Fare Saç Folikül hançer Endings de Mekanik Uyarılmış Afferent Çıkışı ve Sinir Terminali Etiketleme Kombine Kaydı
Summary
A simple and novel technique for recording afferent discharge due to mechanical stimulation of lanceolate terminals of palisade endings innervating mouse ear skin hair follicles is presented.
Abstract
Bir roman diseksiyon ve kayıt tekniği fare kulak kepçesi kılların mekanik değiştirmesi ile uyarılmış izleme afferent ateş tarif edilmiştir. teknik çok maliyetli ve kolay yaygın çoğu elektrofizyoloji laboratuvarlarında bulunan, ya da kolayca satın alınan malzemeler ile üstlenilen olduğunu. Diseksiyon tescilli yazılım tarafından kontrol edilen bir jenerik elektroseramik gofret tarafından sağlanan mekanik deplasman, kolay ve hızlı. Aynı yazılım aynı zamanda kayıt ve elektronörogram çıkışını analiz eder. uyarılmış sinir aktivitesinin kayıt yangın cilalı standart cam Mikroelektronlar bağlı ticari bir diferansiyel amplifikatör geçer. Yararlı ipuçları hazırlanması, stimülasyon ve kayıt kalitesini optimize etmek için kayıt koşullarına kalitesini artırmak için verilmiştir. Sistem yanı sıra, saç foliküllerinin çit sonlar hançer terminallerinin elektrofizyolojik ve optik özelliklerini tahlil için uygundurfarmakolojik ve / veya genetik manipülasyon gelen sonuçları. bir stiril piridinyum hayati boya ile mekanik stimülasyonu ve etiketleme ile elektrik kayıt birleştirerek bir örneği verilir.
Introduction
duyusal akson hançer terminalleri memelilerde saç köklerinin saç şaft epiteli etrafında palisades oluştururlar innerve. Onların amacı, çevreleyen kılların mekanik deplasman tespit etmektir. Onlar hızlı ve yavaş ağırlıklı saç hareketine karşılık olarak faaliyet öbekler üreten sonlar adapte bir karışımdır. hareket bile devam deplasman varlığında, durduğunda Etkinlik çok hızlı bir şekilde sona erer. Burada yapının karşılıklı çalışmalar için bu fare kulak kepçesi modelinin geliştirilmesi tarif ve mızrak terminallerinde işlev görür. kepçesi, bu uçlarının çalışmak için birçok avantajlı özelliğe sahiptir. Birincisi, kulak kepçesi folikülleri ve terminaller erişime engel arasındaki derinin esasen iki kat az diğer doku ile, back-to-back apposed olduğunu. Cilt nedeniyle sert bağ dokusu minimal miktarda çok ince ve kolay disseke. innervasyon kolayca erişilebilir ve tanımlanabilir. saç follicl ikenes nispeten seyrek mekanik köklerinin tek tek veya küçük gruplar uyarılmasını kolaylaştırmak, dağıtılır, mevcuttur. İnce yatan dermal tabaka farmakolojik ilaçlar ve boyalar ile sinir terminallerine iyi erişilebilirlik verir. Bu floresan mikroskobu kullanarak görüntüleme çalışmaları için onları özellikle idealdir. görüntüleme ya yaşayan terminallerde veya sabitleme ve ileri histolojik işlenmesinden sonra olabilir.
