Оптический мониторинга живых нервных окончаний в Маркировки волосяной фолликул ланцетные окончаниями<em> Ex Vivo</em> Мышь уха кожи
Summary
Here we describe a novel preparation for imaging live lanceolate sensory terminals of palisade endings that innervate mouse ear skin hair follicles during staining and destaining with styryl pyridinium dyes.
Abstract
Роман рассечение и записи методика описана для оптического окрашивания мониторинга и де-окрашиванием ланцетными терминалов, окружающих волосяные фолликулы в коже ушной раковины мыши. Препарат прост и относительно быстро, надежно уступая обширные участки множественных помеченных единиц живой нервных терминалов для изучения поглощения и высвобождения пиридиния красителей стириловых широко используются в исследованиях утилизации везикул. Разбиением препараты перед мечения позволяет тест по сравнению с контролем сравнения в том же ухе от одного индивидуума. Полезные советы приведены для повышения качества подготовки, маркировки и параметров формирования изображения. Эта новая система пригодна для опробования фармакологически и механически-индуцированное поглощение и высвобождение этих жизненно важных красителей в ланцетными терминалы в обоих дикого типа и генетически модифицированных животных. Примеры модуляторными воздействий на интенсивность маркировки приведены.
Introduction
Механосенсорных нервные окончания , как правило , малы, диффузно распределены и трудно получить доступ на месте, так как они, как правило , похоронены глубоко в кожу или другие окружающие ткани. Визуальное их, поэтому, как правило , требует секционирования с последующим длительным иммунноокрашивания / окрашивания периода или задержки и за счет получения линий мышей с генетической экспрессии флуоресцентных меток , таких как зеленый или желтый флуоресцентный белок (GFP / YFP) 1. Здесь мы показываем удобную ткань и быстрый и простой способ , чтобы получить доступ к большому количеству волосяного фолликула афферентов для исследования, и как они могут быть быстро маркировано для оптического мониторинга функции терминала 2. С практикой, вся техника от рассечения к визуализации может быть завершена в качестве лишь 2 часа.
В ланцетные терминалы сенсорных аксонов, иннервирующих фолликулы волос у млекопитающих образуют частоколы вокруг эпителия волос фолликула, с каждымТерминал зажатой между глиальных / Шванн клеточных процессов 2-4. Цель терминалов для обнаружения механического перемещения волосков они окружают. Они представляют собой смесь быстро и медленно адаптирующихся окончаний, но они в основном производят короткие всплески активности в ответ на движение волос. Как правило, стрельба останавливается очень быстро, когда движение прекращается, даже при наличии непрерывного перемещения.
Это мышиное Пина модель для изучения ланцетовидные терминалов оптическими методами имеет множество выгодных возможностей для изучения структуры и функции этих окончаний. Ушной раковины преимущественно два слоя кожи, соединенной спина к спине, только с небольшим количеством хрящевой ткани между ними. Кожа очень тонкая и легко рассекают за счет минимальных количеств слабо клеевой соединительной ткани по отношению к другим областям тела. Легко разлученных слои кожи, таким образом, дают хороший доступ к фолликулах и терминалов. иннервациилегко доступны и идентифицировать. Волосяные фолликулы более редко распределены, чем в других регионах кожи, облегчая визуализацию отдельных или небольших групп фолликулов. Тонкий основной дермальный слой обеспечивает хорошую доступность для красителей и фармакологических препаратов, поэтому идеально подходит для работы с изображениями с помощью флуоресцентной микроскопии без дальнейшей обработки. Изображений меченых терминалов могут быть либо живых терминалов или, если используется аналог поправимо красителя, после фиксации и последующей гистологической обработки.
Мы использовали этот препарат , чтобы показать , что мембрана рециркуляции происходит в ланцетными окончаний, о чем свидетельствует поглощение (эндоцитоз) и выпуска (экзоцитоза) от стирильная пиридиния красителя (FM1-43 N – (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (дибутиламино) стирильная) пиридиний дибромид). Краситель не означает, однако, как представляется, значительно маркировать инвестирование Шванн клеточных процессов 2. Мы также показали, что поглощение этого красителя / выпуска, и, следовательно, мембраны гecycling, подлежит глутаматергической модуляции через нетипичное (фосфолипаза D-связанных) метаботропного рецептора глутамата. Результаты простых стимуляции и анализа протоколов проиллюстрированы и общие вопросы анализа потенциала также выделены.
Protocol
Representative Results
Discussion
Бьюик и Бец первоначально разработан N- (3-triethylammoniumpropyl) -4- (4- (дибутиламино) стирильную) пиридиний дибромид связанных стирильная пиридиния красителей 7-10 контролировать местную рециркуляцию синаптических мембран везикул. поглощение красителя, и, следовательно, увеличился флуоресценции, поэтому отражает синаптические везикулы мембраны интернализации (эндоцитоза). В дальнейшем эта усвоены краситель может быть переиздан дальнейшей электрической активности, показывающий потерю красителя контролирует везикул мембраны экстернализацию (экзоцитоз). В синапсах, это прокси-сервер для секреции нейромедиатора. В то же время, мы также обнаружили , эти красители первичной метки механосенсорных нервных окончаний 7. Совсем недавно 11, Бьюик, Банки и коллеги тогда показали , что это отражает аналогичный процесс в зрелых, дифференцированных механосенсорных терминалов бывших естественных условиях. Здесь снова, красители маркировать 50 Диаметр "синаптические типа" везикулы нм (КРН), которые перерабатывают конститутивно выпустить глутамат.В механосенсорных терминалах, в отличие от своих синаптических аналогов, эта переработка в первую очередь спонтанно. Он также модулируется с помощью механического, а не просто электрический, стимуляции.
