In Vitro Smontaggio del virus influenzale A capsids per centrifugazione in gradiente

Virus influenzale A (IAV) è un virus con involucro e appartiene alla famiglia delle Orthomyxoviridae. I suoi geni sono codificati su un segmentato, negativo-senso e di genoma a singolo filamento di RNA. Negli esseri umani, IAV provoca infezioni respiratorie, che si verificano in epidemie stagionali e porta il potenziale di pandemie globali ^1. Al legame con residui di acido sialico sulla superficie della cellula ospite ^2, IAV è internalizzata per endocitosi clatrina-dipendente e le vie clatrina-indipendenti ^3-8. L'acido ambiente (pH <5,5) nei vacuoli endocitici innesca un importante cambiamento conformazionale della IAV picco glicoproteina emoagglutinina (HA), che si traduce in fusione del virale e la fine della membrana ⁹ endosomal. Una volta che il capside IAV (qui noto anche come "core" virale) è sfuggito da endosomi ritardo (LES), è non rivestito nel citosol seguito dal trasporto dei ribonucleoproteine ​​virali (vRNPs) nel nucleo – il sito oreplicazione del virus F e trascrizione ^10-13. Prima all'attivazione acido HA del virus subisce una progressiva diminuzione del pH nel sistema endocitico, che innesca il nucleo per il suo successivo smontaggio ^14-16. In questo "priming" passo i canali ionici M2 nella membrana virale mediare l'afflusso di protoni e K ^+10,14,16. La variazione della concentrazione ionica nell'interno virus disturba le interazioni costruire dal virale proteine ​​della matrice M1 e gli otto vRNP fascio, e facilita IAV uncoating nel citoplasma seguente fusione della membrana ^10,14-17.

Analisi diretta e quantitativa della fase di caricamento è stata ostacolata dal fatto che endosomi sono di difficile accesso sperimentalmente. Il processo di inserimento è inoltre altamente non sincrono. Inoltre, i test end-point, come qRT-PCR di misure di RNA o di infettività virale rilasciate, non forniscono un quadro dettagliato sullo stato biochimico del Capsi viraled in qualsiasi punto di entrata. Mentre perturbazione di endosomi di siRNA o trattamento farmacologico ha contribuito in modo significativo alla comprensione della IAV ingresso ^18-20, messa a punto è difficile e soggetta a effetti collaterali non specifici nel programma endosome maturazione strettamente controllato.

Per evitare questi problemi, abbiamo adattato un protocollo precedentemente sviluppato in vitro basato sull'uso di gradiente di velocità di centrifugazione ^17. A differenza di altri tentativi di ^{21,22, 23,24,} che sono stati in gran parte basati su combinazioni di taglio proteolitico e il trattamento detergente seguita da analisi EM, questo approccio ha consentito un risultato facilmente quantificabile. Centrifugazione attraverso diversi strati gradiente permette alle particelle di sedimentazione per essere esposti e reagiscono con mutevoli condizioni in modo controllato. Nel protocollo presentato, IAV derivato dal liquido allantoico chiarito o particelle virali purificate sedimentate in una glicerolo a due stratigradiente in cui lo strato inferiore contiene il detergente non ionico NP-40 (Figura 1). Come il virus entra nel secondo strato, detergenti contenenti, i lipidi busta e busta glicoproteine ​​virali sono delicatamente solubilizzate e lasciati alle spalle. Il nucleo, composto da otto vRNP fascio e circondato da uno strato di matrice, sedimenti come una struttura stabile nella frazione pellet. proteine ​​essenziali virali, quali M1 e nucleoproteina vRNP-associato (NP), possono essere identificati in pellet mediante SDS-PAGE e colorazione Coomassie. In particolare, approfittando di gel gradiente disponibili in commercio e colorazione con l'colloidale altamente sensibile Coomassie ^25, permette alta precisione e rilevamento di quantità anche minime di proteine ​​essenziali associate virali.

Questo pone le basi per testare se le condizioni diverse, come il pH, la concentrazione di sale, e fattori uncoating putativi avere effetto sul comportamento di sedimentazione delle componenti di base e il nucleo stabil lità. A questo scopo, solo il strato detergenti contenenti più bassa nel gradiente di glicerolo viene modificato introducendo il fattore o condizione di interesse. La tecnica è stata particolarmente prezioso nelle indagini l'effetto di differenti valori di pH e concentrazioni saline sull'integrità del nucleo IAV ^16. Passi intermedi di IAV uncoating potrebbero essere monitorati compresa dissociazione dello strato di matrice a pH leggermente acido (<6.5) seguita da vRNP dissociazione a pH 5,5 ed inferiore ^16,17 (figura 1). Quest'ultima fase è stata ulteriormente potenziata dalla presenza di alta K ⁺ concentrazione nello strato di glicerolo, riflettendo un ambiente ritardo endocytic ^16. Così, come il virus e il nucleo sedimentate attraverso il gradiente hanno sperimentato un ambiente che cambia che imita le condizioni in endosomi. Il risultato è stato uno smontaggio graduale del nucleo virale in vitro, integrando i risultati derivati ​​da test di biologia cellulare.

t "> Il metodo presentato qui ha permesso veloce e analisi altamente riproducibile di IAV (X31 e A / WSN / 33) e IBV (B / Lee / 40) uncoating innescato da pH acido e aumentando K ^+16,17 così come lo smontaggio di core paramyxovirus su esposizione pH alcalino ^17. Non si può escludere che l'approccio può essere adattato ad altri virus con involucro di acquisire conoscenze in proprietà biochimiche della struttura del capside virale e capside smontaggio durante l'immissione delle cellule.