Summary

Estudar Wnt Signaling Durante Padronização de conduzir Airways

Published: October 16, 2016
doi:

Summary

A utilização de ratinhos repórter acoplado ao conjunto de montagem e a secção de coloração, microscopia e ensaios in vivo facilita a análise dos mecanismos subjacentes à padronização normal do tracto respiratório. Aqui descrevemos a forma como estas técnicas contribuiu para a análise de sinalização Wnt durante o desenvolvimento traqueal.

Abstract

Wnt signaling pathways play critical roles during development of the respiratory tract. Defining precise mechanisms of differentiation and morphogenesis controlled by Wnt signaling is required to understand how tissues are patterned during normal development. This knowledge is also critical to determine the etiology of birth defects such as lung hypoplasia and tracheobronchomalacia. Analysis of earliest stages of development of respiratory tract imposes challenges, as the limited amount of tissue prevents the performance of standard protocols better suited for postnatal studies. In this paper, we discuss methodologies to study cell differentiation and proliferation in the respiratory tract. We describe techniques such as whole mount staining, processing of the tissue for confocal microscopy and immunofluorescence in paraffin sections applied to developing tracheal lung. We also discuss methodologies for the study of tracheal mesenchyme differentiation, in particular cartilage formation. Approaches and techniques discussed in the current paper circumvent the limitation of material while working with embryonic tissue, allowing for a better understanding of the patterning process of developing conducting airways.

Introduction

Desenvolvimento das vias respiratórias é iniciada por dia embrionário 9 (E9) com a aparência de células positivas Nkx2.1 no intestino anterior ventral endodérmica 1,2. Separação tubo esofágico-traqueal irá resolver por E11.5 quando os tubos podem ser distinguidos como entidades distintas, cada um rodeado por tecido mesenquimal 3. Sinalização Wnt desempenha um papel chave na especificação do tracto respiratório como supressão de WNT2 e Wnt2b, expressa pelo mesênquima esplânenico e eliminação de β-catenina do epitélio respiratório endodérmica irá resultar em agenesia pulmonar 4,5. Os nossos estudos anteriores determinaram que a eliminação do WLS, um receptor de mediar a secreção de carga de todos os ligandos de Wnt, a partir dos resultados do tracto respiratório em endoderme hipoplasia pulmonar, defeitos no desenvolvimento vascular pulmonar e mis-padronização do mesênquima traqueal 6,7. Estes dados sustentam a importância da cro epitelial-mesenquimalSS falar na diferenciação celular e especificações, como também foi demonstrado em outros estudos 8,9.

O estudo dos estágios iniciais do desenvolvimento do pulmão depende genética, in vitro e técnicas ex vivo que nos permitiram compreender melhor os mecanismos de condução identidade respiratória 10-16. Culturas de explantes de pulmão inteiro na interfase líquido de ar têm sido amplamente utilizados para estudar os efeitos de fatores de crescimento nos estágios iniciais de pulmonar ramificação morfogênese 10,17,18. Enquanto este método é utilizado como leitura de alterações morfológicas, tais como ramificação morfogénese, e modulação da expressão do gene, que se limita ao estudo de fases iniciais do processo de desenvolvimento, como a cultura em si não suporta o desenvolvimento da vasculatura 17. Desenvolvimento da cartilagem traqueal requer tempos de incubação mais longos que podem ser não é compatível com esta técnica de cultura.

para analyze o papel da sinalização de Wnt durante a formação do trato respiratório, que se adaptaram técnicas padrão para atender as necessidades de nossos estudos embrionárias. Nós modificamos volumes, tempos de coloração, ciclismo de processamento para inclusão em parafina e tempo para o esclarecimento de tecido traqueal-pulmão. O principal objetivo de otimizar as técnicas descritas no presente estudo foi analisar os primeiros estágios de desenvolvimento traqueal em ratos que ocorrem a partir de E11 a E14.5. Usando os ratos repórter linha Axin2LacZ nós sites de determinada com precisão de atividade / β-catenina Wnt no mesênquima traqueal em desenvolvimento. Nós também se adaptaram procedimento de coloração lectina para o tecido traqueal montagem todo. Assim, fomos capazes de visualizar condensações mesenquimais e prever locais onde chondrogenesis terão lugar. Coloração de toda montagem e seções de tecido embrionário obtidas a partir de ratos WlsShhCre, juntamente com técnicas avançadas de microscopia, permitiu-nos a desvendar o papel de ligantes Wnt produzidos pelo traepitélio traqueal no padrão traqueal.