Для сенсорных нейронов в культуре , так и в клетках волос улитке стириловых красителей в общем и стирилового пиридиния красителя , в частности , было показано , что проходят через механосенсорных каналы, блокируя механосенсорных каналы и необратимо маркировки внутренних мембран 12. Тем не менее, в сопоставимых концентрациях стирильная красителя в дифференцированных механосенсорных терминалов на месте, как и здесь , в ланцетовидными окончаний 2, или в Ia окончаний мышечных веретен 11, а также в клетках волос, которые не механически стимулированных 13, 14, маркировка с помощью мембранной эндоцитоза. В механосенсорных нервных окончаний, например, маркировка является обратимым и не блокирует механосенсорных ответов в концентрациях , используемых здесь , 2, 11, 15. В то время как некоторые интернализации красителя канала просачивания в этих окончаний не может быть полностью исключена, почти полное destain с latrotoxin указывает на значительное большинство маркировки в зрелых терминалах интернализации с рециркуляцией везикул мембраны. Мы, таким образом, использовал эту технику для изучения активности зависимость 11 и, совсем недавно, фармакологию 2 рециркуляции SLV в механосенсорных афферентных терминалов путем изучения эффектов препарата на поглощение и высвобождение красителей.
Как и в большинстве практических методов, воспроизводимости требует повторения и практики. Некоторые из ключевых моментов для обеспечения надежности теперь будет обсуждаться. Ланцетные маркировка у молодых животных является более надежным – самым маленьким животным мы использовали 15 г веса тела. Не совсем понятно, почему это так, но это может быть потому, что рассечение младшей соединительной ткани требует меньше механической травмы и ЛеAves менее оставшийся остаток при удалении ткани, прилежащие иннервации слой.
В целом, подготовка ткани довольно проста, с облупившейся слои кожи друг от друга, являющийся наиболее технически сложный практический аспект, а затем только в старых мышей. В эти слои кожи сильно прилипать друг с другом у основания, где начинается рассечение, но даже здесь разделение слоев становится гораздо легче в направлении периферии. К счастью, или, возможно, следовательно, эти тонкие краевые участки кожи, как правило, дают наиболее удовлетворительные маркировки, как это делает переднюю кожу в целом. Поэтому, в частности, избежать захвата очень тонкой кожи на полях. Чтобы свести к минимуму риск повреждения, манипулировать препаратов косвенно путем нажатия с закрытыми щипцами, а не хватать непосредственно, или если важно зажимают только жесткие ткани вряд ли подлежит обязательной маркировке. Будьте внимательны при удалении слой 'лист полистирола' немедленно вышележащих фолликулы, так как это основной мненическое препятствие к визуализации и доступа наркотиков. Тем не менее, важно , чтобы свести к минимуму физический контакт с базовыми структурами , так как это ущерб (то есть, отсекает) нейронных сетей и терминалов чуть ниже. Если преобладающий флуоресценции желтый / белый в сальных железах, видным автофлуоресценции оснований для волос вала и несколько полумесяцев оранжевого / желтого ланцетными окончаний, это указывает на то, нервное сплетение слой и связанные с ланцетовидными терминалы были удалены во время очистки. Это, как представляется, главная проблема со взрослыми (> 30 г) мышей. На протяжении процедуры окрашивания, обеспечивают все при температуре 30 ° C и хорошо насыщенной кислородом. Имейте в виду, что меченые терминалы все еще живы. Следовательно, краситель будет секретируется постоянной спонтанной (конститутивным) exocytic выпуска. Это будет медленнее при R / T, но это хорошая практика, чтобы свести к минимуму задержку между удалением раствора хелатор и обработки изображений, чтобы свести к минимуму потери красителя. Кроме того, для межгруппового сравнительные секtudies интенсивности, необходимо обеспечить визуализацию всех групп время соответствием. Использование агента красителя хелаты до визуализации значительно улучшает контрастность изображения. Таким образом, в то время как относительно дорогой, шаг комплексообразования является весьма важным для обеспечения хорошего качества изображения. Использование хелатор может быть сведено к минимуму за счет повторного Раствор несколько раз, и даже на 2 – 3 дня подряд, при хранении при 4 ° С между использованием. Отменить решение хелатор как только она идет заметно розовый, показывая его поглощение красителя приближается к насыщению.
