الاستفادة من حقيقة أنه عندما يتصلب الاغاروز، وتتمركز معظم الأجنة قطريا في شعري مع عين واحدة تقع في عمق الاغاروز والعين الثانية يجري على مقربة من سطح العمود التضمين. تانه كثب على السطح توفر جودة صورة متفوقة، وبالتالي ينبغي تصويرها بشكل تفضيلي.
تركيز الاغاروز والتصوير على المدى الطويل
تركيز الاغاروز لتركيب تمثل حلا وسطا بين الاستقرار من العينة وإمكانية لاستيعاب نمو الجنين ونشر الأكسجين إليه. ليس هناك ربح إضافي في استقرار العينة عند استخدام تركيزات الأغاروس أعلى من 1٪. كنقطة انطلاق لتحقيق الاستفادة المثلى من التجارب نوصي 0.6٪ الاغاروز، الذي هو أيضا مناسبة للالأجنة الذين تقل أعمارهم عن 24 HPF التي هي حساسة جدا ليتم تحميلها إلى 1٪ الاغاروز. لتخدير الأجنة القديمة واليرقات، وتركيز MS-222 يمكن أن تثار إلى 200 ميكروغرام / مل من دون آثار جانبية (13).
في حالة يتم تصوير الأجنة النامية لفترة أطول من ± 12 ساعة، لا ينصح الاغاروز تصاعد، لأنه يحد من نمو الجنين ومركز دراساتوفاق ذيل تشوه. تم حل هذه المشكلة لالزرد من تصاعد الأجنة في أنابيب البوليمر محطة إثراء الوقود مع معامل الانكسار مماثل لمياه 13،39. أجنة الفئران، من ناحية أخرى، يمكن أن يجمد في اسطوانات الأغاروس جوفاء 40 أو في ثقوب قضيب الاكريليك تعلق على حقنة 41. لا ينصح محطة إثراء الوقود أنبوب تصاعد كطريقة الافتراضي وذلك لأن جدار الأنبوب ينكسر الضوء أكثر قليلا من الاغاروز.
محاذاة ورقة الخفيفة
للحصول على جودة صورة جيدة من المهم جدا لأداء التلقائي محاذاة ورقة خفيفة قبل كل تجربة. خاصة إذا تم تغيير إعدادات التكبير، اتخذت أهداف خارج، أو استخدمت سائل مختلفة في الغرفة.
إضاءة
وينبغي دائما أن تنشيط المسح محور ورقة الخفيفة. لعينات نثر كبيرة، فمن الضروري تطبيق الإضاءة جانب ومزدوجة مع و الانترنتusion لتحقيق الإضاءة حتى عبر مجال الرؤية. يقلل إضاءة جانب ومزدوجة أيضا مشكلة محددة من التصوير العين، وهو انكسار ورقة الخفيفة واردة من خلال عدسة الجنين. أصغر، عينات أقل نثر ولا يمكن تصوير كفاءة استخدام الإضاءة جانب واحد، والذي يقصر وقت التصوير بمقدار النصف ويمكن أن يؤدي في أفضل قليلا جودة الصورة بالمقارنة مع إضاءة جانب ومزدوجة. وذلك لأن مسارات الخفيفة لمدة الأسلحة إضاءة مختلفة دائما واحدة أكثر كفاءة ويمكن اختيار. بالإضافة إلى ذلك، واثنين من الأوراق الخفيفة القادمة من كل جانب أبدا تماما في طائرة واحدة، والذي يسبب خفيفة وضوح بعد الانصهار. للأحداث داخل الخلايا سريعة جدا، مثل الأنابيب الدقيقة تبعها (فيلم 2)، وإضاءة جانب ومزدوجة ليست مناسبة، لأن الصور مع الإضاءة من اليسار واليمين وحصلت بالتتابع، مما قد يؤدي إلى الضبابية.
photobleaching منوالضيائية
وكثيرا ما يذكر أقل photobleaching من fluorophore كما ميزة كبيرة للLSFM. ونحن يمكننا القول أن الهدف يجب أن يكون هناك photobleaching من على الإطلاق. إذا كان هناك photobleaching من الملاحظ في تجربة التصوير الحية، العينة هو على الارجح بالفعل خارج نطاق الفسيولوجية تعرضه ليزر السكوت عليها. عندما تصوير الأجنة الزرد في المجهر القرص الغزل، في تجربتنا، يمكن الضيائية عالية المماطلة تطور الجنين حتى قبل التبييض إشارة الفلورسنت بشكل ملحوظ. ولذلك، ينبغي تعديل إعدادات التصوير في LSFM بحيث لوحظ ضئيلة أو معدومة photobleaching من. على الرغم من LSFM هو لطيف على العينة، فإنه من الحكمة أن تستخدم فقط بقدر قوة الليزر والتعرض الوقت حسب الحاجة لتحقيق إشارة إلى نسبة الضوضاء كافية لتحليل البيانات لاحقا.