Mechanosensory nöronların yanıtları saç köklerinin geleneksel izole cilt hazırlıkları 3,4, bir dereceye kadar, 1,2 burun kılı kemirgen çalışılmıştır edilmiş ve innerve. Bu saç şaft çevreleyen sinir uçlarında mechanosensory fizyolojisinin genel prensipleri hakkında bize çok öğretti. vibrissal hazırlık Tek bir saç folikülünün hareketi üzerinde nefis kontrol sağlar. Ancak, vibrissal olarak, onun karmaşıklığı nedeniyle çıkış deşifre etmek zor olabilirfolikülleri anatomik farklı mechanosensory biten 5 en az 8 farklı türlerini içeren ve belirli elektrofizyolojik yanıtları bu morfolojik tip eşleştirme hala anlaşmazlık konusudur. Fare deri / safen sinir hazırlığı en sık ağrı ve dokunma yanıtları araştırmak için kendi depilated halde kullanılır. Böyle bir hazırlık saç köklerinin innervasyon daha az karmaşık ama saç köklerinin yoğunluğu, artı yakın 6 üç farklı folikül türleri (bekçi, Awl / auchene ve zikzak kıllar) varlığı, belirli yanıtları okuyan demektir tek bir folikül veya biten tek tip tekrar meydan okuyor. Ayrıca, bu hazırlık kompleks diseksiyon içerir. Son olarak, vibrissal ve diğer cilt preparatlar hem de, preparasyonlar hayatta ex vivo da dahil uçlarının zaman güç olmaktadır. Bu durumda, dokunun kesit GFP-ifade fare hatları da gereklidir. Alternatif, böyle Immünofloresan için fiksasyon ve / veya antikor inkübasyon gibi diğer immünolojik / histolojik işlem gerektirir.
Bu nedenle kulak kepçesi hazırlık geliştirdi ve saç folikülü afferentleri sınırlı bir nüfus elektrik kayıtları yapmak için kullanılan ve membran bisiklet stiril piridinyum boyaların alımını kanıtladığı bu hançer sonlar, meydana göstermektedir var. Son olarak, boya bu mechanotransduction kanallarını bloke etmediğini gösterir mekanik duyarlılık ile birlikte etki etmediğini göstermektedir. Basit uyarıcı ve analiz protokollerinin sonuçları gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, hızlı bir şekilde çıkarılmasına olanak nispeten basit bir hazırlama geliştirdik düşük saç folikülü bir yoğunluğa sahiptir ve saç köklerinin az sayıda görece seçici bir mekanik uyarıya sağlar. Bu mekanik olarak uyarıldığında saç folikülleri, tanımlanmış elektrofizyolojik yanıtları yani görüntüleme folikülleri görselleştirmek için uygulamayı boya verilen yanıtlar da dahil elektrofizyolojik kayıt ve canlı hücre floresan görüntüleme için kolayca erişilebilir. Biz yapmadıysanız olsa da, bu sistem aynı zamanda tek bir birim (tek duyusal akson) kayıt için duyusal sinir alt-bölünmesi ve duyusal terminali biten morfoloji görselleştirmek için hedeflenen GFP-ifadesini kullanarak kolayca müsait görünüyor.
Biz içselleştirme ve floresan membran stiril Pridinyum boyaların 7 sürümü özelliklerini araştırmak için kulak cilt hazırlığı kullanmış, bir teknik aslında lokalize Vesic incelemek için geliştirilensinaptik terminallerde 8 le membran geri dönüşüm. Sinapslarda, görüntüleme da kolaylıkla tespit terminali 8,9 yanıtların aynı anda elektrofizyolojik kayıt ile birleştirilir. Biz ilk boyalar da mechanosensory sonlar 10 tarafından içselleştirilmiş edildi kaydetti bu ilk çalışmalarda oldu. Kültürde ve koklea saç hücreleri duyusal nöronlar için, stiril piridinyum boyalarla etiketleme çok onlar sonra 11,12 blok mechanosensory kanalları, geçen boyalar dahil görünüyor. boyalar daha sonra hücre içi membranlar etiket ve bu etiketleme geri döndürülemez. Ancak saç hücreleri mekanik 13,14 uyarılmış olmadığını ve tamamen farklılaşmış birincil duyu siniri kas iğ 15 la sonlara olarak yerinde terminalleri, ve burada 7 hançer sonlara içinde stiril boya etiketleme membran endositoz yansıtacak gibi görünüyor etiketleme geri dönüşümlüdür ve mechanosensory res bloke olmadığından7,15,16 ponses. Bu sonlar kanal nüfuz bazı boya içselleştirilmesi tamamen göz ardı edilemez iken, in situ farklılaşmış terminallerde etiketleme büyük çoğunluğu geri dönüşüm vezikül ile içselleştirme tarafından olduğu boya inkübasyon sırasında devam eden ateş ve etiketleme tersine çevrilme açıktır zar. Bu nedenle, bu basit bir teknik hali hazırda ex vivo doku mechanosensory terminal fonksiyonları bir dizi kombine elektrikli ve optik izleme için kullanılır.