Во время визуализации, быть в курсе потенциал для фототоксического повреждения этих живых терминалов, что является совокупным результатом как по интенсивности и времени экспозиции возбуждающего света. Это соображение является менее важным для одного временной точки изображения, где качество изображения является основной заботой. Тем не менее, это имеет решающее значение при повторном визуализации в кинетике исследований с целью уменьшения возбуждения освещенности до минимума. При разработке этих красителей вметка синапсы, мы обнаружили, возбуждение в течение> 1 мин при полной мощности освещения возбуждения вызовет резкое и непоправимый ущерб нервных окончаний. Сначала они впоследствии расширить огромно, а затем полностью разрушиться в течение ~ 15 мин. Мы не систематически проверять относительный вклад времени экспозиции и интенсивности, но эти наблюдения позволяют предположить, руководящим принципом должно быть, чтобы минимизировать оба. Таким образом, рекомендуется, чтобы интенсивность света возбуждения и продолжительность минимум соизмеримы с получением хороших изображений, а также соответствующие контрольные изображения принимаются в времени курса обучения. Для того, чтобы проверить, что данные не затрагиваются фототоксичности при повторных условиях формирования изображения, в каждый момент времени принимают дополнительное изображение ранее не открывавшейся терминала. Это должно гарантировать, поведение маркировки в наивных терминалах напоминает, что в фолликулах изображаемого неоднократно.
Ряд факторов может уменьшить изменчивость внутри группы чистой интенсивности дата. Точная размещение трансформирования, в частности, фон ROI, имеет важное значение, так как даже небольшие участки неприемлемом окрашивания может сильно повлиять на изменчивость данных между фолликула. Изменчивость чистой интенсивности также зависит от того, как полностью каждый волосяной фолликул окружен частоколом окончаний. Сравните, например, в форме полумесяца распределение маркировки на рисунке 1В с почти полностью круговой схеме видно на рисунке 2. Более сложный анализ, возможно , с использованием автоматизированного обнаружения программного обеспечения и пороговую, необходимы , если степень окружения является важным параметром. Обратите внимание , что распределение интенсивности даже наиболее точно проанализированных фолликула групп не являются нормально распределенными (смотри рисунок 3), что вызывает необходимость использования непараметрических статистических данных для последующей обработки между сравнения медианы населения , а не средств. Нормализация методы, такие как выразить силу света в процентах OF контралатеральной контроль, или контрольной группы из нескольких препаратов, могут быть применены для дальнейшего снижения изменчивости. Окончательный технический пункт будет рассмотрен экспериментальный дизайн для фармакологического тестирования. В ходе фармакологических исследований, предварительно инкубировать препарата в растворе лекарственного средства в течение 30 мин перед нанесением красителя. Затем, поддерживать концентрацию лекарственного средства в растворе красителя. В контрольной группе, используют либо соль, либо, если препарат растворяется в транспортном средстве, физиологический раствор плюс транспортное средство.
В данной статье показано, как этот новый препарат Пина предлагает высококачественные изображения механосенсорных окончаний в коже с минимальной подготовкой. Мы также покажем это может быть использован для изучения фармакологии двух важнейших аспектов утилизации везикул. Покажем сначала, что агонист рецептора глутамата может увеличить интернализации красителя (маркер эндоцитоза), а во-вторых, что краситель потерян снова с latrotoxin (стимулятором экзоцитоза). Значение этого подготовка трионов и методика является то , что он предлагает отличный доступ к живой кожи mechanosenory терминалов на месте для проведения экспериментов с изображениями, предоставляя уникальные возможности для оптического мониторинга терминальной функции, структуры и их взаимосвязей. Для этого последнего конца, мы также разработали его в дальнейшем для использования в комбинированных оптических / электрофизиологических исследований (см сестра Jove статью для более подробной информации).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа финансировалась UK Medical Research Council грант проекта G0601253 к GSB и РБГ и грант SULSA Bioskape к GSB
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Andres, K. H. On the microstructure of receptors on sinus hair. Z. Zellforsch. Mikrosk. Anat. 75, 339-365 (1966).
- Shenton, F., Bewick, G. S., Banks, R. W. A study of the expression of small conductance calcium-activated potassium channels (SK1-3) in sensory endings of muscle spindles and lanceolate endings of hair follicles in the rat. PLoS One. 9, e107073 (2014).
- Liley, A. W. An investigation of spontaneous activity at the neuromuscular junction of the rat. J. Physiol. 132 (3), 650-666 (1956).
- Suzuki, M., Ebara, S., Koike, T., Tonomura, S., Kumamoto, K. How many hair follicles are innervated by one afferent axon? A confocal microscopic analysis of palisade endings in the auricular skin of thy1-YFP transgenic mouse. Proc. Jpn. Acad. Ser. B. Phys. Biol. Sci. 88 (10), 583-595 (2012).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S., Ridge, R. M. Intracellular movements of fluorescently labeled synaptic vesicles in frog motor nerve terminals during nerve stimulation. Neuron. 9 (5), 805-813 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical monitoring of transmitter release and synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. J. Physiol. 460 (1), 287-309 (1993).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Drew, L., Wood, J. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3, (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22 (10), 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Physiol. Soc. 21, P22 (2010).