Z المكدس، فترات زمنية وحجم البيانات
الملفات التي تم إنشاؤها من قبل LSFM عادة ما تكون كبيرة جدا. أحيانا في نطاق تيرابايت. غالبا ما يكون من الضروري تقديم حل وسط بين جودة الصورة وحجم البيانات. هذا هو الحال بالنسبة لض المباعدة بين أكوام وفترات في الاستحواذ مرور الزمن بشكل خاص. لتحديد فترات ض، زر الأمثل في علامة التبويب أداة Z كومة ينبغي من الناحية المثالية أن تستخدم، وخاصة إذا كان سيتم deconvolved مجموعة البيانات في وقت لاحق. وتحسب المسافات لتحقيق التداخل 50٪ بين شرائح الضوئية المجاورة. لا يزال، وفترات ض أكبر إلى حد ما وعادة ما تكون مقبولة. أنها تقلل من الوقت اللازم للحصول على ض كومة فضلا عن حجم الملف النهائي. أخذ العينات الوقت الأمثل تعتمد على عملية الفائدة. العيون الشاملة فترات تطوير 5-10 دقيقة مقبولة عادة. وإذا كان بعض الهياكل هي لتعقبها تلقائيا، يجب أن تكون نقطة زمنية لاحقة مماثلة بما فيه الكفاية.
حبات الفلورسنت
حبات الفلورسنت تخدم في المقام الأول علامات كما الإيمانية لتسجيل وجهات نظر مختلفةمجموعة بيانات بطرق عرض متعددة على بعضها البعض. دوامة دائما الحلول حبة جيدا قبل الاستعمال. لا تسخن حبات لأن ذلك يمكن أن يؤدي إلى فقدان صبغة الفلورسنت. تركيز حبة الأمثل لتسجيل بطرق عرض متعددة لابد من تحديد تجريبيا. البرنامج المساعد وصفها يعمل بشكل أفضل مع حوالي 1000 الخرز الكشف خلال كل عرض. تم الكشف عن أكبر (500 نانومتر أو 1000 نانومتر) حبات نحو أقوى من (أقل من 500 نانومتر) حبات صغيرة. وذلك لأن حبات أكبر وأكثر إشراقا وأسهل لقطاع بدون المكتشفة إيجابية كاذبة من الهياكل في العينة. العيب من الخرز أكبر هو أن تكون بارزة جدا في الصورة تنصهر وdeconvolved النهائية. لكل علامة الفلورسنت الجديدة، وحجم حبة المناسب والانبعاثات مضان أن يكون الأمثل. لإعطاء مثال على عينة من الشكل (5) وفيلم 3، وقدم 100 نانومتر حبات الانبعاثات الخضراء كثيرة جدا المكتشفة إيجابية كاذبة في قناة غشاء GFP، ولكن 1000 نتم الكشف عن م حبات الانبعاثات الأحمر بقوة في القناة H2B-طلب تقديم العروض مع عدد قليل جدا من اكتشافات الإيجابية داخل العينة. إذا فشل الكشف حبة في القناة مع علامة فلوري، قناة منفصلة تحتوي فقط حبات يمكن الحصول عليها، ولكن هذا ليس عملي جدا. حبات-قرار اللجنة الفرعية الحجم تعطي قراءات مباشرة وظيفة انتشار نقطة (قوات الأمن الفلسطينية) للمجهر، والتي يمكن استخدامها لdeconvolution (الشكل 2C-D). إذا كان التسجيل والانصهار يعمل بشكل أفضل مع حبات أكبر (على سبيل المثال 1000 نانومتر)، صورة منفصلة من قوات الأمن الفلسطينية يمكن الحصول عليها مع قرار من الباطن، وعلى سبيل المثال، 100 الخرز نانومتر. باستخدام الخرز متعدد الألوان غير مفيدة أثناء تسجيل اكتساب متعددة والتحقق من أن تراكب قنوات تماما.
إضافة الخرز الفلورسنت ليست ضرورية عند التصوير من عرض واحد من دون تسجيل بطرق عرض متعددة لاحق والانصهار. ولكن، حتى في تلك الحالات حبات يمكن أن تكون مفيدة خلال initiaل تعديل ورقة ضوء للتحقق من جودة ورقة الخفيفة وبشكل عام للكشف عن الانحرافات البصرية. هذه الانحرافات البصرية قد تنشأ من مصادر مختلفة مثل الأهداف التالفة أو القذرة، والنوافذ القذرة من غرفة أو التجانس في الاغاروز. ويمكن أيضا أن تستخدم حبات لتصحيح الانحراف عن طريق تسجيل بطرق عرض متعددة فيجي المساعد 20.
بطرق عرض متعددة
لغرض بطرق عرض متعددة إعادة الإعمار، فمن الأفضل للحصول على عدد فردي من وجهات النظر 3 و 5 و هلم جرا، والتي لا تعارض بعضها البعض. هذا يحسن deconvolution حيث يتم تصويرها في PSFs من اتجاهات مختلفة. ومن المهم أيضا أن يؤكد في بداية اكتساب مرور الوقت أن هناك ما يكفي من التداخل بين وجهات النظر. من الأفضل القيام هذا تجريبيا، أي يؤكد على الفور أن وجهات النظر في نقطة لأول مرة يمكن تسجيلها بنجاح. عندما يكون الهدف من عملية الاستحواذ بطرق عرض متعددة هو لزيادة دقةمن صورة لعينة نثر كبيرة، ومن غير المستحسن لصورة العينة بأكملها في كل عرض، ولكن لوقف حول مركز العينة، حيث تتدهور الإشارة. ان اكتساب منخفضة الجودة من النصف الثاني من العينة لا تضيف معلومات مفيدة لإعادة إعمار بطرق عرض متعددة.