En pratik tekniklerle olduğu gibi, tekrarlanabilirlik tekrarı ve pratik gerektirir. Bazı önemli noktalar değer özellikle dikkat tarif edilecektir. Diseksiyon ve kayıt oturum boyunca, hazırlık sürekli tam% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile doymuş tuz ile perfüze sağlayarak doku canlılığını ve hayatta kalma en üst düzeye çıkarmak. WH folikülleri Bu işlem sırasında yerinden değil saç sağlamakich duyusal bitiş ateş teşvik edecektir. Her iki preparasyon bir mesafede ince boru organ banyosu boyunca bir sürekli, laminer akış perfüzyon sistemine veya dikkatli bir balon gaz kullanmak ya da dikkatli bir şekilde her zaman tuzlu su yüzeyinin altında hazırlanması tutulması, çözelti 20-30 dk yenileyin. Emme kayıt elektrotları normal hücre içi kayıt için kullanılan keskin elektrot borosilikat pipetler değiştirerek yapılır. İlk olarak, dikkatli bir Bunsen beki alev çok kısa (<1 sn) maruz kalma sinirler ve yangın lehçe sığdırmak için uygun iç çapını vermek için # 3 forseps keskin ipuçları kesiyorum (2.4 ve 2.5 bakınız). kayıt iyi bir sinyal-gürültü oranı elde etmek için, bu iki elektrot elektrik empedansı (direnç) maksimum ve eşit her iki esastır. iki elektrot aşağıdaki dikkat ederek bunu yapın. kayıt elektrot için, iç çapı sinirde rahat bir uyum ve KD maksimum uzunluğu sağlamakrve kayıt elektrotu içine çekilir. etkin bir elektrot ucu mühür sinir çevreleyen bağ dokusu kullanmayı deneyin. Alternatif olarak veya ek olarak, sinir birlikte adipoz doku uygun boyutlu bir konik parçanın dar ucuna çeker. Daha sonra, boru bağlanmış bir 50 ml şırınga ile yaklaşık 1 dakika boyunca güçlü bir emme uygulanarak elektrot ucunu takın. iyi mühürlü ucu, güçlü emme uygulayarak basitçe fiş etkinliğini güçlendirecek ve daha sıvı veya sinir çekmek olmaz. sinir hasarı önlemek için, ancak, bağ dokusu çevreleyen malzeme ve EAM kıkırdak üzerinde sıkıştırma sinir yastıklama emin olun. kayıtsız elektrot mümkün olduğunca yakın kayıt elektrot direnci / empedansı taklit etmelidir. Bu dikkatle yangın parlatma aslında sızdırmazlık olmadan mümkün olduğunca küçük bir diyafram ucu ile katkıda bulunuyor. Daha fazla direnç gerekiyorsa, o zaman adipo ile kayıtsız elektrot ucunuSE bağ dokusu, kayıt elektrot için yukarıda anlatıldığı gibi.
