Saç Folikül hançer Endings Yaşam Sinir Terminal Etiketleme Optik İzleme<em> Ex Vivo</em> Fare Kulak Cilt
Summary
Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
Abstract
Bir yeni bir diseksiyon ve kayıt tekniği optik izleme boyama ve fare kulak kepçesi derisinde saç köklerinin çevresinde mızrak şeklinde terminalleri de boyaması için tarif edilmektedir. Hazırlık güvenilir yoğun vezikül geri dönüşüm çalışmalarında kullanılan stiril piridinyum boyaların alımını ve serbest çalışmaya sinir terminallerinin yaşayan çok sayıda etiketli birimlerinin geniş bölgeleri verimli, basit ve nispeten hızlı. etiketleme öncesi hazırlıkları subdividing tek bir kişi aynı kulakta kontrol karşılaştırmalar vs testi sağlar. Yararlı ipuçları hazırlanması, etiketleme ve görüntüleme parametrelerinin kalitesini artırmak için verilmiştir. Bu yeni sistem farmakolojik tahlil ve alımı ve her ikisi de vahşi tip mızrak şeklinde terminallerinde vital boyaların ve genetik olarak tadil edilmiş hayvanların serbest mekanik olarak indüklenmiş için uygundur. etiketleme yoğunluğuna düzenleyici etkilerin örnekler verilmiştir.
Introduction
Genellikle deri veya diğer çevre dokularda derinliklerine gömülü olarak mechanosensory sinir uçları, yerinde erişmek için, genellikle küçük diffüz dağıtılan ve zordur. Görselleştirerek, bu nedenle genellikle, yeşil veya sarı floresan proteini (GFP / YFP) 1 ile floresan etiketler genetik ekspresyonu fare hatları elde etmek için bir uzun immunolabeling / boyama süresi veya gecikme ve gider ardından Kesit gerektirir. Burada uygun bir doku ve çalışma için kıl folikülü afferentleri çok sayıda erişmek için hızlı ve basit bir yöntem göstermek ve hızlı bir şekilde terminali fonksiyon 2 optik izlenmesi için etiketli nasıl. Uygulama ile, görüntüleme diseksiyonu bütün teknik olarak en az 2 saat içinde tamamlanabilir.
duyusal akson hançer terminalleri her biri, memelilerde saç köklerinin saç folikülünün epiteli etrafında palisades oluştururlar innerveglial / Schwann hücresi arasında sıkışmış terminali 2-4 işler. Terminallerin amacı, çevreleyen kılların mekanik deplasman tespit etmektir. Bunlar hızlı ve yavaş uyum uçları bir karışımıdır, ancak ağırlıklı olarak saç hareketine yanıt olarak faaliyet öbekler üretir. Tipik haliyle, ateş hatta sürekli yer değiştirme varlığında, çok hızlı bir şekilde hareket sona erer durur.
Optik yöntemlerle mızrak şeklinde terminalleri çalışmak için bu fare kulak kepçesi modeli bu uçlarının yapısını ve fonksiyonunu çalışmak için birçok avantajlı özelliğe sahiptir. kulak kepçesi cilt baskın olarak iki tabakası arasında, kıkırdak dokusunun sadece küçük bir miktarı ile, arka arkaya yapıştırılır. Cilt nedeniyle vücudun diğer bölgelerine zayıf yapıştırıcı bağ dokusu nazaran az miktarda çok ince ve kolay disseke. Kolayca ayrılan deri katmanları, bu nedenle, köklerinin ve terminallere iyi erişim sağlar. innervasyonkolay erişilebilir ve tanımlanabilir. saç folikülleri daha seyrek köklerinin tek tek veya küçük gruplar görüntüleme kolaylaştırılması, diğer cilt bölgelerinde daha dağıtılır. İnce yatan dermal tabaka o kadar başka bir işleme tabi floresan mikroskobu ile görüntüleme için idealdir, boyalar ve farmakolojik ilaçlara iyi erişilebilirlik verir. fiksasyon ve daha fazla histolojik işlem sonrasında, bir sabitlenebilir boya analog kullanıyorsanız etiketli terminalleri görüntüleme, canlı terminalleri olabilir ya da ya.