2. خطوات حاسمة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لتجهيز البيانات
حاليا، توجد عدة احتمالات لمعالجة البيانات بطرق عرض متعددة من المجهر ورقة خفيفة التي تم توثيقها جيدا وسهلة نسبيا لاعتماده. نحن نستخدم تطبيق بطرق عرض متعددة إعادة الإعمار، وهو برنامج مفتوح المصدر تنفيذها في فيجي 32 (ستيفان Preibisch غير منشورة، 1A لينك و Link1b في قائمة المواد). هذا البرنامج المساعد هو اعادة تصميم كبير من SPIM السابق التسجيل المساعد 20، استعرضبواسطة شميد وآخرون. 42، وإدماج BigDataViewer وXML، وشكل HDF5 33 مع سير العمل تسجيل SPIM (1B الشكل، وصلة 2 ، لينك 3 ). ويمكن تكييف هذا التطبيق أيضا لمجموعة الحوسبة عالية الأداء، مما يسرع بشكل ملحوظ تجهيز 43. تم تطوير هذا التطبيق تسجيل بطرق عرض متعددة بنشاط أبعد من ذلك ويبقى في التحسن. في حالة وجود مشاكل أو طلبات الميزات للبرنامج وصفها، يرجى تقديم القضايا في صفحة جيثب منها ( لينك 4 للبطرق عرض متعددة إنشاء و صلة 5 لBigDataViewer).
الخيار الثاني هو استخدام البرمجيات التجارية المتاحة مع المجهر. هذا الحل يعمل بشكل جيد ويعمل نفس مبدأ استخدام الخرز الفلورسنت لتسجيل وجهات نظر مختلفة. ومع ذلك، فإنه يفتقر إلى الخيار لتصور بيانات كاملة بسرعة كما هو الحال مع BigDataViewer. أيضا البرنامج لا يمكن أن تتكيف مع الكتلة وعلاوة على ذلك الكتل معالجة المجهر للمستخدمين الآخرين، ما لم يتم شراء رخصة إضافية للبرنامج.
أما الخيار الثالث، الذي هو أيضا برمجيات المصدر المفتوح، نشرت مؤخرا من قبل مختبر كيلر 44 وتقدم إطارا شاملا لمعالجة وتحليل المصب من بيانات ورقة الخفيفة. هذا البرنامج يستخدم معلومات من داخل العينة لأداء الانصهار بطرق عرض متعددة، وبالتالي فإنه لا يتطلب وجود حبات الفلورسنت حول العينة. ولكن في الوقت نفسه أنه يفترض التوجه متعامد من آراء التصوير (الأهداف)، لذلك لا يمكن استخدامها لبيانات تم الحصول عليها من زوايا التعسفية 44.
متطلبات الأجهزة
ntent "> الأجهزة المستخدمة لمعالجة يمكن العثور عليها في الجدول رقم 4. يجب أن يكون هناك سعة تخزين كافية وخطوط الأنابيب واضحة لمعالجة البيانات المتاحة، قبل التجربة الفعلية. اقتناء الصور أسرع من تحليل لاحقة وأنه من السهل للحصول على غمرت مع البيانات غير المعالجة. وغالبا ما يكون غير واقعي لتخزين جميع الصور الخام، ولكن بدلا نسخة اقتصاص أو الصور المجهزة مثل وجهات النظر تنصهر، توقعات كثافة القصوى أو إسقاطات كروية 45.| المعالج | اثنين من المعالجات Intel® Xeon® E5-2630 (ستة الأساسية، 2.30 توربو غيغاهرتز، 15 ميغابايت، 7.2 GT / ثانية) |
| ذاكرة | 128 غيغابايت (16 × 8 GB) 1600 ميغاهيرتز DDR3 ECC RDIMM |
| القرص الصلب | 4 × 4 السل ATA التسلسلي 3.5inch شاشة (7.200 دورة في الدقيقة) القرص الصلب |
| HDD المراقب المالي | PERC H310 SATA / SAS كونالمراقب المالي لالدقة ديل |
| تكوين الأقراص الصلبة | C1 SATA 3.5 بوصة، 1-4 أقراص صلبة |
| الرسومات | المزدوج 2 GB NVIDIA كوادرو 4000 (2 بطاقات ث / 2 موانئ دبي و1 DVI-I لكل منهما) (2 DP-DVI و 2 محول DVI-VGA) (MRGA17H) |
| شبكة | إنتل X520-T2 المزدوج ميناء 10 جيجابت إيثرنت بطاقة واجهة الشبكة |
الجدول 4: متطلبات الأجهزة.
سرعة معالجة البيانات
الوقت اللازم لمعالجة البيانات يعتمد على أبعاد البيانات وعلى الأجهزة المستخدمة. في الجدول 1، ونحن نقدم لمحة عامة عن الوقت اللازم للخطوات الرئيسية في معالجة مثال 8.6 GB مجموعة البيانات بطرق عرض متعددة التي تتألف من 1 نقطة زمنية مع 4 جهات النظر و2 القنوات.
| معالجة الصورةفاتر | مرة | خطوة بروتوكول |
| إعادة الحفظ كما HDF5 | 6 دقائق و 30 ثانية | 63 |
| كشف نقاط الاهتمام | 20 ثانية | 6.4 |
| تسجيل باستخدام نقاط الاهتمام | 3 ثانية | 6.5 |
| الانصهار بطرق عرض متعددة على المحتوى | 4 ساعة | 7.2 |
| deconvolution بطرق عرض متعددة (CPU) | 8 ساعة | 7.3 |
| deconvolution بطرق عرض متعددة (GPU) | 2 ساعة | 7.3 |
الجدول 1: معالجة البيانات في الوقت.