elektroseramik hem mekansal ve zamansal olarak, mekanik deplasman üzerinde nefis kontrol sağlar. yüksek sıcaklık onları yok, çok sıcak lehim kullanmayın – Bununla birlikte, elektrik bağlantı yapmadan özen gösterin. metal yüklü epoksi yapıştırıcı kullanın veya tedarikçi tarafından tavsiye edilen bir uzman itme-fit soketi kullanın. Bu ikisi de sıkıca tutun ve elektrik bağlantı kuracak. Standart epoksi reçine ile elektroseramik cam uyarıcı prob takın. Yangın lehçe standart 10 cm uç doku hasarı riskini en aza indirmek için elektrofizyolojik kayıt için yama veya keskin elektrotları yapımında kullanılan 1,5 mm çaplı borosilikat cam kılcal boru x. tek saç folikülünün uyarılması gerekiyorsa, yangın lehçe ucu tek bir saç sığacak ve açık diyafram içinde tek saçlı prob konumuna getirin. Bu, tek bir saç üzerinde nefis kontrol sağlar. stiril dy İçine etiketleme, bu daha küçük olan hayvanlardan elde edilen dokularda genellikle daha düzgündür. Bu neden tam olarak belli değil, ama bu büyük olasılıkla genç dokulardan daha az mekanik travma ve daha etkin derin doku çıkarılmasını yansıtır. saç folikülü üsleri örten köpüklü tabaka benzeyen genişletilmiş polistiren giderilmesinde eksiksiz olması. Bu sinir pleksus tabakası ve ilgili hançer terminalleri çıkarmadan riskleri Ancak, çok dinç önlemek. az veya hiç elektrik saç folikülü hareketi tepki ve stiril boya uygulaması varsa, (turuncu / sarı) yerine hançer sonlar daha kıl şaftının tabanının farklı otofloresans ile (sarı / beyaz) yağ bezlerinin baskın etiketleme yol açar aşırı hevesli boşluk altındaki dokuları zarar verdi. Son olarak, görüntüleme önce bir boya kenetleme ajanı kullanılarak büyük ölçüde nihai görüntü görüntü kontrastım ve kalitesini arttırır.
Bu teknik bundan başka çalışmalarda, bir dizi yararlı olabilir. Bu koULD aday kanalları için seçici farmakolojik ligandlarla preparatını inkübe ya da genetik olarak silinmiş bu tür kanallar fare hatları tarama ile, germe uyarılmış tepkilerden sorumludur mechanosensory kanal (lar) için tarama, örneğin, yer alır. Ikincisi, Npy2r bağlı GFP 17, örneğin fare hatları, genetik manipülasyon terminal morfolojisinde herhangi bir değişiklik floresan değerlendirilmesi ile birleştirilebilir. Son bir örnek, SLV ciro modülatörlerinin etkisi incelenerek bu mızrak şeklinde terminallere sinaptik benzer kesecikler rolü (SLV) 7 araştıran olabilir (Ca, Mg, latrotoxin, glutamat reseptör ligandlar) esnetilebilir-uyarılmış tepkiler ve stiril boya alımı üzerindeki / release. Böylece, bu yeni tekniğin mechansensory nörobilim araştırma potansiyel olarak ilginç caddeleri bir dizi açılır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The work was in part funded by UK Medical Research Council project grant G0601253 to G.S.B. and R.W.B.
Materials
| PDMS – Sylgard 184 | Dow Corning | Flexible, inert, translucent solid silicone polymer. | |
| No. 3 Dumont forceps | Fine Science Tools | 11231-20 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Very fine pins to attach pinna preparation securely to the PDMS with minimal damage. |
| AC Differential Preamplifier | Digitimer | Neurolog NL104A | Amplifying the size of the incoming afferent electroneurogram. Differential recording minimises the extraneous electrical noise and baseline drift. |
| High/Low-pass Filter | Digitimer | Neurolog NL125 | Signal conditioning, by reducing extraneous electrical noise to ensure best signal to noise ratio. |
| Spike Trigger | Digitimer | Neurolog NL201 | Sets the event detector threshold and displays it on the oscilloscope. This shows the action potential detection efficacy. |
| Audio Amplifier & speakers | Digitimer | Neurolog NL120S | Useful audio monitoring for the presencec of electrical firing of the sensory endings while adjusting the mechanical stimulation preparation down the microscope |
| Oscilloscope | Digitimer | PM3380A | We use this old model but any standard oscilloscope will suffice. |
| Piezo electroceramic wafer | Morgan Electroceramics, Southampton UK | PZT507 | Electrophysiology/computer interface |
| Piezo electroceramic powersupply | Home made | 0-200V DC output to drive the ceramic wafer displacement, with variable electronic control of output via recording/stimulation software and computer interface. We use Spike2 software and 1401micro computer interface. | |
| Electrophysiology Software | Cambridge Electronic Design (CED) | Spike2 v7 | Electrophysiology recording, stimulation and data analysis software |
| Laboratory interface | Cambridge Electronic Design (CED) | 1401 micro | Electrophysiology interface, between the amplifier/filters and the computer. It inputs the electroneurogram and also drives the electroceramic movement. |
| FM1-43/Synaptogreen C4 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70020 | Fluorescent membrane probe that reversibly partitions into the outer leaflet of cell membranes. Used predominantly for monitoring vesicle membrane endo-/exocytosis. |
| Advasep 7 | Biotium/Cambridge Bioscience | BT70029 | A sulfonated b-cyclodextrin derivative that chelates FM1-43 (& other styryl pyridinium dyes) out of the exposed membranes, leaving internalised dye to be seen more clearly by lowering the background labelling/fluorescence. |
| Retiga Exi Fast 1394 | Qimaging | Monochrome, cooled CCD camera – basic model | |
| Volocity 3D Image Analysis Software | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | Image capture and analysis software. |
References
- Cahusac, P. M. Effects of transient receptor potential (TRP) channel agonists and antagonists on slowly adapting type II mechanoreceptors in the rat sinus hair follicle. J. Peripher. Nerv. Syst. 14 (4), 300-309 (2009).