Bu emme (endositoz) ve stiril piridinyum boya (FM1-43 serbest bırakılması (ekzositozu) ile kanıtlandığı geri kazanım mızrak şeklinde uçları meydana gelir, zarı, göstermek için bu hazırlık kullandık; A ^ – (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) stiril) piridinyum dibromür). Boya değil, ancak önemli ölçüde yatırım Schwann hücresi 2 süreçleri etiket yok gibi görünüyor. Ayrıca bu boya alımı / serbest olduğunu göstermiştir ve dolayısıyla r zareCycling, bir atipik (fosfolipaz D-bağlı) metabotropik glutamat reseptörü aracılığıyla glutamaterjik modülasyon bağlıdır. Basit uyarıcı ve analiz protokollerinin sonuçları gösterilmektedir ve ortak potansiyel analiz sorunlar da vurgulanır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bewick ve Betz ilk N- piridinyum sinaptik vezikül membran yerel geri dönüşüm izlemek için stiril piridinyum boyalar 7-10 dibromür ilgili (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (dibutilamino) stiril) geliştirdi. Boya alımı ve bu nedenle artan flüoresans nedenle sinaptik vezikül membran içselleştirme (endositoz) yansıtır. Daha sonra, bu içselleştirilmiş boya ileri elektriksel aktivite ile yeniden serbest bırakılabilir, boya kaybını gösteren kese zarı dışsallaştırılmasını (ekzositoz) izler. sinaps, bu nörotransmitter salgılanması için bir proxy. Aynı zamanda, biz de bu boyalar birincil mechanosensory sinir uçlarını 7 etiket bulundu. Daha yakın zamanlarda 11, Bewick, Bankalar ve arkadaşları daha sonra bu olgun, farklılaşmış mechanosensory terminalleri ex vivo benzer bir süreç yansıttığını gösterdi. Burada yine, boyalar glutamat serbest bırakmak için yapısal geri dönüşüm 50 nm çapında 'sinaptik benzeri' veziküller (SLV) etiket.mechanosensory terminallerde, onların sinaptik meslektaşları aksine, bu geri dönüşüm öncelikle kendiliğinden gerçekleşir. Ayrıca, mekanik, yerine sadece elektriksel stimülasyon tarafından modüle edilir.
Kültüründe ve koklea saç hücreleri, özellikle de genel stiril piridinyum boyada stiril boyalar duyusal nöronlar için mechanosensory kanal bloke edilmesi ve geri dönüşü olmayan iç membranlar 12 etiketleme mechanosensory kanalları boyunca geçmeye gösterilmiştir. Ancak, kas iğ 11 2, veya la sonlara hançer sonlara burada yerinde farklılaşmış mechanosensory terminalleri, karşılaştırılabilir stiril boya konsantrasyonlarında ve mekanik 13, 14 uyarılmış değil saç hücreleri, etiketleme membran endositoz gereğidir. Mechanosensory sinir terminalleri, örneğin, etiketleme döner ve 2, 11, 1 Burada kullanılan konsantrasyonlarda mechanosensory yanıtları bloke etmezBu sonlar kanal nüfuz bazı boya içselleştirilmesi tamamen göz ardı edilemez iken 5., Latrotoxin ile yakın toplam destain olgun terminalleri etiketleme büyük çoğunluğu geri dönüşüm vezikül membranı ile içselleştirme yoluyla olduğunu gösterir. Dolayısıyla biz, boyaların alımı ve salınımı üzerindeki ilaç etkilerini inceleyerek, en son, mechanosensory afferent terminallerde SLV geri dönüşüm farmakoloji 2 aktivitesi bağımlılığını 11 incelemek için bu tekniği kullanılır ve var.