صيغ إدخال البيانات لإعادة الإعمار بطرق عرض متعددة
فيجي المساعد بطرق عرض متعددة التعمير يمكن أن تدعم .czi و TIF والأشكال ome.tiff. ويرجع ذلك إلى بنية البيانات من شكل .czi، قواعد البيانات المتقطعة ليستبدعم من دون ما قبل المعالجة. متقطع يعني أن التسجيل كان لا بد من إعادة تشغيل (على سبيل المثال لتعديل المواقف بسبب الانجراف من العينة). في هذه الحالة تحتاج إلى أن يكون resaved كما. TIF الملفات .czi. لملفات .tif كل رأي ويحتاج الاتجاه الإضاءة ليتم حفظها كملف منفصل.
معايرة حجم بكسل
البرنامج المجهر التشغيل بحساب المعايرة لحجم س ص بكسل على أساس الهدف المحدد. ومع ذلك، يتم تعريف حجم بكسل في ض بشكل مستقل من قبل حجم الخطوة. إذا تم تحديد الهدف الخطأ في البرنامج س ص ض إلى نسبة غير صحيح وسيفشل تسجيل.
التسجيل الأولي
بعد تحديد مجموعة البيانات عدد التسجيلات ستكون 1 ووعدد من نقاط الاهتمام يكون 0 في مستكشف ViewSetup. يمثل التسجيل الأولي معايرة البيانات. كل من عدد سسوف التسجيلات و ونقاط الاهتمام تزيد أثناء معالجة.
أخذ العينات باستمرار للكشف عن نقاط الاهتمام
عن طريق أخذ العينات باستمرار ينصح، لأن تحميل الملفات وسوف تجزئة سيكون أسرع بكثير. غير أنه من المهم أن نلاحظ أن المعلمات الكشف ستتغير تبعا لأخذ العينات أسفل، وبالتالي نقل إعدادات الكشف بين مختلف إعدادات عينة أسفل غير ممكن.
الكشف عن نقاط الاهتمام
فإنه من المستحسن أن القطاع عن العديد من الخرز حقيقية ممكن في كل عرض، حتى لو كان الثمن للحصول على بعض المكتشفة إيجابية كاذبة، لأنها لا تعيق تسجيل إلى حد كبير. المكتشفة زائفة، إذا قليل في الأرقام، يتم استبعاد أثناء التسجيل (انظر تسجيل نقاط الاهتمام). ومع ذلك، المكتشفة إيجابية كاذبة ضخمة تشكل مشكلة لالخوارزمية. فهو يقلل من الأداء للكشف ليس فقط والتسجيل، لأنه يأخذ وقتا أطول لجزء من الصورة وكذلك مقارنة هذه الخرز بين وجهات النظر، كما أنه يقلل من دقة تسجيل. يمكن معالجة هذه الحالة باستخدام المعلمات كشف أكثر صرامة. بالإضافة إلى ذلك، على تجزئة من الخرز (أي اكتشافات متعددة على واحد حبة الشكل 1E) غير ضارة للتسجيل ويجب تجنبها.
تسجيل نقاط الاهتمام
لتسجيل وجهات النظر على بعضها البعض، ووصف موقع كل حبة في كل عرض من قبل موقفها فيما يتعلق ثلاثة أقرب الخرز المجاورة لها. هذه الأبراج هي التي تشكل واصف الهندسي المحلي ومحددة لمقارنة كل حبة بين وجهات النظر. ثم تعتبر الخرز مع مطابقة اصف بين وجهتي نظر كما المراسلات مرشح. لاحظ أن هذا يعمل فقط لحبات موزعة بشكل عشوائي، والتي واصفات المحلية هي فريدة من نوعها لكل حبة عادة.يمكن للمرء أن استخدام هياكل أخرى مثل نوى في العينة للتسجيل. ومع ذلك، من أجل الكشف عن نوى، والتي يتم توزيعها بشكل عشوائي غير في العينة، يتم تطبيق أساليب أخرى 20،21.
ثم يتم اختبار المراسلات مرشح ضد توافق العينات العشوائية 36 من أجل استبعاد ايجابيات كاذبة. كل المراسلات يقترح نموذج التحول للتتراكب وجهات النظر على بعضها البعض. أن المراسلات الحقيقية يوافق على الأرجح على نموذج التحول واحدة، في حين أن القيم المتطرفة سيكون كل نقطة إلى واحد آخر. ثم يتم استخدام المراسلات الحقيقية لحساب نموذج تحويل تآلفي بين الرأيين مقارنة. ثم يتم تنفيذ التحسين العالمية مع خوارزمية الأمثل متكررة من خلالها تسجيل جميع الآراء على وجهة النظر الأولى بهدف الحد الأدنى من النزوح بين وجهات النظر 20،21.
تسجيل مرور الزمن
بسبب نقلمنة من حركة السيارات الأغاروس وغير دقيقة للمرحلة المجهر، وموقف كل كومة يختلف بشكل معتدل مع مرور الوقت. في حين أن تسجيل نقطة زمنية الفردية يزيل الفرق بين وجهات نظر هذه النقطة الوقت، يحتاج الوقت الفاصل بين أيضا أن تكون مسجلة ككل. تحقيقا لهذه الغاية، يتم تسجيل كل نقطة زمنية الفردية على نقطة زمنية مرجعية.