- Fagan, B. M., Cahusac, P. M. Evidence for glutamate receptor mediated transmission at mechanoreceptors in the skin. Neuroreport. 12, 341-347 (2001).
- Price, M. P., et al. The mammalian sodium channel BNC1 is required for normal touch sensation. Nature. 407 (6807), 1007-1011 (2000).
- Ranade, S. S., et al. Piezo2 is the major transducer of mechanical forces for touch sensation in mice. Nature. 516 (7529), 121-125 (2014).
- Ebara, S., Kumamoto, K., Matsuura, T., Mazurkiewicz, J. E., Rice, F. L. Similarities and differences in the innervation of mystacial vibrissal follicle-sinus complexes in the rat and cat: a confocal microscopic study. J. Comp. Neurol. 449 (2), 103-119 (2002).
- Li, L., Ginty, D. D. The structure and organization of lanceolate mechanosensory complexes at mouse hair follicles. eLife. 3, 01901 (2014).
- Banks, R. W., et al. Glutamatergic modulation of synaptic-like vesicle recycling in mechanosensory lanceolate nerve terminals of mammalian hair follicles. J. Physiol. 591 (10), 2523-2540 (2013).
- Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
- Reid, B., Slater, C. R., Bewick, G. S. Synaptic vesicle dynamics in rat fast and slow motor nerve terminals. J. Neurosci. 19, 2511-2521 (1999).
- Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J. Neurosci. 12, 363-375 (1992).
- Meyers, J. R., et al. Lighting up the senses: FM1-43 loading of sensory cells through nonselective ion channels. J. Neurosci. 23, 4054-4065 (2003).
- Drew, L. J., Wood, J. N. FM1-43 is a permeant blocker of mechanosensitive ion channels in sensory neurons and inhibits behavioural responses to mechanical stimuli. Molecular Pain. 3 (1), 1 (2007).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. FM1-43 reveals membrane recycling in adult inner hair cells of the mammalian cochlea. J. Neurosci. 22, 3939-3952 (2002).
- Griesinger, C. B., Richards, C. D., Ashmore, J. F. Apical endocytosis in outer hair cells of the mammalian cochlea. Eur. J. Neurosci. 20 (1), 41-50 (2004).
- Bewick, G. S., Reid, B., Richardson, C., Banks, R. W. Autogenic modulation of mechanoreceptor excitability by glutamate release from synaptic-like vesicles: evidence from the rat muscle spindle primary sensory ending. J. Physiol. 562 (2), 381-394 (2005).
- Watson, S., Aryiku, C., Banks, R. W., Bewick, G. S. Comparison of gadolinium and FM1-43 as blockers of stretch-evoked firing of rat muscle spindle afferents. Proc. Phys. Soc. 21 (PC22), (2010).
- Li, L., et al. The functional organization of cutaneous low-threshold mechanosensory neurons. Cell. 147 (7), 1615-1627 (2011).