En pratik tekniklerle olduğu gibi, tekrarlanabilirlik tekrarı ve pratik gerektirir. güvenilirliğini sağlamak için bazı temel noktaları şimdi ele alınacaktır. genç hayvanlarda mızrak şeklinde etiketleme daha güvenilir – biz kullanılan en küçük hayvan 15 g vücut ağırlığı oldu. Bu durumda neden tam olarak belli değil, ama genç bağ dokusu diseksiyon daha az mekanik travma ve le gerektirir çünkü olabilirinnervasyon tabaka üzerinde uzanan doku çıkarırken aves az bir tortu kalmıştır.
Genel olarak, doku hazırlanması sadece yaşlı farelerde daha sonra ayrı cilt katmanları soyulma olmanın teknik açıdan en zorlu pratik yönü ile oldukça basittir. Bunlarda, diseksiyon başladığı yerde deri katmanları üssünde güçlü bir arada yapışır, ama burada bile katmanları ayırma marjları karşı çok daha kolay olur. genellikle ön cildi olduğu gibi Neyse ki, ya da belki de bu nedenle, bu ince marjinal deri bölgeleri genellikle, en tatmin edici etiketleme verir. Bu nedenle, özellikle kenarlarında çok ince cilt açgözlü kaçının. Hasar riskini en aza indirmek, doğrudan kapalı forseps ile iterek yerine tutarak dolaylı hazırlıkları işlemek veya olası temel kavramak sadece sert dokuların etiketlenmesine eğer. Bu ana beni olduğu gibi hemen folikülleri örten 'levha polistiren' katmanı kaldırarak eksiksiz olmasıgörüntüleme ve ilaç erişimine chanical tıkanıklığı. Ancak, hemen altında yatan bu zararlar gibi yapılar (yani uzak şeritler) sinir ağları ve terminalleri ile fiziksel temas en aza indirmek için esastır. baskın floresan yağ bezlerinde sarı / beyaz ise, saç şaft üsleri ve sarı / turuncu hançer uçlarının birkaç hilal belirgin otomatik floresan, bu sinir pleksus tabakası ve ilgili hançer terminalleri açıklığı sırasında kaldırılmıştır gösterir. Bu eski (> 30 g) fareler ile ana sorun olarak karşımıza çıkmaktadır. boyama işlemleri boyunca, her 30 ° C 'de ve de oksijenli sağlar. etiketli terminaller hala hayatta olduğunu unutmayın. Sonuç olarak, boya devam eden spontan (kurucu) ekzositik sürümü tarafından salgılanan edilecektir. Bu R / T'de daha yavaş olacaktır, ancak boya kaybını en aza indirmek için, şelasyon çözüm ve görüntüleme kaldırılması arasındaki gecikmeyi en aza indirmek için iyi bir uygulamadır. Ayrıca için gruplar arası karşılaştırma amaçlı Syoğunluk tudies, tüm grupların görüntüleme sağlamak esastır zaman uyumlu olduğunu. görüntüleme önce bir boya kenetleme maddesinin kullanılması, büyük ölçüde görüntü kontrastını geliştirir. Yani, nispeten pahalı iken, şelasyon adım iyi görüntü kalitesini sağlamaktan oldukça önemlidir. kullanımlar arasında 4 ° C'de depolandığında, 3 gün üst üste – şelasyon kullanımı bile 2 çözüme birden çok kez yeniden kullanarak minimize edilebilir ve. onun boya haciz doygunluğunu yaklaşıyor gösteren belirgin pembe gider kez şelasyon çözüm atın.