نقطة زمنية مرجعية
إذا تم معالجة سلسلة زمنية مع العديد من النقاط الزمنية، يتم تحديد نقطة زمنية تمثيلية كمرجع عادة من منتصف السلسلة الزمنية منذ شدة حبة يمكن أن تتحلل بمرور الوقت نتيجة للتبييض. على هذا المرجع، والمعلمات للكشف عن نقطة اهتمام والتسجيل والمربع المحيط والانصهار يمكن تحديدها. ثم يتم تطبيق هذه المعايير على الفاصل الزمني كله لحساب نموذج التحول محددة لكل نقطة زمنية الفردية. أثناء تسجيل الوقت الفاصل بين كل نقطة زمنية أخرى هي أيضا regist آخرالدو مكانيا على هذه النقطة في الوقت المحدد المرجعية. وهكذا المعلمات المربع المحيط للتسجيل بأكمله واعتمادا على هذه النقطة زمنية محددة.
تسجيل متعدد القنوات
عند التصوير قنوات متعددة، من الناحية المثالية يجب أن تكون نفس الخرز الفلورسنت واضحة في جميع القنوات تصويرها. كشف وتسجيل ويمكن بعد ذلك تجرى على كل قناة على حدة، والتي تأخذ في الاعتبار تأثير موجات الضوء المختلفة على هذا التحول. في كثير من الأحيان لم يكن ذلك ممكنا، لأن حبات تكون غير مرئية في كل القنوات أو الخرز وتهيمن على صورة الكثير في قناة واحدة وقاتمة جدا في قناة أخرى (ق). الحل النموذجي هو استخدام حبات مرئية فقط في قناة واحدة للكشف والتسجيل ونموذج التحول المكتسب (أي بعد الكشف والتسجيل وتسجيل الوقت الفاصل) ثم يتم تطبيقها على القنوات الأخرى التي فيجي> ملحقات> بطرق عرض متعددة Reconstruction> تجهيز الدفعات> أدوات> المكررة التحولات. في القائمة المنسدلة لتطبيق التحول من اختيار قناة واحدة إلى قنوات أخرى. في النافذة التالية حدد XML ثم انقر فوق موافق. ثم اختر القناة التي تحتوي على حبات كقناة المصدر وكقناة الهدف حدد القناة (ق) من دون الخرز. لالمكررة التي تستخدم التحولات استبدال كل التحولات واضغط موافق. ثم يتم نسخ التحولات لجميع القنوات الأخرى، وحفظها في XML. لنرى التحولات الجديدة في مستكشف ViewSetup، إعادة إعمار تطبيق بطرق عرض متعددة.
المربع المحيط
الانصهار من وجهات نظر متعددة وحسابيا مكثفة جدا. ومع ذلك، عادة ما يتم الحصول على الصور كبيرة لاستيعاب ليس سوى عينة، ولكن أيضا حبات من حوله. مرة واحدة المعلمة تسجيليتم استخراج الصورة من الخرز، وأنها لم تعد مفيدة كجزء من الصورة. لذلك، لزيادة كفاءة الانصهار، يجب أن تنصهر فقط أجزاء من مداخن صورة تحتوي على عينة معا. ينبغي تحديد المنطقة ذات الاهتمام (وثاب مربع) لاحتواء عينة وأقل قدر من الاغاروز المحيطة ممكن. على سبيل المثال في الشكل 2 متوسط الانصهار المرجح على وحدة التخزين بالكامل مع 2229 × 2136 × 2106 بكسل يتطلب 38196 ميغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي، في حين مع المربع المحيط هو خفض مستوى الصوت إلى 1634 × 1746 × 1632 بكسل ويتم تخفيض متطلبات الذاكرة إلى 17729 ميغا بايت.
الانصهار بطرق عرض متعددة على المحتوى
ويتمثل التحدي في دمج البيانات بطرق عرض متعددة غير أن الآراء وعادة ما تنتهي فجأة ولا تحتوي على نفس جودة الصورة لنفس voxels. ولذلك فإن المتوسط البسيط للآراء يؤدي إلى مزج القطع الأثرية وتدهور صورة لا لزوم له. على المحتوى بطرق عرض متعددة فو سيون يأخذ كل من هذه المشاكل بعين الاعتبار. أولا، أنه يمزج بين وجهات النظر المختلفة، حيث ينتهي صورة واحدة ويبدأ الآخر، وثانيا، تقوم بتقييم جودة الصورة المحلية وتنطبق أوزان أعلى لأعلى جودة الصورة في الانصهار 21. مقارنة إلى وجهة نظر واحدة هناك تحسنا القرار في ض مع تدهور طفيف للإشارة في س ص (الشكل 2E-H، الشكل 5A-D).