Protocol

Os animais foram alojados em condições sem agentes patogénicos. Os ratos foram tratados de acordo com os protocolos aprovados pela CCHMC Institutional Animal Care e Use Committee (Cincinnati, OH EUA). Os ratinhos utilizados ao longo destes estudos foram mantidas num fundo misto. 1. Montagem Total X-galactosidase Coloração Eutanásia fêmea grávida em E11.5 a E14.5, por inalação de CO 2. Coloque animais em CO 2 câmara, carregar a câmara com CO 2…

Representative Results

atividade / β-catenina Wnt Whole montagem Lac-Z coloração foi detectado no tecido traqueal-pulmão de embriões isolados de repórter Axin2 Lac-Z ratos 11. Sites de coloração indicar atividade / β-catenina Wnt. Análise de secções de toda a coloração de montagem determinado que a actividade / β-catenina Wnt estava presente no mesênquima da traqueia e no mesênquima de regi?…

Discussion

Eventos subjacentes a morfogénese do tracto respiratório não são completamente compreendidos, em particular os processos necessários para a modelação das vias aéreas condutoras. Estudos anteriores têm utilizado técnicas ex vivo, em que explantes em desenvolvimento são cultivadas na interfase ar-líquido ou embebido em matrigel 21,22. Estes estudos têm mostrado como factores de crescimento influenciam o padrão da traqueia desenvolvimento e a formação de cartilagem traqueal. Uma limitaç…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nós reconhecemos a assistência de Mike Muntifering e Matt Kofron com imagem confocal e Gail Macke com os procedimentos histológicos. Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health-NHLBI (K01HL115447 para DS).

Materials

Anti Sox9 ab. Millipore AB5535 1:400 , rabbit
Anti Sox9 ab. Santa Cruz Sc-20095 1:50, rabbit
Anti Smooth Muscle Actin ab. Sigma A5228 1:2k, mouse
Anti NKX2.1 ab. Seven Hills n/a 1:100, guinea pig
Anti NKX2.1 ab. Seven Hills n/a 1:400, mouse
Anti Brdu ab. Abcam AB1893 1:200, sheep
Anti Brdu ab. Santa Cruz Sc-32323 1:4k, mouse
PNA Lectin Sigma L 7381
Secondary antibodies Life technologies Alexa fluor Molecular probes
K3Fe(CN)6 Sigma P8131
K4Fe(CN)6 Sigma-Aldrich P3289
MgCl2 Sigma-Aldrich M9272
NaDOC Life Technologies 89905
NP4O Life Technologies 85124
Alcian Blue 8GX Sigma A-3157
Fisher brand super-frost plus Fisher 12-550-15
PFA (16%) EMS 15710
PBS Gibco 70011-044
Fetal Calf Serum Sigma 11K413
Blocking reagent Invitrogen Component of TSA kit #2    ( T20932)
BrDu Sigma B5002-5g
Vectashield mounting medium Vector labs H-1000
Permount Fisher SP15-500
Tissue-loc cassettes Histoscreen Fisher C-0250-GR
Biopsy cassettes Premiere BC0109 Available in different colors
Nuclear fast red  Kernechtrot 0.1% Sigma N3020
Citric acid Sigma C1909-500G
Sodium citrate tribasic dihydrate Sigma S4641-1Kg
Trizma hydrochloride Sigma T5941-500G
Xylene Pharmco-AAPER 399000000
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200
Micro knives FST 10318-14
Dumont #5 ceramic coated FST 11252-50
Dumont #5CO FST 11295-20
Dumont # 5 FST 91150-20
Thermo/Shandon Excelsior ES Thermo Fisher
Microtome Leica RM2135
Nikon i90 Nikon Wide field microscope
NikonA1Rsi Nikon Confocal microscopy. Settings:NikonA1 plus camera, scanner: Galvano, detector:DU4. Optics Plan Apo lambda 10x. Modality: Widefield fluorescence laser confocal. 
Leica MS 16 FA Leica Fluorescence Dissecting microscope
Zeiss Zeiss Automated fluorescence microscope
Leica Application suite Leica Leica imaging software
NIS Nikon Nikon imaging software
IMARIS Bitplane Imaging processing software