görüntüleme sırasında, yoğunluk ve uyarma ışık pozlama süresi hem de kümülatif sonucudur bu canlı terminallere fototoksik hasar potansiyelinin farkında olmak. Bu husus görüntü kalitesi birincil endişe tek timepoint görüntüler için daha az önemlidir. Bununla birlikte, en az uyarım ışık maruz kalmasını azaltmak için kinetik çalışmalarda tekrar görüntüleme sırasında çok önemlidir. Bu boyalar geliştirirkenEtiket sinaps, biz sinir terminallerine dramatik ve onarılamaz hasara neden olur tam güç uyarma aydınlatmada> 1 dakika uyarma bulundu. İlk akabinde, büyük ölçüde genişletebilir 15 dakika aralığında bir süre boyunca tam olarak daraltmak. Biz sistematik maruz kalma süresi ve yoğunluğu göreceli katkıları test etmedi, ama bu gözlemler temel ilke, hem en aza indirmek olmalıdır düşündürmektedir. Yani, uyarma ışık şiddeti ve süresi iyi görüntü alma ile orantılı minimum ve uygun kontrol görüntüleri zaman ders çalışmalarında alınması tavsiye edilir. Her zaman noktasında, veri tekrarlanan görüntüleme koşulları altında fototoksisite etkilenmez olmadığını test etmek için önceden görüntülenmemiş terminalin ek görüntü almak. Bu naif terminallerde etiketleme davranış köklerinin defalarca görüntülü benzerlik sağlamaktır.
Bir dizi faktör net yoğunluk d grup içi değişkenliği azaltabilirata. uygunsuz boyama hatta küçük alanlarda büyük ölçüde arası folikül veri değişkenliği etkileyebilir olarak ROI doğru yerleştirilmesi, özellikle arka plan ROI, önemlidir. Net yoğunluğu değişkenliği de her saç folikülü uçlarının palisade çevrilidir nasıl tamamen etkilenir. Kuşatma derecesi ilgili bir parametre, örneğin karşılaştır Şekil 2'de görülen hemen hemen tamamen dairesel bir şekil Şekil 1B hilal şeklinde markalama dağılımı. Daha karmaşık analizi, belki de otomatik yazılım algılama ve eşikleme kullanılarak gereklidir. Hatta en doğru şekilde analiz folikül grupları için yoğunluk dağılımları normal nüfus medyan ziyade araçlarının arasında tedavi karşılaştırmalar için parametrik olmayan istatistik kullanımını gerektiren, (bakınız Şekil 3) dağıtılan olmadığını unutmayınız. Böyle bir yüzdesi o kadar yoğunlukları ifade olarak Normalleştirme teknikleri,Ya da bir kontrol grubuna f karşı kontrol birçok preparatlar kadar daha değişkenliği azaltmak için uygulanabilir yaptı. dikkate alınması gereken nihai teknik öğe farmakolojik test için deneysel tasarım. Farmakolojik araştırmalar sırasında, boya uygulama öncesi 30 dakika boyunca ilaç çözeltisi içinde hazırlanmasını önceden inkübe edin. Daha sonra, boya çözeltisi içinde ilaç konsantrasyonunu korumak. ilaç, bir araç, tuzlu su ve aracın içinde eritildi, eğer kontrol olarak, ya tuzlu su kullanın veya.
Bu makale, bu yeni kulak kepçesi hazırlık küçük bir hazırlık ile deride mechanosensory sonlar yüksek kaliteli görüntüler sunar gösterilmiştir. Biz de vezikül geri dönüşüm iki kritik yönlerini farmakoloji incelemek için kullanılabilir göstermektedir. Biz bir glutamat reseptör agonisti boya içselleştirilmesi (endositoz bir belirteci) artırabilir ve ikinci, bu boya latrotoxin (ekzositoz bir uyarıcı) ile tekrar kayıp olduğunu ilk gösteriyor. Bu preparat önemiiyon ve teknik terminal fonksiyonu, yapısı ve onların arası ilişkileri optik izlenmesi için eşsiz fırsatlar verecek, görüntüleme deneyleri için yerinde cilt mechanosenory terminalleri yaşayan mükemmel erişim sunuyor olmasıdır. Bu ikinci amaçla, biz de birleşik optik / elektrofizyolojik çalışmalar (detaylar için kardeş vallahi makalesine bakın) kullanılmak üzere daha da geliştirdik.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
iş Britanya Tıp Araştırma Konseyi projesi hibe GSB için G0601253 ve SG 've GSB bir SULSA Bioskape hibe ile finanse edildi
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