بطرق عرض متعددة deconvolution
deconvolution بطرق عرض متعددة هو نهج آخر لتحقيق الانصهار في وجهات النظر. مع هذا الأسلوب تؤخذ أيضا PSFs من وجهات النظر المختلفة في الاعتبار من أجل استعادة الصورة التي تم convolved من قبل البصريات المجهر. هذه الطريقة بشكل كبير على تحسين جودة الصورة من خلال إزالة صورة طمس وزيادة القرار، وعلى النقيض من إشارة 31 (الشكل 2C-D، الشكل 2I-J، الشكل 5E-G، فيلم 3).
ve_content "> Deconvolution هو حسابيا مكثفة جدا (انظر الجدول 1)، وبالتالي استخدام الجرافيك لمعالجة يزيد من سرعة هذه العملية. كما قد يكون من الضروري إجراء deconvolution على البيانات أسفل عينات. لعينة أسفل، استخدم التعمير فيجي> بطرق عرض متعددة > تجهيز الدفعات> أدوات> تطبيق التحولات وهذا من شأنه تطبيق نموذج التحول الجديد في وجهات النظر التي سيتم حفظها في ملف. xml.تنسيق ملف HDF5 لBigDataViewer وBigDataServer
وBigDataViewer 33 يسمح التصور سهل من البيانات تيرابايت الحجم. كيفية السيطرة على BigDataViewer تتلخص في الجدول 2. سكرينكست العملية الأساسية للبرنامج متاح أيضا كملحق في المنشور الأصلي 33. وتتركز BigDataViewer على ملف. xml، الذي يحتوي على البيانات الوصفية، وملف hdf5، الذي يحتوي على بيانات الصورة. بيانات الصورة هي بريهوالأنف والحنجرة في hdf5 في مستويات القرار متعددة في كتل 3D. مستويات القرار متعددة تسمح لتصور البيانات بشكل أسرع مع دقة أقل، وذلك قبل قرار الكامل هو تحميل. يتم تحميل القطع الفردية فقط في الذاكرة عند الحاجة. وبالتالي، يسمح للشكل صورة hdf5 التصور المباشر والسريع للبيانات عبر BigDataViewer 33. فإنه يسرع أيضا معالجة منذ يتم تحميل الملفات بشكل أكثر كفاءة. ولذلك، فإننا نوصي resaving مجموعة البيانات في هذا الشكل، على الرغم من أنه ليس مطلوبا بشكل صارم لتجهيز. لمزيد من التوضيح من تنسيق البيانات، يرجى الرجوع إلى رابط 3 . بالإضافة إلى ذلك، قواعد البيانات يمكن أن تكون مشتركة مع المتعاونين أو الجمهور باستخدام BigDataServer 33 ( لينك 6 ).
| مفتاح | <td> تأثير|
| F1 | يدل على مساعدة وصفا موجزا للBigDataViewer والعملية الأساسية |
| <> أو عجلة الماوس | الحركة في ض |
| السهم صعودا وهبوطا | تكبير والتصغير |
| انقر بزر الماوس الأيمن واسحب | يتحرك عينة في المشاهد |
| غادر انقر واسحب | تدور عينة حول المؤشر |
| المنزلق في الجزء السفلي من المشاهد أو تبويب والسهم إلى اليسار أو اليمين | التحركات على محور الزمن |
| الضغط بالإضافة إلى التحول | حركة أسرع أو دوران على طول أي محور |
| س ثم اليسار واليمين السهم | تدور حول محور س |
| السهم ذ ثم اليسار واليمين | تدور حول المحور ص |
| ض ثم سهم لليسار واليمين | تدور حول المحور z |
| التحول و x | يوجه الرأي على طول محور س |
| التحول و y | يوجه الرأي على طول المحور ص |
| التحول و z | يوجه الرأي على طول محور ض |
| أنا | التبديل بين وسائط مختلفة الاستيفاء (أي أقرب جار وثلاثي الخطوط) |
| الصورة أو إعدادات> السطوع والتباين | يعدل لون القنوات والسطوع والتباين |
| F6 أو إعدادات> الرؤية والتجميع | يغير المجموعات المعروضة، تمكن تجمع لتتراكب مجموعات مختلفة ويدعو المجموعات عن طريق مفاتيح الأرقام |
| F10 أو أدوات> سجل الفيلم | تستحوذ على سلسلة زمنية من شريحة المعروضة حاليا |
الجدول 2: عارض البيانات الكبيرة.
3. القيود المفروضة على تنفيذ وصفها من LSFM
الإنتاجية المنخفضة
في تجربة نموذجية LSFM فقط هو تصوير نموذج واحد لكل تجربة. ومع ذلك، في تجربتنا، والكثير من المعلومات المفيدة يمكن استخراجها من أن عينة واحدة. وقد تحقق التصوير عالية الإنتاجية من أجنة متعددة في الآونة الأخيرة في منزل بنيت الاجهزة LSFM 46-48، على الرغم من أن عادة على حساب حرية تحديد المواقع عينة والتناوب.
غير كافية عمق تغلغل في الأنسجة
على الرغم من وشفافة الأجنة الزرد، وجودة الصورة التي تم الحصول عليها يتدهور بسرعة عندما التصوير أعمق في النسيج نظرا لتشتتها والامتصاص. جزئيا هذا هو تأثير تشتت وامتصاص مضان المنبعثة من عينة ولا يمكن تصحيحه في الإعداد الحالي. مصدر آخر من جودة الصورة غير المتوازنة هو إضاءة غير النظامية. توقال انه ورقة الخفيفة الحادث من الجانب الأيسر أو الأيمن وأية كائنات في طريقها ينكسر، والذي يؤدي إلى القطع الأثرية شريط وطمس. الإضاءة وبطرق عرض متعددة جانب مزدوج الانصهار يمكن أن يقلل من القطع الأثرية في الصورة النهائية. وأخيرا، فإن جودة الصورة تميل إلى أن تكون أسوأ قليلا نحو هامش مجال الرؤية بسبب هندسة الطبيعية من ورقة الخفيفة، التي أصبحت أكثر سمكا نحو الحواف.