References

  1. Maeda, Y., Dave, V., Whitsett, J. A. Transcriptional control of lung morphogenesis. Physiol Rev. 87, 219-244 (2007).
  2. Morrisey, E. E., Hogan, B. L. Preparing for the first breath: genetic and cellular mechanisms in lung development. Dev Cell. 18, 8-23 (2010).
  3. Fausett, S. R., Klingensmith, J. Compartmentalization of the foregut tube: developmental origins of the trachea and esophagus. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1, 184-202 (2012).
  4. Goss, A. M., et al. Wnt2/2b and beta-catenin signaling are necessary and sufficient to specify lung progenitors in the foregut. Dev Cell. 17, 290-298 (2009).
  5. Harris-Johnson, K. S., Domyan, E. T., Vezina, C. M., Sun, X. beta-Catenin promotes respiratory progenitor identity in mouse foregut. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 16287-16292 (2009).
  6. Cornett, B., et al. Wntless is required for peripheral lung differentiation and pulmonary vascular development. Dev Biol. 379, 38-52 (2013).
  7. Snowball, J., Ambalavanan, M., Whitsett, J., Sinner, D. 34;Endodermal Wnt signaling is required for tracheal cartilage formation". Dev Biol. , (2015).
  8. Shannon, J. M., Hyatt, B. A. Epithelial-mesenchymal interactions in the developing lung. Annu Rev Physiol. 66, 625-645 (2004).
  9. Shannon, J. M., Nielsen, L. D., Gebb, S. A., Randell, S. H. Mesenchyme specifies epithelial differentiation in reciprocal recombinants of embryonic lung and trachea. Dev Dyn. 212, 482-494 (1998).
  10. Li, C., et al. Wnt5a regulates Shh and Fgf10 signaling during lung development. Dev Biol. 287, 86-97 (2005).
  11. Loscertales, M., Mikels, A. J., Hu, J. K., Donahoe, P. K., Roberts, D. J. Chick pulmonary Wnt5a directs airway and vascular tubulogenesis. Development. 135, 1365-1376 (2008).
  12. Yin, Y., et al. An FGF-WNT gene regulatory network controls lung mesenchyme development. Dev Biol. 319, 426-436 (2008).
  13. Shu, W., et al. Wnt/beta-catenin signaling acts upstream of N-myc, BMP4, and FGF signaling to regulate proximal-distal patterning in the lung. Dev Biol. 283, 226-239 (2005).
  14. Bretholz, A., Morrisey, R., Hoffman, R. S. The use of OpdA in rat models of organic phosphorus (OP) poisoning. Toxicology. 257, (2009).
  15. Goss, A. M., et al. Wnt2 signaling is necessary and sufficient to activate the airway smooth muscle program in the lung by regulating myocardin/Mrtf-B and Fgf10 expression. Dev Biol. 356, 541-552 (2011).
  16. Mucenski, M. L., et al. beta-Catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278, 40231-40238 (2003).
  17. Hyatt, B. A., Shangguan, X., Shannon, J. M. FGF-10 induces SP-C and Bmp4 and regulates proximal-distal patterning in embryonic tracheal epithelium. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287, L1116-L1126 (2004).
  18. Del Moral, P. M., et al. VEGF-A signaling through Flk-1 is a critical facilitator of early embryonic lung epithelial to endothelial crosstalk and branching morphogenesis. Dev Biol. 290, 177-188 (2006).
  19. Ott, S. R. Confocal microscopy in large insect brains: zinc-formaldehyde fixation improves synapsin immunostaining and preservation of morphology in whole-mounts. J Neurosci Methods. 172, 220-230 (2008).
  20. Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. 3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy. Organogenesis. 5, 145-148 (2009).
  21. Park, J., et al. Regulation of Sox9 by Sonic Hedgehog (Shh) is essential for patterning and formation of tracheal cartilage. Dev Dyn. 239, 514-526 (2010).
  22. Elluru, R. G., Thompson, F., Reece, A. Fibroblast growth factor 18 gives growth and directional cues to airway cartilage. Laryngoscope. 119, 1153-1165 (2009).
  23. Ahnfelt-Ronne, J., et al. An improved method for three-dimensional reconstruction of protein expression patterns in intact mouse and chicken embryos and organs. J Histochem Cytochem. 55, 925-930 (2007).
  24. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158, 945-958 (2014).
  25. Gillotte, D. M., Fox, P. L., Mjaatvedt, C. H., Hoffman, S., Capehart, A. A. An in vitro method for analysis of chondrogenesis in limb mesenchyme from individual transgenic (hdf) embryos. Methods Cell Sci. 25, 97-104 (2003).
  26. Cohen, E. D., et al. Wnt signaling regulates smooth muscle precursor development in the mouse lung via a tenascin C/PDGFR pathway. J Clin Invest. 119, 2538-2549 (2009).
  27. Boucherat, O., et al. Partial functional redundancy between Hoxa5 and Hoxb5 paralog genes during lung morphogenesis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 304, L817-L830 (2013).

Play Video

Cite This Article
Snowball, J., Ambalavanan, M., Sinner, D. Studying Wnt Signaling During Patterning of Conducting Airways. J. Vis. Exp. (116), e53910, doi:10.3791/53910 (2016).

View Video