التلاعب الكيميائية محدود
استخدام المخدرات أو المؤثرات على نطاق واسع في مجال البحوث الزرد. في هذا الاستخدام المجهر المخدرات مقيدة، نظرا لحجم كبير من حجرة العينة والاعتبارات المستخدمين الآخرين من الصك، الذين يشتركون في نفس الغرفة. يمكن استخدام غرفة اضافية مخصصة لتجارب المخدرات حل هذه المسألة. ملء الغرفة جزئيا مع الخرز الزجاجي يقلل من حجم السائل ما هو مطلوب.
لا photomanipulation
حاليTLY ليس هناك إمكانية للتلاعب البصرية المترجمة مثل photoconversion، أو الاستئصال بالليزر في هذا المجهر. ومع ذلك، الاجهزة منزل بنيت يمكن استخدامها لمثل هذه التطبيقات المحددة.
4. تطبيقات أهمية والمستقبلية
LSFM هو أفضل وسيلة متاحة حتى الآن للتصوير سريع كميات كبيرة من الأجنة الحية. معظم التجارب التي يمكن تصورها على المجهر متحد البؤر يمكن أيضا أن يؤديها على المجهر ورقة خفيفة مع المزايا المذكورة أعلاه. في حالة التصوير التنمية العين، وسرعة LSFM ليست المعلمة حاسمة. بدلا من ذلك، وانخفاض الضيائية والمرونة في عينة المواقع هي فوائد حاسمة.
البيانات LSFM لها SNR عالية، مما يساعد على تحقيق نتائج جيدة deconvolution وأيضا مفيدة لتحليل الصور الآلي وتتبع الكائن. في الختام، LSFM هو أداة عظيمة لتوليد بيانات قابلة للقياس على التطور الجنيني وoveraخلية ليرة لبنانية وخصائص الأنسجة لنمذجة لاحق والأوصاف المادية للعمليات في السؤال.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We want to thank Tobias Pietzsch for providing his powerful open source software BigDataViewer. We thank the Light Microscopy Facility of the Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics (MPI-CBG), namely Jan Peychl, Sebastian Bundschuh and Davide Accardi for technical assistance, perfect maintenance of the microscopes used in the study and for comments on the manuscript and H. Moon (MPI-CBG Scientific Computing Facility) for the BigDataServer. We thank Julia Eichhorn for assembling the Movie 1. The Norden lab members and Svea Grieb provided many helpful comments on the manuscript. Jaroslav Icha, Christopher Schmied and Jaydeep Sidhaye are members of the International Max Planck Research School for Cell, Developmental and Systems Biology and doctoral students at TU Dresden. Pavel Tomancak is supported by the ERC Starting Grant: Quantitative Analysis of the Hourglass Model of Evolution of Development and Human Frontier Science Program Young Investigator grant RGY0093/2012. Caren Norden is supported by the Human Frontier Science Program (CDA-00007/2011) and the German Research Foundation (DFG) [SFB 655, A25].
Materials
| Lightsheet Z.1 microscope | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Low melting point agarose | Roth | 6351.1 | |
| Low melting point agarose | Sigma | A4018 or A9414 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB/MS-222/Tricaine) | Sigma | E10521 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 500 nm red fluorescent beads F-Y 050 | Millipore (Estapor) | 80380495 | |
| 20 μl (1mm inner diameter, marked black) capilllaries | Brand | 701904 | sold as spare part for transferpettor |
| Teflon tip plungers for 20 μl capillaries | Brand | 701932 | sold as spare part for transferpettor |
| Circular glass coverslips diameter 18 mm, selected thickness 0.17 mm | Thermo scientific (Menzel-Glaser) | ||
| O-rings for chamber windows 17×1.5 mm | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Tweezers, style 55 | Dumont | 0209-55-PO | |
| 50 ml Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 300865 | |
| 150 cm extension cable for infusion compatible with Luer-Lock syringes | Becton Dickinson | 397400 | |
| Links | |||
| Link 1 Multiview reconstruction application | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration http://fiji.sc/Multiview-Reconstruction | ||
| Link 2 BigDataViewer | https://github.com/bigdataviewer | ||
| Link 3 BigDataViewer | http://fiji.sc/BigDataViewer | ||
| Link 4 Multiview reconstruction application-issues | https://github.com/bigdataviewer/SPIM_Registration/issues | ||
| Link 5 BigDataViewer-issues | https://github.com/bigdataviewer/bigdataviewer_fiji/issues | ||
| Link 6 BigDataServer | http://fiji.sc/BigDataServer. |
References
- Pantazis, P., Supatto, W. Advances in whole-embryo imaging: a quantitative transition is underway. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (5), 327-339 (2014).
- Truong, T. V., Supatto, W. Toward high-content/high-throughput imaging and analysis of embryonic morphogenesis. Genesis. 49 (7), 555-569 (2011).
- Keller, P. J. Imaging Morphogenesis: Technological Advances and Biological Insights. Science. 340 (6137), 1234168-1234168 (2013).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., DeLaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophoton. 6 (11-12), 920-928 (2012).
- Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat Meth. 12 (1), 23-26 (2015).
- Chen, B. C., Legant, W. R., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998-1257998 (2014).
- Keller, P. J., Ahrens, M. B. Visualizing Whole-Brain Activity and Development at the Single-Cell Level Using Light-Sheet Microscopy. Neuron. 85 (3), 462-483 (2015).
- Pampaloni, F., Chang, B. -. J., Stelzer, E. H. K. Light sheet-based fluorescence microscopy (LSFM) for the quantitative imaging of cells and tissues. Cell Tissue Res. 360 (1), 129-141 (2015).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Light sheet microscopy. Quantitative Imaging in Cell Biology. , 193-215 (2014).
- Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. 141 (11), 2361-2361 (2014).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Maizel, A., von Wangenheim, D., Federici, F., Haseloff, J., Stelzer, E. H. K. High-resolution live imaging of plant growth in near physiological bright conditions using light sheet fluorescence microscopy. Plant J. 68 (2), 377-385 (2011).
- Swoger, J., Muzzopappa, M., Lòpez-Schier, H., Sharpe, J. 4D retrospective lineage tracing using SPIM for zebrafish organogenesis studies. J Biophoton. 4 (1-2), 122-134 (2010).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Wu, Y., Ghitani, A., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (43), 17708-17713 (2011).
- Sarov, M., Barz, C., et al. A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila. bioRxiv. , 028308 (2015).
- Amat, F., Lemon, W., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat Meth. 11 (9), 951-958 (2014).
- Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat Meth. 7 (6), 418-419 (2010).
- Preibisch, S., Rohlfing, T., Hasak, M. P., Tomancak, P. Mosaicing of single plane illumination microscopy images using groupwise registration and fast content-based image fusion. SPIEMed Imaging. 6914, 69140E (2008).
- Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat Meth. 12 (1), 30-34 (2015).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital Scanned Laser Light-Sheet Fluorescence Microscopy (DSLM) of Zebrafish and Drosophila Embryonic Development. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (10), (2011).
- Pinto-Teixeira, F., Muzzopappa, M., Swoger, J., Mineo, A., Sharpe, J., Lòpez-Schier, H. Intravital imaging of hair-cell development and regeneration in the zebrafish. Front Neuroanat. , (2013).
- Keller, P. J. In vivo imaging of zebrafish embryogenesis. METHODS. , 1-11 (2013).
- Pitrone, P. G., Schindelin, J., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat Meth. 10 (7), 598-599 (2013).
- Gualda, E. J., Vale, T., Almada, P., Feijò, J. A., Martins, G. G., Moreno, N. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat Meth. 10 (7), 599-600 (2013).
- Martinez-Morales, J. R., Rembold, M., et al. ojoplano-mediated basal constriction is essential for optic cup morphogenesis. Development. 136 (13), 2165-2175 (2009).
- Strzyz, P. J., Lee, H. O., Sidhaye, J., Weber, I. P., Leung, L. C., Norden, C. Interkinetic Nuclear Migration Is Centrosome Independent and Ensures Apical Cell Division to Maintain Tissue Integrity. Dev Cell. 32 (2), 203-219 (2015).
- Young, L. K., Jarrin, M., Saunter, C. D., Quinlan, R., Girkin, J. M. Using SPIM to track the development of the focal power of the zebrafish lens. SPIE BiOS. 9334, 933408 (2015).
- Preibisch, S., Amat, F., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat Meth. 11 (6), 645-648 (2014).
- Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
- Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat Meth. 12 (6), 481-483 (2015).
- Brown, M., Lowe, D. G. Invariant Features from Interest Point Groups. Proceedings of the British Machine Vision Conference. , 23.1-23.10 (2002).
- Saalfeld, S., Fetter, R., Cardona, A., Tomancak, P. Elastic volume reconstruction from series of ultra-thin microscopy sections. Nat Meth. 9 (7), 717-720 (2012).
- Fischler, M. A., Bolles, R. C. Random sample consensus: a paradigm for model fitting with applications to image analysis and automated cartography. Commun ACM. 24 (6), 381-395 (1981).
- Zolessi, F. R., Poggi, L., Wilkinson, C. J., Chien, C. -. B., Harris, W. A. Polarization and orientation of retinal ganglion cells in vivo. Neural Dev. 1 (1), 2 (2006).
- Stepanova, T., Slemmer, J., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). J Neurosci. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish. J Vis Exp. (84), e51119 (2014).
- Udan, R. S., Piazza, V. G., Hsu, C. W., Hadjantonakis, A. K., Dickinson, M. E. Quantitative imaging of cell dynamics in mouse embryos using light-sheet microscopy. Development. 141 (22), 4406-4414 (2014).
- Ichikawa, T., Nakazato, K., et al. Live imaging and quantitative analysis of gastrulation in mouse embryos using light-sheet microscopy and 3D tracking tools. Nat Protoc. 9 (3), 575-585 (2014).
- Schmied, C., Stamataki, E., Tomancak, P. Open-source solutions for SPIMage processing. Methods Cell Biol. 123, 505-529 (2014).
- Amat, F., Höckendorf, B., Wan, Y., Lemon, W. C., McDole, K., Keller, P. J. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat Protoc. 10 (11), 1679-1696 (2015).
- Schmid, B., Shah, G., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 1-10 (2013).
- Gualda, E. J., Pereira, H., Vale, T., Estrada, M. F., Brito, C., Moreno, N. SPIM-fluid: open source light-sheet based platform for high-throughput imaging. Biomed Opt Express. 6 (11), 4447-4456 (2015).
- McGorty, R., Liu, H., Kamiyama, D., Dong, Z., Guo, S., Huang, B. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt Express. 23 (12), 16142-16153 (2015).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., et al. Spatial and Temporal Features of the Growth of a Bacterial Species Colonizing the Zebrafish Gut. mBio. 5 (6), e01751-14-8 (2014).
